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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Bioinsektizid-Trockenformulierung,
bestehend aus der Biomasse und Endotoxinen von Bacillus thuringiensis
var. israelensis, die eine praktische, ökonomische und wirksame larvizide
Aktivität
bzw. Wirksamkeit gegen zweiflügelige
Insekten bereitstellt. Dieses Produkt hat eine gute Lagerfähigkeit,
wenn es gelagert wird, und es enthält ökologisch sichere Additivmittel,
während
die wirksame Komponente in Mengen vorhanden ist, die stark genug
sind, um eine larvizide Aktivität
hervorzurufen.
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Im
Allgemeinen schließt
die Vernichtung von Insekten, insbesondere von jenen, die für Landwirtschaft, Forstwirtschaft
und öffentliche
Gesundheit schädlich
sind, die Verwendung von chemischen Insektiziden ein. Jedoch gibt
es viele Nachteile, die mit der Verwendung dieser Art von Produkt
verbunden sind.
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Chemische
Insektizide haben ein breites Wirkungsspektrum, wobei sie nicht
nur für
Zielinsekten tödlich
sind, sondern auch für
jene, die einen bestimmten Nutzen für Landwirtschaft, Forstwirtschaft
und öffentliche
Gesundheit darstellen. Zusätzlich
sind solche Insektizide nicht nur für Tiere sondern auch für den Menschen
recht oft toxisch und können
auch die Umwelt verschmutzen. Zusätzlich entwickeln Insekten
nach wiederholten Anwendungen chemischer Insektizide häufig eine
organische Resistenz („organic
resistance"), was die
Vernichtung schwierig macht.
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Die
Verwendung von Bioinsektiziden ist gut bekannt. Bioinsektizide nützen natürliche pathogene
Mittel oder Wirkstoffe, die durch diese pathogenen Mittel erzeugt
werden, um Insekten in einer sehr viel wirksameren und selektiveren
Weise als chemische Insektizide zu bekämpfen, und sie haben ein engeres
Wirkungsspektrum, wobei sie nur Zielinsekten töten. Sie wer den auch natürlich abgebaut
und sind daher nicht so schädlich für die Umwelt.
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Ein
verbreitet eingesetztes Bioinsektizid in der biologischen Kontrolle
von Insekten, die Krankheiten hervorrufen, wird aus Bacillus thuringiensis
(Bt) hergestellt. Bt ist ein mobiles, gram-positives Bakterium,
das in der Natur in Form von kleinen Stäbchen („batonettes") gefunden werden
kann. Dieser Mikroorganismus stellt Endotoxine bereit, die für einige
Insekten tödlich
sind, in der Form von kristallinen parasporalen Einschlüssen, die
während
der Sporulation produziert werden, die den Tod der Insekten nach
Aufnahme verursachen.
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Diese
Einschlüsse
können
in Gestalt, Anzahl und Zusammensetzung variieren, wobei sie aus
einem oder mehreren Protein(en), genannt Delta-Endotoxine, die zwischen
27-140 kDA variieren können,
aufgebaut sind. Im Gastrointestinaltrakt der Insekten unterliegen
diese Proteine einem alkalischen und enzymatischen Abbau und verursachen
systemische und intestinale Parese, was den Tod des Insekts verursacht.
Delta-Endotoxine werden leicht abgebaut und unterscheiden sich von
anderen toxischen Substanzen, weil sie eine spezifische toxische
Wirkung haben. In anderen Worten, sie beeinträchtigen keine anderen Organismen
außer den
Zielinsekten. (Heimpel, A.M.; ANn. Ver, Entomology 12, 287-322,
1967. Höfte
und Whiteley, Microbiological Reviews 53, 242-255, 1989).
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Unter
den Stämmen
von Bacillus thuringiensis, die aus der Natur isoliert wurden, wurde
die Varietät Bacillus
thuringiensis var. israelensis (Bti) gemeinhin gegen zweiflügelige Insekten
eingesetzt, deren Vernichtung für
die öffentliche
Gesundheit sehr wichtig ist (Payne et al.,
US 5,888,976 , 1999). Solche Insekten
können Gelbfieber
und Dengue übertragen,
zum Beispiel Aedes aegypti.
