DE68915159T2

DE68915159T2 - Eingekapselte bakterie.

Info

Publication number: DE68915159T2
Application number: DE68915159T
Authority: DE
Inventors: Joseph Perrone; Andrew Spielman; Eliezer Zomer
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 1988-02-12
Filing date: 1989-02-10
Publication date: 1994-08-18
Anticipated expiration: 2009-02-11
Also published as: AU631359B2; BR8907243A; CA1340319C; IL89243A; WO1989007447A1; DE68915159D1; EP0401249A4; CN1036226A; EP0401249B1; JPH03503758A; AU3049089A; KR900700120A; EP0401249A1; IL89243A0

Description

Bacillus thuringiensis israelensis (BTI) erzeugt während des Sporenbildungsprozesses ein intrazelluläres Insektengift, bekannt als parasporales Kristall. Dieses Toxin wird von Insekten, wie Stechmücken, aufgenommen und durch den alkalischen Inhalt im Insektendarm aufgebrochen, wo es eine Zerstörung des Darmes verursacht und damit das Insekt tötet. Das Insektentoxin wird üblicherweise hergestellt, indem BTI fermentiert wird, um eine Zellmasse zu bilden, die Sporulation dieser Zellen eingeleitet wird, die Toxinproduktion und Sporenbildung ermöglicht wird und sodann die Lyse der Mutterzellen ermöglicht wird, um die Sporen und das parasporale Kristall in das Kulturmedium freizugeben. Die Kristalle und die zugehörigen Sporen werden dann geerntet, das Insektizid formuliert und verpackt. Das Insektizid wird an der Einsatzstelle verteilt. Siehe beispielsweise Aizawa "Microbial Control of Insect Pests", Ch. 15 in Advances in Agricultural Microbiology, Seiten 397 ff., Subba (Ed.) Oxford IBH (1982); Zusammenfassung von Lacey et al. in J. Am. Mosq. Control. Ass. 1: Seiten 493-497 (1985); Zusammenfassung von Novak et al. J. Am. Control Ass. 1: Seiten 449-453 (1985).
Gemäß einem ersten Aspekt zielt die Erfindung auf ein ein Insektengift enthaltendes Bakterium, wobei das Bakterium in einem nicht-lebenden, harzartigen Schutzmaterial eingekapselt ist, das von den Verdauungsenzymen des Zielinsekts bei hohen alkalischen pH-Werten (beispielsweise ein pH-Wert von über 9,0) durchdringbar ist. Eingekapselt bedeutet in diesem Zusammenhang eine vollständige Umhüllung durch das polymere Material und somit bei den in der Umgebung auftretenden pH-Werten (beispielsweise pH- Werte unter 8,5) einen Schutz gegen Umwelteinflüsse wie Hitze, Feuchtigkeit und Lösungsmitteln, wie aus Regenwasser gebildeter Kohlensäure. "Schutz" meint, daß das Material deutlich unter den Bedingungen, die beim Einsatz in landwirtschaftlicher Umgebung auftreten, den Abbau des eingekapselten Bakteriums verzögert.
Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen ist das Toxin parasporales Kristalltoxin und das Bakterium ist Bacillus thuringiensis; das Polymer ist in landwirtschaftlicher Umgebung, beispielsweise in Erde oder auf Blättern von Pflanzen stabil; insbesondere ist das Polymer wärmestabil (bis zu wenigstens etwa 49º C/120º F) und es wird nicht schnell durch Wasser (bei einem pH-Wert unter 8,5), Ultraviolettstrahlung und anderen Bedingungen abgebaut, die in landwirtschaftlicher Umgebung auftreten. Darüber hinaus schützt das polymer die Sporen gegen andere umgebungsbedingte Zerstörung, wie mikrobiellen oder enzymatischen Abbau. Das Polymer braucht in dem Insektendarm nicht nennenswert aufgelöst zu werden, solange es durch die Darmflüssigkeit des Insekts (beispielsweise oberhalb eines pH-Wertes von 10) leicht durchdringbar ist, die die Sporen auflöst. Das Polymer sollte unter diesen Bedingungen für das Toxin durchlässig sein, damit es in den Insektendarm austreten kann. Das Toxin wird erzeugt, indem das Bakterium bis Stufe III der Sporulation wächst. Das polymer kann nicht-ionisch, polyanionisch oder polykationisch sein. Ein geeignetes, nicht-ionisches Polymer ist Dextran, Stärke oder Gelatine; ein geeignetes polyanionisches Polymer ist Alginat oder Carageenan und ein geeignetes polykationisches Polymer ist Chitosan oder Polyoxiethylenbisamin. Andere bevorzugte Polymereigenschaften sind: (a) das Polymer ist kreuzvernetzt, insbesondere vorzugsweise mit Formaldehyd; Glutaraldehyd; DMA (Dimethyladipimidat 2HCl, wie von Waterman et al. beschrieben in (1975) Biochem. Biphys. Res. Commun. 