JPH03503758A - 被包細菌 - Google Patents
被包細菌Info
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- JPH03503758A JPH03503758A JP1502168A JP50216889A JPH03503758A JP H03503758 A JPH03503758 A JP H03503758A JP 1502168 A JP1502168 A JP 1502168A JP 50216889 A JP50216889 A JP 50216889A JP H03503758 A JPH03503758 A JP H03503758A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
7、前記細菌を、集落を胞子形成のm段階で収穫して製造する特許請求の範囲第
1項記載の細菌。
8、前記ポリマーが非イオン性、ポリアニオン性或はポリカチオン性である特許
請求の範囲第1項記載の細菌。
9、前記ポリマーをデキストラン、デンプン、ゼラチン、アルギネート、カラジ
ーナン、キトサン及びポリオキシエチレンとスアミンからなる群より選ぶ特許請
求の範囲第1項記載の細菌。
10、前記ポリマーを架橋させる特許請求の範囲第1項記載の細菌。
11、前記ポリマーをホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、DMA、 DM
S、 B50COES、 DST、ポリホスフェートイオン或は金属で架橋させ
る特許請求の範囲第8項記載の細菌。
12、前記ポリマーが日光遮断用発色団、食欲刺激剤(ファゴスチミュラント)
及び虫誘引剤からなる群より選ぶ添加剤を含む特許請求の範囲第1項記載の細菌
。
13、特許請求の範囲第1項記載の細菌を含む細菌細胞の集合体。
14、直径10〜100ミクロンを有する特許請求の範囲第13項記載の集合体
。
15、直径20〜50ミクロンを有する特許請求の範囲第13項記載の集合体。
16、虫毒素をコード化する遺伝子を有する細菌を成長させて毒素を形成し、細
菌をポリマーで被包する工程を含む殺虫剤の製造方法。
17、前記細菌が胞子形成体でありかつ前記成長が細菌を胞子形成のm段階に入
らせることを含む特許請求の範囲第16項記載の方法。
18、前記被包が前記細菌の外膜な前記ポリマーで被覆することを含む特許請求
の範囲第16項記載の方法。
19、前記細菌に、虫消化管消化液をしみ通しかつ細菌を分解することができる
生物学的剤を実質的に透過させないポリマーを被覆する特許請求の範囲第16項
記載の方法。
浄書(内容に変更なし)
明 細 書
被 包 細 菌
庄」
を形成する過程の間に、バラスポーラル(paraspora l)を吉晶とし
て知られている細胞内殺虫性毒素を形成する。この毒素を蚊のような虫が吸い、
毒素は虫の消化管のアルカリ性内容物によって分解され1.消化管の崩壊を引き
起こして虫を殺す、虫毒素は一般に、BTIを発酵させて細胞マスを形成し、こ
れらの細胞の胞子形成を誘発し、毒素生成及び胞子形成を行わせ、次いで母細胞
の溶解を行わせて胞子及びパラスポーラル結晶を培地に放出させることによって
製造する。結晶及び付随する胞子な次し)で収穫し、殺虫剤を配合して容器に入
れる。この殺虫剤を部位の上にまく0例えば下記を参照: 5ubba [Ed
、]0xford IBH(1982)、^dvances in Agric
ulturalMicrobiology、 397 Jj以降、Ch、15.