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Eine
praktische, ökonomische
und wirksame Nutzung von Bioinsektiziden (wie desjenigen, das von Bacillus
thuringiensis var. israelensis erhalten wird) ist abhängig von
der Menge an aktiver Komponente, die in der gesamten bioinsektiziden
Formulierung vorhanden ist.
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Gemeinhin
verwendete bioinsektizide Formulierungen können eine Biomasse von Bti
oder seine Sporen oder seine isolierten Endotoxine bereitstellen.
Diese Formulierungen benötigen
gute Stabilität
(Lagerfähigkeit)
und daher müssen
sie in ihrer Zusammensetzung Substanzen einschließen, die
den Abbau der aktiven Komponente durch chemische, biologische, physikalische
oder natürliche
Mittel (Sonnenlicht, zum Beispiel) verhindern können.
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Das
Dokument BR PI 8900938-0 offenbart bioinsektizide Zusammensetzungen,
die aus einem amylolytischen und proteolytischen Bakterium des Genus
Bacillus hergestellt sind, die für
Insekten verschiedener Klassen tödlich
sind. Sie schließen
bioinsektizide Zusammensetzungen ein, hergestellt aus Bacillus thuringiensis
var. israelensis, die für
zweiflügelige
Insekten toxisch sind, und inerten Flüssigkeiten, wie Sorbit, Glycerin, Toluol,
die dem Produkt zusammen mit der aktiven Biomasse eine pastöse Konsistenz
geben.
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Jedoch
hat eine pastöse
Formulierung ein hohes spezifisches Gewicht bzw. eine hohe relative
Dichte und sie neigt dazu auf dem Boden des Ausbringungsbereichs
zu verbleiben. Dies ist ein Nachteil, insbesondere in dem Fall von
Zielinsekten, die sich in oberflächennahen
Bereichen (wie zweiflügelige
Insekten) ernähren
und reproduzieren, in dem Fall, dass die aktive Komponente nicht
für eine
genügende
Zeit in dem Medium dispergiert bleibt, um wirksam zu sein.
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WO-A-98/28984
schlägt
eine Zusammensetzung vor, die für
die Larven zweiflügeliger
Insekten tödlich ist,
wobei sie in einer gefrorenen granulierten Form verteilt wird. Da
sie gefroren ist, ist eine solche Formulierung jedoch nicht an Orten
mit heißem
Wetter (wo es viele zweiflügelige
Insekten gibt) wirksam, wenn sie schmilzt. Darüber hinaus ist diese Formulierung
nicht praktisch, weil sie niedrige Temperaturen während der Lagerung
und dem Transport benötigt.
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Um
eine wirksame larvizide Aktivität
zu erhalten, ist es somit notwendig, bioinsektizide Formulierungen zu
verwenden, die eine hohe Dispersion bzw. Verteilung der aktiven
Komponenten in dem Ausbringungsbereich bereitstellen. Auf diese
Art wird es einfacher, die korrekte Dosis auszubringen, d.h. die
tödliche
Dosis an Bioinsektizid.
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Während dem
Herstellen bioinsektizider Zusammensetzungen ist es auch sehr wichtig,
nicht nur die Biologie des Zielinsekts sondern auch sein Habitat
zu berücksichtigen,
weil die Umweltbedingungen (Temperatur, pH, Vorhandsein von Metallen,
Feststoffe in Suspensionen, spezifisches Gewicht bzw. relative Dichte usw.)
die Leistungsfähigkeit
dieser Zusammensetzungen verändern
können.
Daher sind die Merkmale einer Formulierung, wie die physikalische
Form und das Abgabevehikel, sehr wichtig für die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffes.
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Zusätzlich benötig man
bioinsektizide Formulierungen, die durch ein hohes Maß an Dispersion
bzw. Verteilung der aktiven Komponente in den Reproduktions- und
Ernährungsbereichen
von Zielinsekten gekennzeichnet sind, während sie einfach gelagert,
verpackt, transportiert und verwendet werden.