63: Seiten 580-587); DMS (Dimethylsuberimidat 2HCl, wie beschrieben von Packman et al in (1982) Biochemistry 21: Seiten 5171-5175);BSOCOES (bis 2- (succinimido-Oxycarbonyloxy)Ethyl Sulfon, wie von Zarling et al. in (1980) J. Immunol. 124: Seiten 913-920 beschrieben);DST (Disuccinimidyltartarat, wie von Bragg et al. in (1980) Eur. J. Biochem. 106: Seiten 495-503) beschrieben);Sulfo-BSOCOES (Zarling et al.); Sulfo-DST (Bragg et al.); Polyphosphationen; oder Metallionen (beispielsweise Ca²&spplus;); und (b) das Polymer enthält ein Additiv, beispielsweise einen sonnenschützenden Chromophor, einen Geschmacksstoff oder einen Lockstoff, wie Pheromon.
Gemäß einem zweiten Aspekt zielt die Erfindung auf ein Aggregat von Bakterienzellen, das das oben beschriebene Bakterium enthält. Vorzugsweise hat das Aggregat einen Durchmesser von 10 bis 100 µm, ganz besonders bevorzugt von 20-50 µm.
Gemäß dem dritten Askpekt betrifft die Erfindung ein Verfahren eines eingekapselten Insektizids. Das Verfahren umfaßt es, ein Bakterium wachsen zu lassen, das ein Gen enthält, das für ein Insektentoxin codiert, um das Insektizid zu erzeugen, und es umfaßt das Einkapseln des Bakteriums in einem Polymer.
Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen läßt man das Bakterium bis Stufe III der Sporulation wachsen; das Einkapseln beinhaltet das Beschichten der äußeren Membran des Bakteriums.
Die Erfindung nutzt die Eigenschaften der mikrombiellen Zellwände, zelluläre Polymere anzuziehen und sie somit einzukapseln. Die Stabilisierung dieser eingekapselten Zubereitungen durch chemische Kreüzvernetzung erzeugt ein sehr stabiles Produkt, das zur Regulierung von Insekten geeignet ist und sowohl für die öffentliche Gesundheit als auch für die Landwirtschaft wichtig ist. Gemäß bevorzugter Aspekte ist das Gift ein Verdauungsgift, steigert die Mikroverkapselung die Verdauung durch das Zielinsekt und gestattet die Freisetzung sowie Aktivierung des Toxins durch die Verdauungsenzyme, die in dem alkalischen Medium des Darms des Zielinsektes wirksam sind. Bei einem speziell bevorzugten Ausführungsbeispiel unter Verwendung beispielsweise von Bacillus thuringiensis erhält das Verfahren die Zellen als intaktes Sporangium.
Die verkapselten Toxine sind unter Feldbedingungen sehr stabil und müssen weniger häufig angewendet werden als frühere Insektizide, was die Kosten bei der Verwendung reduziert. Ferner ist der Herstellungsprozeß für diese Insektizide verhältnismäßig billig. Da es bevorzugt wird, daß das Toxin innerhalb eines Bakteriums bleibt, wird der Fermentationsprozeß abgekürzt. Beispielsweise braucht das sporulierende Bakterium nur solange wachsen, bis die Produktion abgeschlossen ist, d.h. bis zu Stufe III der Sporulation. An dieser Stelle werden die Zellen unmittelbar mit dem einkapselnden Polymer beschichtet und können verkauft, verteilt und in diesem Zustand auf landwirtschaftlichen Produktenangewendet werden. Das verkapselte Toxin hat unter natürlichen und simulierten Feldbedingungen eine deutlich längere Halbwertszeit, verglichen mit dem unverkapselten Toxin. Da außerdem die Zellen durch Kreuzvernetzen des Polymers Aggregate bilden, kann der Durchmesser des Aggregats so gewählt werden, daß er für Nahrungszwecke des Zielinsekts optimal ist. Beispielsweise bei Stechmücken (einige von ihnen sind Filtersauger) wird eine erhöhte Toxizität beobachtet, wenn die Partikel einen Durchmesser zwischen 25-100 µm haben, während für kleinere Larven- eine Größe zwischen 10-20 µm besser ist.
Ein weiteres Merkmal dieser Erfindung ist die Möglichkeit und Fähigkeit, daß in dem Polymer sonnenschützende Chromophore, Nahrungszusätze, Farbstoffe und Pheromone einzubauen sind. Die Chromophoren schützen das verkapselte Toxin gegen UV-Bestrahlung und erhöhen somit seine Stabilität. Die Nahrungszusätze und Phermomone erhöhen die Wahrscheinlichkeit, daß das Insekt das Toxin zu sich nimmt.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele und der Patentansprüche.