アイザワ、、Micr’obial Control of In5ect P
e5ts” ; Lacey等、J、 Am、 Mo5q、 Control、
Ass、 lの Abstraot: 493〜497頁(1985);
Novak等、J、’ Am、 Control Ass、 1のAbstra
ct; 449〜453頁(1985)。
1豆立11
発明は、第一の態様では、殺虫性毒素を含有する細菌を特徴とし、細菌を、目標
とする虫の消化性酵素を高いアルカリ性pH(例えば、9.0より高いpH)に
おいて透過させる非リビング樹脂状保護材料で被包する。被包とはポリマー材料
で完全に囲み、こうして環境で経験するpHレベル(例えば、8.5より低いp
H)において、熱、湿気及び溶液、例えば雨水から生成される炭酸を含む環境要
因から保護することを意味する。「保護」とは、材料が被包細菌の崩壊を、使用
する農業環境において経験する条件下で有意に遅延させることを意味する。
好ましい実施態様では、毒素はバラスポーラル結晶毒素であり、細菌はBaci
llus thurin 1ensisであり;ポリマーは農業環境において、
例えば土壌中或は植物の葉の上で安定であり:特に、ポリマーは熱安定性であり
(少なくとも約120下(49℃)まで)かつ水(8,5より低いpH) 、紫
外線及び農業環境において経験する他の条件によって急速に劣化されない。その
上、ポリマーは胞子嚢を微生物或は酵素崩壊のような他の環境崩壊に対して保護
する。ポリマーは、胞子嚢を溶解する主情化管液(例えば、pH10より高い)
によって容易に透過されるならば、虫消化管において有意に分解される必要はな
い、ポリマーはそれらの条件下で毒素を透過して毒素を虫消化管に放出すべきで
ある。毒素は細菌を胞子形成のm段階に成長させて産生される。ポリマーは非イ
オン性、ポリアニオン性或はポリカチオン性にすることができる。適した非イオ
ン性ポリマーはデキストラン、デンプン或はゼラチンであり、適したポリアニオ
ン性ポリマーはアルギネート或はカラジーナンであり、適したポリカチオン性ポ
リマーはキトサン或はポリオキシエチレンビスアミンである。他の好ましいポリ
マー特性は下記の通りである:(a)ポリマーが最も好ましくは下記で架橋され
る:ホルムアルデヒド;グルタルアルデヒド: DMA (Waterman等
(+975) Biochem、 Biphys。
Res、 Commun、63巻、580〜587頁に開示されている通りのジ
メチルアジビミデート28CI) ; DMS(Packman等(1982
) Biochemistry 21巻、5171〜5175頁に開示されてい
る通りのジメチルスペルイミデート 28CI); B50COES(Zarl
ing等(1980)、J、 Immunol、 124巻、 913〜92
0頁に開示されている通りのビス[2−(スクシンイミド−オキシカルボニルオ
キシ)エチル]スルホン):DST(Bragg等(1980)、Eur、 J
、 Biochem、、 106巻、495〜503頁に開示されている通りの
ジスクシンイミジルタータレート);スルホ−BSOCOES (Zarlin
g等);スルホ−DST(Bragg等);ポリホスフェートイオン:或は金属
イオン(例えば、Ca ”″)及び(b)ポリマーは添加剤、例えば日光遮断用
発色団、風味剤、或は誘引剤、例えばフェロモンを含有する。
発明は、第二の態様では、上述した細菌を含有する細菌細胞の集合体を特徴とす
る。集合体は直径10〜100ミクロンを有するのが好ましく、20〜50ミク
ロンを有するのが最も好ましい。
発明は、第三の態様では、被包殺虫剤の製造方法を特徴とする。その方法は虫毒
素についてコード化する遺伝子を有する細菌を成長させて殺虫剤を生成しかつ細
菌をポリマーで被包することを含む。
好ましい実施態様では、細菌は胞子形成体であり、細菌を胞子形成の■段階に成
長させ、被包は細菌の外膜な被覆することを含む。
発明は微生物細胞壁の特性を利用してセルラーポリマを引き寄せ、こうして被包
させる。これらの被包製剤を化学架橋によって安定にすることが、虫を防除する
のに適した極めて安定な生成物を生じ、かつ公衆衛生及び農業の両方について重
要である。好ましい態様では、毒素は胃毒素であり、マイクロ被包は標的虫が摂
取するのを増進させ、かつまた標的虫の消化管のアルカリ性媒質内で働く消化酵
素による毒素の放出及び活性化を可能にする。特に好ましい実施態様では、例え
ばBacillusthurin 1ensisを使用し、プロセスは細胞を完
全な胞子嚢として保つ。
被包毒素は現場条件下で極めて安定であり、これより従来の殺虫剤に比べて適用
する頻度が少な(ですみ、使用の費用を低減させる。更に、これらの殺虫剤の製
造方法は比較的に安価である。毒素が細菌内に残るのが好ましいので、発酵プロ
セスが短縮される0例えば、胞子形成細菌は、産生を完了するまで、すなわち胞
子形成の■段階まで成長させる必要があるだけである。この点で、細胞に直接被