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Trockene
bioinsektizide Formulierungen sind ein alternativer Weg, diese Probleme
zu lösen,
da sie leicht zu lagern, zu verpacken, in die befallenen Bereiche
(sogar jene, die schwierig zu erreichen sind) mitzunehmen und zu
verwenden sind, während
sie alle Anforderungen erfüllen,
die damit verbunden sind, eine hohe Homogenisierung der aktiven
Komponente in dem Ausbringungsbereich zu haben.
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DE-A-41
33 889 bezieht sich auf ein trockenes Bioinsektizid, dass als schäumende bzw.
sprudelnde Tabletten verteilt bzw. ausgebracht wird, die gegen zweiflügelige Insekten
verwendet werden. Trotz der Tatsache, dass die aktive Komponente
homogen abgegeben wird, gibt es jedoch keine Additive, um ihren
Abbau über
die Zeit zu verringern.
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Eine
Formulierung, die alle Larven über
eine Zeitdauer abtöten
kann, ist wichtig für
eine wirksame larvizide Aktivität.
Diese Langzeitwirkung der aktiven Komponente, zusammen mit einem
hohen Grad an Dispersion bzw. Verteilung in dem Ausbringungsbereich,
ermöglicht
eine leichte Verabreichung der korrekten Dosis und weniger Ausbringungen.
Dies ist von einem ökonomischen
und praktischen Gesichtspunkt ein wichtiger Faktor, insbesondere
für Orte,
die schwierig zu erreichen sind.
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EP-A-761
096, EP-A-0 236 875 und US-A-5,560,909 offenbaren Beispiele, wie
trockene bioinsektizide Formulierungen, hergestellt aus einem Bakterium
des Genus Bacillus, erhalten werden, die in den Ernährungs- und
Reproduktionsbereichen der Zielinsekten (z.B. zweiflügelige Insekten)
für eine
lange Zeit aktiv bleiben, was sogar in dem Fall von Moskitolarven
eine wirksame biologische Kontrolle der Insekten ergibt. Solche
Formulierungen können
jedoch Polymerverbindungen, die nicht bioabbaubar sind, oder andere
umweltschädliche Verbindungen
erfordern.
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Somit
ist es notwendig, eine Bioinsektizid-Trockenformulierung mit geeigneten
Trägeradditiven
herzustellen, die zu einer wirksamen biologischen Kontrolle von
zweiflügeligen
Insekten durch die Langzeitwirkung der aktiven Komponente führt, die
in dem Ausbringungsbereich verteilt wird, die nicht schädlich für die Umwelt ist.
Dieses Bioinsektizid sollte praktisch, ökonomisch, wirksam und auch ökologisch
sicher sein.
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Das
Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, eine trockene bioinsektizide
Zusammensetzung zu ermöglichen,
basierend auf der Biomasse und Endotoxinen von Bacillus thuringiensis
var. israelensis, die durch ihre Anwendbarkeit, Ökonomie und Wirksamkeit bei
der Kontrolle zweiflügeliger
Insekten charakterisiert ist, wobei sie zur gleichen Zeit ökologisch
sicher ist.
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Von
einem Aspekt her gesehen, stellt die vorliegende Erfindung eine
Bioinsektizid-Trockenformulierung bereit, umfassend: die Biomasse
und Endotoxine, erhalten von Bacillus thuringiensis var. israelensis
(Bti) mit toxischer Aktivität
gegen zweiflügelige
Insekten, wobei die Formulierung in der Form eines trockenen Pulvers
mit einer toxischen Aktivität
zwischen 500–1500
ITU (Internationale Toxische Einheiten)/mg trockenes Pulver vorliegt,
wobei die Formulierung weiterhin Additive umfasst, die chemische
Trockenmittel, Dispergiermittel, Bindemittel/Netzmittel und Schutzmittel
gegen Sonnenlicht sind.
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Eine
erste Ausführungsform
dieser Erfindung betrifft eine bioinsektizide Formulierung, die
als trockenes Pulver oder Tabletten verteilt wird, umfassend Additive,
die die Endotoxine (ob rein oder nicht) tragen, ausgewählt in einer
Weise, um eine hohe Dispersion bzw. Verteilung der aktiven Komponente
in dem Ausbringungsbereich zu ermöglichen, aber keine Risiken
für die
Umwelt zu bewirken.