Toxine

Toxine, die für die Erfindung geeignet sind, umfassen Insektentoxine. Geeignete Toxine sind jene, die üblicherweise verwendet werden und in einigen Fällen sind sie unter den normalen landwirtschaftlichen Einsatzbedingungen instabil. Diese Toxine sind das parasporale Kristalltoxin von BTI oder B. thurgiensis entomotsides sowie verwandte Toxine. Siehe hierzu im wesentlichen der oben erwähnte Aizawa auf Seite 400. Die Toxine können durch die üblicherweise verwendeten Verfahren oder ein modifiziertes Verfahren erzeugt werden, wie es unten beschrieben ist. Die Toxine können auch durch Expression von Toxin-codierenden Genen in anderen Zellen, wie E. coli oder B. subtilis, hergestellt werden, wobei Standardtechniken verwendet werden, wie sie von McLean und Whitely, J. Bacteriol. 169(3): Seiten 1017-1023 (1987); und von Ward et al., in J. Mol. Biol. 191: Seiten 13-22 (1986) beschrieben sind. Vorzugsweise bleiben die Toxine in diesen Bakterien während des Einkapselungsverfahrens.

Einkapselndes Polymer

Zum Einkapseln der obigen Toxine geeignete Polymere umfassen eine Vielzahl nicht-ionischer, polyanionischer und polykationischer Polymere. Beispiele für solche Polymere sind Dextrane wie Stärken, Proteine wie Gelatine, Alginat oder Carogeenan und Chitosan sowie Polyoxiethylenbisamin. Diese Polymere sind im wesentlichen Biopolymere, die weitgehend biologisch abbaubar sind; jedoch sind sie vorzugsweise ausreichend resistent gegenüber eine großen Vielzahl normaler Bedingungen, wie sie in der Landwirtschaft auftreten, um das Toxin eine Zeit lang zu schützen, die ausreicht, daß es in den Verdauungskanal aufgenommen wird,und es vermindert wesentlich die Zeit zwischen den Ausbringungen. Das Polymer schützt gegen bakteriellen oder enzymatischen Abbau der Sporangien. Die Polymere sind porös und für die alkalischen Bedingungen sowie die Verdauungsenzyme, wie sie in dem Darm eines Insekts vorhanden sind, zugänglich.