包用ポリマーを被覆し、この状態で販売し、頒布し、農業生成物に適用すること
ができる。被包毒素は天然及びシミュレーテッド現場条件下で非被包毒素に比べ
て相当に長い半減期を有する。更に、細胞はポリマーを架橋することによって集
合させることができるので、集合体の直径は標的虫の摂取要件が最適になるよう
に選ぶことができる0例えば、蚊(それらの内のいくつかは濾過摂食体(フィル
ターフィーダー)である)に関し、粒子の直径が25〜100ミクロンの場合に
、毒性の増大が観測され、一層小さい幼虫については、10〜20ミクロンの大
きさが一層良好である。
本発明の付加された特徴は日光遮断用発色団食品添加剤、染料及びフェロモンを
ポリマーに加入する機会及び能力である。発色団は被包毒素をUV照射から保護
し、こうしてその安定性を高める0食品添加剤及びフェロモンは、虫が毒素を食
べる機会を高める。
発明の他の特徴及び利点は下記の好ましい実施態様の記載及び請求の範囲の記載
から明らかになるものと思う。
女ましい 、 の6
本発明において適した毒素は殺虫性毒素を含む。適した毒素は一般に用いられて
いるものを含み、通常の使用の農業環境において不安定な場合がいくつかある。
これらの毒素はBTI或はB、 thur 1ensis entomotsi
desのパラスポーラル結晶毒素及び関連するかかる毒素を含む、一般的には上
記のアイザヮの400頁を参照、毒素は普通に用いられている手順によって作っ
てもよく或は下記に記載するような改正手順によって作ってもよい。
毒素は、また、McLean及びWhitely、 J、 Bacteriol
。
169 (3) 、 +017−1023頁(1987年)及びWard等、J
、 Mol。
Biol、 191.13〜22頁(1986年)が開示する通りの標準技法を
用いて、毒素コード化遺伝子をE、 Co11或はB、 5ubtilisのよ
うな他の細菌内で発現させることによって作ってもよい、毒素は被包プロセスの
間、これらの細菌内に残存するのが好ましい。
11皿ヱユ1=
上記の毒素を被包するのに適したポリマーは種々の非イオン性、ボッアニオン性
及びポリカチオン性ポリマーを含む、このようなポリマーの例はデキストラン、
例えばデンプン、タンパク質、例λばゼラチン、アルギネート或はカロジーナン
、キトサン及びポリオキシエチレンとスアミンである。これらのポリマーは広く
生物分解性のバイオポリマーであるのが普通であるが、広範囲の通常の農業タイ
プの条件に十分に耐えて毒素をそれが摂取される期間の間保護し、適用の間の時
間を実質的に短縮させるのが好ましい、ポリマーは胞子嚢の細菌或は酵素分解に
対して保護する。ポリマーは虫の消化管におけるようなアルカリ性条件及び消化
酵素を極めてしみ通しくporous)かつこれらに接近し得る。
例
本例では、BTIのバラスポーラル結晶毒素を含有する胞子嚢を種々の被包用ポ
リマーの内の1種によって被包する。
本例は発明を限定するものでなく、当業者ならば本例において上述した毒素及び
被包用ポリマーを代えて用い得ることを了解するものと思う。
バッフル式シェーカーフラスコを1100rpで使用して、BTIの細胞を液内
培養で32℃において約12〜18時間成長させる。別に、細胞を発酵装置にお
いて、媒質1容積当り空気0.8容積を用いて、細胞が胞子形成の■段階に達す
るまで成長させる。この段階は、標準手順によって、例えば顕微鏡により、或は
細菌の代謝出熱によって求める。5!酵のこの段階で、温度を32℃から22℃
に下げ、或は硫酸を加えてpHを7から6に下げる。これらの環境変化は細菌の
溶解を24時間より長くおくらせるのを助ける。この遅延は細菌の被包を、毒素
結晶を胞子形成母細胞或は胞子嚢から放出させないで、進行させる。
胞子嚢を下記する3つのタイプのポリマーの内の1つで被包する。(細胞は、こ
のプロセスの前に、単に細胞を沈降させかつ沈殿より上に残る液体の約80%を
デカントして濃縮してもよい、別法として、細胞を懸濁状態のままにしてもよい
、)
a)可溶性デンプンのような非イオン性ポリマーを培地に加えた後に、エタノー
ル或はアセトンのような有機溶媒を容積の5o%まで加える。これらの溶媒はコ
アセルベーティング剤として作用し、被覆された細胞を培地から沈殿させる0通
常、デンプンの添加量は媒質中の細胞の量にほぼ等しく、その濃度は約0.5〜
5重量%である。ポリマーは、また、急速温度シフトによって溶媒から沈殿させ
ることができる。
b)キトサンのようなポリカチオン性ポリマーを(約0.4〜4重量%で)媒質
に加える。キトサンを酢酸(0,2〜0.5M)で酸性にしてpHを約5より低
くしておく、負に荷電した胞子嚢壁は可溶性ポリマーを引き寄せる。次いで、ポ
リマーをポリホスフェートイオン(0,1〜0.2M)で安定にする。
C)アルギネートのようなアニオン性ポリマーを(約0.4〜4重量%で)媒質
に加える。これらのポリマーは細胞に引き寄せられる1次いで、カルシウム塩(