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Von
einem weiteren Gesichtspunkt her gesehen, stellt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren für
die Herstellung einer bioinsektiziden Formulierung mit toxischer
Aktivität
gegen zweiflügelige
Insekten bereit, umfassend:
- I. Wachstum von
Bacillus thuringiensis var. israelensis mittels Fermentation in
einem geeigneten Wachstumsmedium, in dem die nicht verbrauchten
Metaboliten/Nährstoffe
nicht schädlich
für die
Umwelt sind und sie in einem industriellen Maßstab verwendet werden können;
- II. Gewinnung der toxischen Biomasse oder ihrer Sporen oder
nur der Endotoxine aus Schritt (I) mittels eines geeigneten Verfahrens
zur Rückgewinnung,
das in der Lage ist, die toxischen Aktivitäten der Endotoxine beizubehalten,
ob sie rein sind oder nicht;
- III. sequentielle Zugabe von chemischen Trockenmitteln und anderen
Additiven, die Dispergiermittel, Bindemittel/Netzmittel und Schutzmittel
gegen Sonnenlicht sind, zu der toxischen Biomasse oder zu ihren
Sporen oder zu den Endotoxinen, die in Schritt (II) gewonnen wurden,
und gegebenenfalls Dehydratation zwischen der Zugabe der chemischen
Trockenmittel und der anderen Additive;
- IV. Dehydratation des Gemischs aus Schritt (III) mittels eines
Verfahrens, das in der Lage ist, die toxische Aktivität der Endotoxine,
ob sie rein sind oder nicht, beizubehalten, um eine Formulierung
als ein trockenes Pulver zu erhalten;
- V. optionale Zugabe von Verdünnungsmitteln,
Schmierbzw. Gleitmitteln und Neutralisierungsmitteln zu dem trockenen
Pulver aus Schritt (IV) um Tabletten zu erhalten.
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Das
Hauptziel dieser Erfindung ist es, eine Trockenformulierung zu ermöglichen,
bestehend aus Endotoxinen von Bacillus thuringiensis var. israelensis,
die eine wirksame larvizide Aktivität gegen zweiflügelige Insekten
präsentiert
und dadurch gekennzeichnet ist, dass sie praktisch, ökonomisch
ist und keinen Schaden an der Umwelt verursacht.
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Für ein vollständigeres
Verständnis
werden wir unten die Bedeutungen der hierin verwendeten Begriffe
darlegen:
- 1. Wirksame larvizide Aktivität: Befähigung 100%
Larven innerhalb einer minimalen Aufenthaltszeit in dem Ausbringungsbereich
zu töten;
Vorhandensein einer guten Stabilität während der Lagerung (Lagerfähigkeit),
wobei die anfängliche
larvizide Aktivität
praktisch unverändert
erhalten wird, wobei Komponenten umfasst werden, die in der Lage
sind, den Abbau der aktiven Komponente durch die physikalische,
chemische und biologische Wirkung natürlicher Mittel im Ausbringungsbereich
zu verhindern; Umfassen von Additiven, die eine Verfügbarkeit
der aktiven Komponente in erforderlichen Leveln für solange
wie möglich
erzeugen (zum Beispiel Dispergiermittel, Substanzen, die die Netzmittelwirkung
erhöhen).
- 2. Ökonomische
larvizide Aktivität:
Resultat der Wirksamkeit bei der biologischen Kontrolle zweiflügeliger Insekten,
die die Verabreichung einer korrekten Dosis leichter machen würde, und
der Langzeitwirkung der aktiven Komponente, die die Anzahl der erforderlichen
Ausbringungen verringern würde.
- 3. Praktische larvizide Aktivität: Einsatz an Orten, die schwierig
zu erreichen sind, und einfache Lagerung, Verpackung und Transport
an die befallenen Orte.