Beispiel

Bei diesem Beispiel sind die das parasporale Kristalltoxin von BTI enthaltenden Sporangien mit einem aus einer Vielzahl verkapselnder Polymere eingekapselt.
Dieses Beispiel beschränkt nicht die Erfindung; die Fachleute sehen, daß die oben beschriebenen Toxine und einkapselnden Polymere bei diesem Beispiel ausgetauscht werden können.
In einer untergetauchten Kultur läßt man Zellen von BTI etwa 12-18 Stunden bei 32º C wachsen, wobei mit Pralleinrichtungen versehene Schüttelflaschen bei 100 U/min verwendet werden. Alternativ läßt man die Zellen in einem Fermenter mit 0,8 Volumenteilen Luft pro Volumenteil Medium wachsen, bis sie Phase III der Sporulation errechen. Diese Stufe wird durch Standardverfahren erfaßt, beispielsweise mikroskopisch oder durch Überwachung der metabolischen Wärmeabgabe der Baktierien. Auf dieser Fermentationsstufe wird die Temperatur von 32º C auf 22º C vermindert oder der pH-Wert von 7 auf 6 durch Zugabe von Schwefelsäure abgesenkt. Diese Änderungen der Umgebungsbedingungen helfen, die Lyse des Bakteriums um mehr als 24 Stunden zu verzögern. Diese Verzögerung gestattet es, mit der Einkapeslung der Bakterien fortzufahren, ohne daß die Toxinkristalle aus den sporulierenden Mutterzellen oder Sporangien freigesetzt werden.
Die Sporangien werden in einem der drei oben beschriebenen Typen von Polymeren eingekapselt (die Zellen müssen vor diesem Verfahrensschritt konzentriert werden, indem man sie einfach sich absetzen läßt und etwa 80% der über dem Präzipitat bleibenden Flüssigkeit dekantiert. Alternativ können die Zellen auch in Suspension bleiben).
a) Ein nicht-ionisches Polymer, wie lösliche Stärke, wird zu dem Kulturmedium hinzugegeben, gefolgt von einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol oder Aceton bis zu 50 Vol.-%. Diese Lösungsmittel wirken als Koacervationsmittel und führen dazu, daß die beschichteten Zellen aus dem Kulturmedium präzipitieren. Im allgemeinen ist die Menge an zugegebener Stärke etwa gleich der Menge an Zellen in dem Medium und die Konzentration liegt etwa bei 0,5 bis 5 Gewichtsprozent. Das Polymer kann auch durch schnelle Temperaturänderung aus dem Lösungsmittel präzipitieren.
b) Ein polykationisches Polymer, wie Chitosan, wird zu dem Medium hinzugegeben (etwa 0,4-4 Gewichtsprozent). Das Chitosan wurde mit Essigsäure (0,2-0,5 M) auf einen pH-Wert niedriger als etwa 5 angesäuert. Die negativ geladenen Sporangienwände ziehen das lösliche Polymer an. Die Polymere werden dann mit Phosphationen (0,1-0,2 M) stabilisiert.
c) Ein anionisches Polymer, wie Alginat, wird zu dem Medium (bis zu etwa 0,4-4 Gewichtsprozent) hinzugegeben. Diese Polymere werden von den Zellen angezogen. Kalziumsalze (0,1-0,2 M) werden sodann hinzugefügt, um das Polymer kreuzzuvernetzen und Zellen zu erzeugen, die mehrere Polymerschichten tragen.
In dieser Stufe werden Farblockstoffe, wie Farbstoffe oder UV-Licht filternde Verbindungen, beispielsweise Paraaminobenzoesäure, hinzugegeben.
Der Beschichtungsprozeß dauert nur wenige Minuten, aber die Mischung kann 1-2 Stunden stehen gelassen werden. Die beschichteten Sporangien werden nun zusammen mit den Additiven chemisch kreuzvernetzt, um das endgültige Produkt zu stabilisieren. Kreuzvernetzende Substanzen (bis zu etwa 0,1-0,01 Gewichtsprozent), wie Aldehyde, beispielsweise Formaldehyd oder Glutaraddehyd, bifunktionale Amidoester, wie DMA oder DMS, bifunktionale N-Hydroxysuccinimidester, wie BSOCOES oder DST, und andere in dem "Pierce Handbook and Catalog" (1986-7, Seiten 311- 340) aufgeführte sind geeignet. Die am besten geeigneten derartigen Kreuzvernetzungswirkstoffe sind basisch reversibel und werden somit in dem Darm des Zielinsekts gespalten. Siehe Zarling et al. am angegebenen Ort. Diese kreuzvernetzenden Substanzen ermöglichen somit eine vermehrte Freigabe des Toxins in dem Darm und eine schlußendliche Aktivierung des Toxins.
Das Endprodukt besteht aus einem Sporangium, das durch ein kreuzvernetztes Polymer eingekapselt ist und kann sprühgetrocknet oder als Emulsion verkauft und unmittelbar an den Zielpflanzen angewendet werden. Das Sprühtrocknen wird durch Standardverfahren unter Verwendung eines Zerstäubers durchgeführt werden, indem die Mischung in eine Kalzium oder Polyphosphatlösung gesprüht wird, je nachdem, was geeignet ist. Alternativ kann die Mischung durch Zugabe von Benzoesäure oder Sorbinsäure präserviert werden, die üblicherweise als Nahrungskonservierungsmittel in einer Menge von 0,1 % allgemein verwendet werden. Diese Lösungen und die getrockneten Produkte sind mehrere Monate und sogar Jahre stabil. Sie werden unter Verwendung von Standardtechniken auf den Pflanzen und Feldern verteilt, wobei jedoch die Menge an verwendetem Insektizid kleiner ist als bei den früheren Formulierungen, weshalb eine weniger häufige Anwendung erforderlich ist.