0゜1〜0.2M)を加えてポリマーを架橋させ、多層のポリマーを有する細胞
を生じる。
染料或は U、V、遮断化合物、例えばバラアミノ安、ワ、香酸のような着色誘
引剤をこの段階で加える。
コーティングプロセスは数分かかるにすぎないが、混合物を1〜2時間放置する
のがよい。被覆胞子嚢を添加剤と共に、今、化学的に架橋させて最終生成物を安
定にする。架橋用物質(約0.1〜0.01重量%)は、アルデヒド、例えばホ
ルムアルデヒド或はグルタルアルデヒド、二官能価アミドエステル、例えばDM
A或はDMS、二官能価N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えばB50
COES或は DST及びその他Pierce)1andbook 及びCa
talog (1986−7,311〜340頁)に挙げられているものが適し
ている。最も適しているかかる架橋剤は塩基可逆性であり、これより標的虫の消
化管内で開裂される0例えば、上に挙げた2arling等を参照。これらの架
橋用物質はこのようにして消化管内での毒素の放出を高め、終局的に毒素を活性
化させることを可能にする。
最終生成物は胞子嚢を架橋ポリマーで被包させてなり、エマルションとしてスプ
レー乾燥或は販売し、直接標的植物に適用することができる。スプレー乾燥は、
アトマイザ−を使用し、混合物を適当な通りにカルシウム或はポリホスフェート
溶液にスプレーする標準手順によって行う、別法として、混合物を、安息香酸或
はソルビン酸を加えて保存することができ、これらの酸は食品防腐剤として01
%で用いるのが普通である。このような溶液及び乾燥生成物は数カ月及び数年の
間でさえ安定である。それらは標準技法によって植物及び現場に適用するが、適
用頻度は少なくてすむことから、殺虫剤の使用量は従来の配合物よりも少ない。
他の実施態様は下記の請求の範囲内である。
手続補正書(放)
事件の表示 平成1年特許願第502168号発明の名称 被包細菌
補正をする者
事件との関係 特許出願人名 称 プレジデント アンド
フェロウズ オブハーバード カレッジ
住 所 東京都中央区日本橋3丁目13番11号住所 同上 /
)
補正命令通知の日付 平成3年4月16日補正の対象
特許法第184条の5第1項の規定による書面の
Claims (19)
- 1.アルカリ性の高いpHにおいて虫消化性酵素を透過させる非リビング、樹脂 状、保護ポリマー材料によって被包された、殺虫性毒素を含む被包細菌。
- 2.前記毒素がバラスボーラル結晶毒素である特許請求の範囲第1項記載の細菌 。
- 3.前記細菌がBacillusthuringiensisの胞子■である特 許請求の範囲第2項記載の細菌。
- 4.前記ポリマーが農業環境において安定である特許請求の範囲第1項記載の細 菌。
- 5.前記ポリマーが虫消化管消化液をしみ通す特許請求の範囲第1項記載の細菌 。
- 6.前記ポリマーが前記細菌を分解することができる生物剤を実質的に透過させ ない特許請求の範囲第1項記載の細菌。
- 7.前記細菌を、集落を胞子形成のIII段階で収穫して製造する特許請求の範 囲第1項記載の細菌。
- 8.前記ポリマーが非イオン性、ポリアニオン性或はポリカチオン性である特許 請求の範囲第1項記載の細菌。
- 9.前記ポリマーをデキストラン、デンプン、ゼラチン、アルギネート、カラジ ーナン、キトサン及びポリオキシエチレンビスアミンからなる群より選ぶ特許請 求の範囲第1項記載の細菌。
- 10.前記ポリマーを蚊架橋させる特許請求の範囲第1項記載の細菌。
- 11.前記ポリマーをホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、DMA、DMS 、BSOCOES、DST、ポリホスフェートイオン或は金属で架橋させる特許 請求の範囲第8項記載の細菌。
- 12.前記ポリマーが日光遮断用発色団、食欲刺激剤(ファゴスチミュラント) 及び虫誘引剤からなる群より選ぶ添加剤を含む特許請求の範囲第1項記載の細菌 。
- 13.特許請求の範囲第1項記載の細菌を含む細菌細胞の集合体。
- 14.直径10〜100ミクロンを有する特許請求の範囲第13項記載の集合体 。
- 15.直径20〜50ミクロンを有する特許請求の範囲第13項記載の集合体。
- 16.虫毒素をコード化する遺伝子を有する細菌を成長させて毒素を形成し、細 菌をポリマーで被包する工程を含む殺虫剤の製造方法。
- 17.前記細菌が胞子形成体でありかつ前記成長が細菌を胞子形成のIII段階 に入らせることを含む特許請求の範囲第16項記載の方法。
- 18.前記被包が前記細菌の外膜を前記ポリマーで被覆することを含む特許請求 の範囲第16項記載の方法。
- 19.前記細菌に、虫消化管消化液をしみ通しかつ細菌を分解することができる 生物学的剤を実質的に透過させないポリマーを被覆する特許請求の範囲第16項 記載の方法。
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