- 4. Kein Schaden an der Umwelt (ökologisch sicher): bedeutet
keine Veränderung
am ökologischen
Gleichgewicht, Wirken in einer selektiven Weise (tödlich nur
für die
Zielinsekten und
nicht schädlich für die anderen, die im Ausbringungsbereich
vorkommen); Bioabbaubarkeit innerhalb einer angemessenen Zeit, um
nicht die Ablagerung von Detritus zu verursachen, nicht-toxisch
für Fauna
und Flora im Ausbringungsbereich; keine Trübung, um ein mögliches
Ungleichgewicht beim Sauerstoffeintrag („oxygenation") in die Umwelt zu
vermeiden; keine Bereitstellung von unverbrauchten Metaboliten und/oder
Nährstoffen, wenn
die toxische Biomasse produziert wird, welche für Fauna und Flora im Ausbringungsbereich
schädlich wären.
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Isolierung
und Wachstum von Bacillus thuringiensis var. israelensis und die
Fermentationsphase können
bei Bedingungen durchgeführt
werden, die aus der technischen Literatur bekannt sind, um die aktive
Biomasse zu erhalten.
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Das
Fermentationsmedium muss bereitstellen:
- a)
Stickstoffquelle-Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus industriellen Resten, die reich an Proteinen sind, Sojaproteine,
Harnstoff, Hefeextrakt.
- b) Kohlenstoffquelle-Substanzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus Mannit, Dextrose und Saccharose.
- c) Mikronährstoffquelle-Substanzen,
ausgewählt
aus Gemischen von Salzen, einschließlich MgSO4, MnSO4, ZnSO4, FeSO4 und CaCl2.
- d) Natriumchlorid, das eingesetzt wird, um die Zelllebensfähigkeit
aufrechtzuerhalten.
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Die
Auswahl des am besten geeigneten Wachstumsmediums ist von primärer Wichtigkeit,
um ein Bioinsektizid in einem industriellen Maßstab zu erhalten. Zusätzlich sollen
im Fall von Formulierungen, deren Endotoxin nicht aufgereinigt (isoliert)
ist, die Komponenten des Wachstumsmediums in einer solchen Weise
ausgewählt
werden, dass ihre Rückstände nicht
schädlich
für die
Umwelt sind.
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In
der vorliegenden Erfindung sind die Komponenten des Wachstumsmediums
in einer Weise ausgewählt,
um das Verhältnis
zwischen der Möglichkeit
der Nutzung in einem industriellen Maßstab und der Minimierung der
tödlichen
Wirkungen, verursacht durch die Fermentationsrückstände, zu befriedigen.
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Zur
Ausführung
dieser Erfindung wird das Wachstumsmedium der Wahl hergestellt aus:
Amino-Fertile (1,5–3,0%
G/G), Sojaprotein (1,0–1,5%
G/G), Harnstoff (0,1–0,2%
G/G), Mannit (0,6–0,8%
G/G), Natriumchlorid (0,1–0,2%
G/G), neben einem Gemisch aus Salzen (0,05–0,08% G/G) gemäß Tabelle
1.
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Tabelle
1: Komponenten
und ihre zugehörigen
Konzentrationen:
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Bei
solchen Bedingungen ist die Zelllebensfähigkeit 1,8–3,8 × 1010 KbE
(Kolonie-bildende Einheiten)/ml.
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Am
Ende der Fermentation schließt
die resultierende Trockenmasse, die die toxische Biomasse bildet, Endotoxine,
Sporen, zerrissene und unveränderte
Zellen von Bti ein, sowie feste Rückstände, die aus der Fermentation
entstehen, und die resultierenden Metaboliten.
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In
der vorliegenden Erfindung können
sowohl die toxische Biomasse von Bti und seine Sporen oder reine
Endotoxine als Bioinsektizide Formulierungen (gewonnen durch gemeinhin
verwendete Verfahren) verwendet werden, da sie nicht schädlich für die Wirksamkeit
der aktiven Komponente (Endotoxin), ob rein oder nicht, sind.
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Die
toxische Biomasse kann zum Beispiel durch Zentrifugation unter Verwendung
von Membranen (unter anderen) gewannen werden.
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Nach
der Gewinnung der Endotoxine von Bacillus thuringiensis var. israelensis,
ob rein oder nicht, beginnt man die Bioinsektizid-Trockenformulierung
(verteilt als trockenes Pulver) zu entwickeln, umfassend:
- a) Endotoxine, ob rein oder nicht, von Bacillus
thuringiensis var. israelensis.
- b) chemische Trockenmittel.