Claims

1. Population von eingekapselten Bakterien, die ein Insektengift enthalten und die durch ein nicht lebendes, harzartiges, schützendes und nicht-ionisches oder poly-anionisches oder poly-kationisches Polymer eingekapselt sind das für Verdauungsenzyme von Insekten bei alkalischen pH-Werten, die im Insektendarm auftreten, durchläßig ist, wobei die Bakterien Sporangien sind.

2. Bakterien nach Anspruch 1, wobei das Toxin ein parasporales kristallines Toxin ist.

3. Bakterien nach Aspruch 2 wobei das Bakterium Bacillus thuringiensis ist.

4. Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polymer in Erde oder auf Blättern stabil ist.

5. Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polymer für Verdauungssäfte des Insektendarms porös ist.

6. Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polymer für biologische Agenzien, die in der Lage sind, das Bakterium zu beeinträchtigen, im wesentlichen undurchlässig ist.

7. Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Bakterium durch Ernten einer Kolonie in Stufe III der Sporulation erzeugt wird.

8. Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Polymer aus der Gruppe ausgewählt wird, die Dextran, Stärke, Gelatine, Alginat, Carrageenan Chitosan und Polyoxiethylenbisamin umfaßt.

9. Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Polymer kreuzvernetzt ist.

10. Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Polymer mit Formaldehyd Glutaraldehyd DMA, DMS, BSOCOES, DST, polyphosphat-Ionen oder Metallen kreuzvernetzt ist.

11. Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Polymer ein Additiv enthalt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die Sonnenlicht abschirmende Chromophoren, Phagostimulanzien und Insektenlockstoffen umfaßt.

12. Aggregat von eingekapselten Bakterienzellen, welches die Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthält.

13. Aggregat nach Anspruch 12, das einen Durchmesser von 10 bis 100 µm aufweist.

14. Aggregat nach Anspruch 12, das einen Durchmesser von 20 bis 50 µm aufweist.

15. Verfahren, um ein Insektizid zu produzieren, das die Schritte umfaßt: Wachsenlassen einer Population von bakteriellen Sporangien, wobei die Bakterien ein Gen aufweisen, das für ein Insektengift codiert, um das Toxin zu bilden, und Einkapselung der Bakterien in ein nicht-ionisches poly-anionisches oder poly-kationisches Polymer.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Wachsenlassen beinhaltet, die Bakterien in Stufe III der Sporulation eintreten zu lassen.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Einkapselung die Beschichtung der außeren Membran der Bakterien mit dem Polymer umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Bakterien mit einem Polymer beschichtet sind, das für Verdauungssäfte des Insektendarms porös ist und das für biologische Agenzien, die in der Lage sind, die Bakterien zu beeinträchtigen undurchlässig ist.