- c) Dispergiermittel.
- d) Bindemittel/Netzmittel.
- e) Schutzmittel gegen Sonnenlicht.
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Auf
diese Weise wird die aktive Biomasse von Bti oder seine gewonnenen
Sporen oder sogar seine aufgereinigten Endotoxine mit chemischen
Trockenmitteln (ausgewählt
aus Diatomit, Bentonit, Calciumphosphat, calciniertem Siliciumdioxid
(zum Beispiel Cab-o-sil®), Diatomeenerde, Calcit,
Ton, Siliciumdioxid, Kaolin, Dolomit, Leucit und Montmorillonit)
gemischt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung sind die gewählten chemischen Trockenmittel:
Dolomit, Bentonit, Calciumphosphat und Cab-o-sil®. Solche
Trockenmittel sind bevorzugt in einem Verhältnis von 0,1–10% G/G.
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Dispergiermittel,
wie Methylcellulose, Ammonium- und Calciumalginat, Natriumalginat,
Laktose und Carboxymethylcellulose, werden zusammen mit Bindemitteln/Netzmitteln
(zum Beispiel Polyoxyethylenstearate (z.B. Mirj 45®),
Natriumlaurylsulfat und Monooleat von Polyoxyethylensorbitanen)
eingesetzt.
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Die
aktive Komponente der vorliegenden Erfindung (Bti-Endotoxine, ob rein
oder nicht) wird auch gegen Abbau, verursacht durch Sonnenlicht,
geschützt.
Ein solcher Schutz kann durch Mischen der aktiven Komponente mit
wasserlöslichen
Mitteln erhalten werden. Alternativ können die Partikel der aktiven
Komponente mit schützenden
Mitteln, wie TiO2, wie in WO-A-98/15183
gezeigt, überzogen
werden.
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Die
Dispergier- und Bindemittel, die in einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind (entsprechend)
Methylcellulose und Mirj 45®. Vorzugsweise sind sie
in einem Verhältnis
von 0,1–10%
G/G vorhanden.
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Das
Gemisch der aktiven Biomasse oder der Sporen oder reinen Endotoxine
mit Additiven muss ausgeführt
werden, nachfolgend gefolgt von Dehydratation. Zwischen den Stufen
der Zugabe der chemischen Trockenmittel und der anderen Additive
(Dispergier-, Bindemittel/Netzmittel und Schutzmittel gegen Sonnenlicht) kann
ein Dehydratationsschritt durchgeführt werden.
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Die
Dehydratation kann mittels bekannter Trocknungstechniken durchgeführt werden,
die für
industriellen Maßstab
geeignet sind, wie Trocknen mit oder ohne Zwangsbelüftung, Trocknen
mittels Rotationsverdampfer/-sprinkler („rotative vaporizer/sprinkler") und Gefriertrocknen,
wodurch der Abbau der aktiven Komponente aufgrund hoher Temperaturen
vermieden wird.
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Das
endgültige
Gemisch wird dann gemahlen bis ein trockenes Pulver erhalten wird,
dessen Partikelgröße zwischen
50–100
Mesh und dessen Feuchtigkeitsgrad etwa 5–15% G/G sein muss. Zur Ausführung dieser
Erfindung sind die Bereiche der Wahl 60–80 Mesh und 9–11% G/G
für Partikelgröße bzw.
Feuchtigkeit.
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In
dieser Erfindung stellt die bioinsektizide Formulierung, verteilt
als Pulver, eine toxische Aktivität zwischen 500–1000 TIU
(Toxische Internationale Einheiten)/mg, ausgedrückt bei trockenem Pulver, bereit
und ist eine der Anwendungen der Wahl für die biologische Kontrolle
von zweiflügeligen
Insekten. Ausgedrückt
in Biomasse-Begriffen ist diese toxische Aktivität äquivalent zu 108–1012 KbE (Kolonie-bildende Einheiten)/g toxische
Biomasse.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung werden solche bioinsektizide Formulierungen als
100–200
mg-Tabletten (hergestellt aus dem trockenen Pulver) verteilt, umfassend:
- a) Endotoxine, ob rein oder nicht, von Bacillus
thuringiensis var. israelensis.
- b) Chemische Trockenmittel.
- c) Dispergiermittel.
- d) Bindemittel/Netzmittel.
- e) Schutzmittel gegen Sonnenlicht.
- f) Verdünnungsmittel,
Schmier- bzw. Gleitmittel und Neutralisierungsmittel.
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Somit
wird die Formulierung, verteilt als trockenes Pulver (d.h. die Formulierung,
die durch Mischen der Komponenten a) bis e) gebildet wurde), mit
mehreren Additiven, wie Neutralisierungs-, Verdünnungs- und Schmier- bzw. Gleitmitteln,
zusammengesetzt. Unter den Neutralisierungs- und Verdünnungsmitteln
findet man Natriumhydrogencarbonat, mikronisierte Cellulosen (Avicel®),
Laktose-Monohydrat, Apatit, granuliertes Mannit, calcinierten Ton,
Kaolin, Leucit und Talk.
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Schmier-
bzw. Gleitmittel können
Polyethylenglykole (PEG) mit Molekulargewicht zwischen 2000 und 6000
und Stearinsäure
sein.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung sind die Neutralisierungs- und Verdünnungsmittel
Natriumhydrogencarbonat, Avicel® und
Laktose-Monohydrat (vorzugsweise in einem Verhältnis von 10–70% G/G)
und das Schmier- bzw. Gleitmittel entspricht PEG 6000 (vorzugsweise
innerhalb eines Bereichs von 1–5%
G/G).
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In
der vorliegenden Erfindung liegen die aktiven Komponenten innerhalb
5–25%
des Endgewichts der Formulierung, die als Tabletten verteilt wird.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung haben die Tabletten eine Formulierung gemäß Tabelle
2.
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Tabelle
2: Formulierung
der Tabletten:
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Die
vorliegende Erfindung wird im Detail gemäß den folgenden Beispielen
beschrieben, ist aber nicht darauf beschränkt.
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Beispiel 1:
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Erzielung aktiver Biomasse
von Bacillus thuringiensis var. israelensis:
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Der
Stamm Bacillus thuringiensis var. israelensis IPS 82 wurde eingesetzt,
um aktive Biomasse zu erhalten.
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Die
Tabelle 3 zeigt das verwendete Fermentationsmedium.
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Tabelle
3: Fermentationsmedium:
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- * Industrielle Reste, die reich an Proteinen sind.
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Die
Fermentation wurde bei 33°C
24 Stunden lang durchgeführt.
Die Untersuchungen wurden in einem Maßstab von 50 ml in 250 ml-Erlenmeyer-Kolben
mittels Rühren
in einem Schüttler,
innerhalb eines Bereichs von 150–270 U.p.M., erstellt.
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Die
geeignete Zelllebensfähigkeit
war 3,8 × 1010 KbE (Kolonie-bildende Einheiten)/ml.
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Beispiel 2:
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Gewinnung aktiver Biomasse
von Bacillus thuringiensis var. israelensis:
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Nach
dem Fermentationsschritt wurde die Trockenmasse (einschließlich Bti-Kristall-Protein),
ihre Sporen, ihre zerrissenen und intakten Zellen sowie feste Rückstände, die
aus dem Fermentationsmedium stammen, mittels eines Bioseparationsverfahrens
mittels Membran-Vortex („membrane
vortex") gewonnen.
Die Betriebsbedingungen dieses Verfahrens sind in Tabelle 4 gezeigt.
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Tabelle
4: Betriebsparameter – Bioseparationsverfahren
mittels Membran-Vortex.
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Eine
20%-Ausbeute über
das Ausgangsvolumen der aktiven Biomasse wird erhalten.
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Beispiel 3:
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Bioinsektizide Formulierung,
verteilt als trockenes Pulver:
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Die
Biomasse, die gemäß der Vorgehensweise,
die in dem vorigen Beispiel erwähnt
wurde, gewonnen wurde, wurde mit den chemischen Trockenmitteln Diatomit,
Bentonit, Tricalciumphosphat und Cab-o-sil® in
den Mengen, die in Tabelle 5 gezeigt sind, vermischt.
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Tabelle
5: Menge
an aktiver Biomasse und chemischen Trockenmitteln, eingesetzt in
der Formulierung, die als trockenes Pulver verteilt wird.
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Diatomit,
Bentonit, Tricalciumphosphat und Cab-o-sil® wurden
gemahlen und homogenisiert. Dieses Gemisch wurde zu der aktiven
Masse von Bti unter gleichmäßigem Rühren hinzugefügt. Das
resultierende Gemisch wurde in einem Ofen bei 37°C getrocknet.
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Nach
36 Stunden wurde das trockene Pulver gemahlen, um ein feines und
homogenes Pulver (genannt P) zu erhalten, das 27,29 g wog. Nach
diesem Schritt wurden 0,5458 g (2% des Gewichts von P) einer zuvor
gemahlenen Methylcellulose zu dem trockenen Pulver hinzugefügt. Das
resultierende Gemisch wurde dann homogenisiert.
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Getrennt
davon wurden 0,2729 g (1% des Gesamtgewichts von P) von Mirj® in
einem Wasserbad bis zum vollständigen
Schmelzen erhitzt, während
schrittweise 50 ml destilliertes Wasser unter heftigem Rühren hinzugefügt wurden.
Zu dieser Lösung
wurde dann der Sonnenfilter Eusolex 6007® hinzugefügt.
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Die
vorige Lösung
wurde dann langsam über
das trockene Pulver P gegossen, das mit der Methylcellulose gemischt
war. Das resultierende Gemisch wurde homogenisiert und bei 30°C 24 Stunden
lang in einen Ofen eingebracht.
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Das
resultierende trockene Pulver (etwa 26,7 g) mit einem Feuchtigkeitsgrad
von 10,83 % G/G wurde gemahlen und mittels eines 70-Mesh-Siebs (Tamis)
gesiebt.
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Die
zelluläre
Konzentration (bestimmt mittels der Technik der Plattenzählung) war
7 × 1011 KbE (Kolonie-bildende Einheiten)/g toxische
Biomasse.
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Somit
wurde die bioinsektizide Formulierung, basierend auf Bacillus thuringiensis
var. israelensis, die als trockenes Pulver (P1)
verteilt wird, erhalten.
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Beispiel 4:
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Bioinsektizide
Formulierung, verteilt als Tabletten:
Das trockene Pulver (P1), erhalten in dem vorigen Beispiel, wurde
mit den Verdünnungsmitteln
Avicel PH102 und Laktose-Monohydrat,
mit Natriumhydrogencarbonat (Neutralisierungsmittel) und auch mit
atomisiertem PEG 6000 (Schmier- bzw. Gleitmittel) vermischt. Dieses
Gemisch von Pulvern wurde einer Drehungspressung unterzogen und
als Bioinsektizid-Tabletten ausgeworfen.
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Wir
erhielten 20 oder 15 mg-Tabletten, umfassend trockenes Pulver P1 als aktive Komponente.
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Die
Tabellen 6 und 7 zeigen die Mengen an eingesetzten Mitteln, um 1
bzw. 600 Tabletten zu erhalten.
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Tabelle
6: Eingesetzte
Adjuvantien beim Herstellen von Tabletten, umfassend 20 mg aktive
Komponente.
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Tabelle
7: Eingesetzte
Adjuvantien beim Herstellen von Tabletten, umfassend 15 mg aktive
Komponente.
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Beispiel 5:
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Untersuchungen gegen Larven
des Moskito Aedes aegypti:
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Tabletten
mit 20 und 15 mg der aktiven Komponente wurden auf lrvizide Aktivität gegen
den Moskito Aedes aegypti getestet.
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Eine
Tablette wurde in jeweils 10 Liter Wasser platziert. Durch periodische
Einführung
von Larven von Aedes aegypti wurde ihre Mortalitätsrate bestimmt.
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Die
Ergebnisse für
beide Tabletten machen deutlich, dass die entsprechenden Mengen
an aktiver Komponente eine wirksame larvizide Aktivität zeigten,
die eine 100%ige Mortalität
der Larven ergab, während sie
für bis
zu 19 Tage in Bereichen unter Sonnenlicht und für 28 Tage in Bereichen im Schatten
erhalten blieb.