JP2023512672A - バチルス・チューリンゲンシスの殺虫製剤 - Google Patents
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Abstract
本発明の殺虫製剤は、バチルス・チューリンゲンシスと、ゲル浸透クロマトグラフィに従って測定されたとき、１，０００ｇ／ｍｏｌ～１２，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有するポリエチレングリコールと、ポリフェノールと、を含む。【選択図】なし
Description
本開示は、概して、殺虫製剤に、より具体的には、バチルス・チューリンゲンシスを含む殺虫製剤に関する。
導入
作物防御の用途で使用される殺虫製剤は従来、作物防御製剤の一部として、作物の組織に噴霧されてきた。従来の殺虫製剤は、人間に対して毒性であると認識される殺虫剤を含み得、またそれは収穫後に作物上に残留し、かかる作物の最終消費者へと移り得る。更に、雨水及び灌漑水の形態の水は、従来の殺虫剤を作物の組織から洗浄してしまい得るため、その結果水が汚染される一方で、害虫からの作物の保護が損なわれてしまいがちである。
作物防御の用途で使用される殺虫製剤は従来、作物防御製剤の一部として、作物の組織に噴霧されてきた。従来の殺虫製剤は、人間に対して毒性であると認識される殺虫剤を含み得、またそれは収穫後に作物上に残留し、かかる作物の最終消費者へと移り得る。更に、雨水及び灌漑水の形態の水は、従来の殺虫剤を作物の組織から洗浄してしまい得るため、その結果水が汚染される一方で、害虫からの作物の保護が損なわれてしまいがちである。
従来の殺虫剤に対する従来の代用物としては、天然に存在する微生物及び細菌を使用して、害虫を抑制及び死滅させる、生物系殺虫剤が挙げられる。生物系殺虫剤で使用されている細菌の１つが、バチルス・チューリンゲンシスである。バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）は、殺虫製剤においては、胞子及び結晶化タンパク質の形態で、作物に施用される。バチルス・チューリンゲンシスの胞子形成プロセス中、バチルス・チューリンゲンシスは、特定の害虫に対して毒性を有する結晶化タンパク質を産生する。昆虫がバチルス・チューリンゲンシスの胞子及びタンパク質を作物組織とともに摂取したとき、そのタンパク質は、昆虫の消化管内に細孔を開ける。次いで、バチルス・チューリンゲンシス胞子は、細孔を通過し、昆虫の血流内で活性化し、増殖する。昆虫の血流内での急速な細菌の増殖は、昆虫の敗血症及び死をもたらす。
バチルス・チューリンゲンシスは、その作用メカニズム上の理由から、作物防御の設定で使用される場合には、多くの欠点を抱えている。例えば、カナダ特許第２１８４０１９（Ａ１）号は、バチルス・チューリンゲンシスが紫外線照射に曝露されると、結晶化タンパク質の不活性化及び胞子のＤＮＡへの損傷が生じ得ることを詳述している。中国特許第１０３１６０４４９（Ａ）号は、紫外線の照射からバチルス・チューリンゲンシスを保護するためのフミン酸の使用を開示している。更に、タンパク質及び胞子は、雨水及び灌漑用水の形態の水によって作物組織から除去されやすい。バチルス・チューリンゲンシスは、最大の有効性が得られるか否かが、タンパク質及び胞子の生存率に依存するため、作物の防御用途という環境は、バチルス・チューリンゲンシスには課題となる。
殺虫製剤は、典型的には、湿潤剤（例えば、ポリエチレングリコール）、展着剤及び粘着剤、レオロジー調整剤、栄養素、並びに他の多くのアジュバントを含み、それにより複雑な製剤となる。殺虫製剤の１つ以上の特性の有効性を減少させ得る、殺虫製剤中に存在する異なるアジュバント間の相互作用及び副反応が、しばしば生じる。バチルス・チューリンゲンシスのような殺虫剤の使用は、典型的には、殺虫剤を使用する際の既知の課題に対処するために、潜在的な副反応を伴う更に多くのアジュバントの添加を必要とする。
製剤中のフェノールと非イオン性ポリマーとの相互作用は、医薬科学において数十年間にわたり研究されている。例えば、Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｎｉｏｎｉｃ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｐｈｅｎｏｌｓ Ｉ（Ｂ．Ｎ．Ｋａｂａｄｉ著）では、フェノールとポリエチレングリコールとの相互作用を検討している。Ｋａｂａｄｉは、フェノールのＯＨ基とポリエチレングリコールのエーテル架橋との間の水素結合の形成によって、フェノールがポリエチレングリコールの安定化及び可溶化特性を選好的に妨害することを説明している。水素結合は、フェノール及びポリエチレングリコールを一緒に凝固させて分離させる疎水性高分子構造の形成をもたらす傾向がある。結果として、製剤に添加されるポリエチレングリコール及びフェノールの各々の個々の特性は、減少又は排除される。
したがって、ポリフェノール及びポリエチレングリコールの両方を含む一方で、バチルス・チューリンゲンシスの従来の欠点のうちの１つ以上にも対処する、殺虫製剤を発見することは驚くべきことであろう。
本発明は、ポリフェノール及びポリエチレングリコールの両方を含む殺虫製剤を提供する一方で、バチルス・チューリンゲンシスの従来の欠点のうちの１つ以上にも対処するための解決策を提供するものである。
本発明は、先行技術において実証されたポリエチレングリコールとフェノールとの選好的な相互作用にもかかわらず、ポリエチレングリコール及びポリフェノールの両方を含む製剤が、作物の防御用途において、バチルス・チューリンゲンシスを使用する従来の困難に対処することができることを発見した結果である。ポリエチレングリコールとポリフェノールとの選好的な相互作用が、これらの構成成分の凝集を引き起こし、それにより、これらの成分の各々がバチルス・チューリンゲンシスに与える影響が減少するか又はなくなることが予想されるため、この発見は驚くべきことである。驚くべきことに、ポリエチレングリコール、ポリフェノール及びバチルス・チューリンゲンシスの組み合わせ製剤の、雨への曝露後のバチルス・チューリンゲンシスの生存率は、各独立した成分の場合をほぼ合計したものであることが発見された。ポリエチレングリコール及びポリフェノールが凝集して、個々の成分の合計よりも低いバチルス・チューリンゲンシスの生存率となることが予測されため、かかる結果は予想外である。
更に、シミュレートされた日光を使用して紫外線に曝露した後、９０％を超えるバチルス・チューリンゲンシスの生存率が、ポリエチレングリコール、ポリフェノール、及びバチルス・チューリンゲンシスの組み合わせ製剤を使用することにより達成できることが発見された。雨水への堅牢度と同様に、ポリフェノールの凝集に起因するバチルス・チューリンゲンシスの生存率の予想される減少は、予想外にそれ自体では明らかに見られなかった。
本発明のポリエチレングリコール、ポリフェノール、及びバチルス・チューリンゲンシス製剤は、殺虫製剤として特に有用である。
本開示の少なくとも１つの特徴によれば、殺虫製剤は、バチルス・チューリンゲンシスと、ゲル浸透クロマトグラフィに従って測定されたとき１，０００ｇ／ｍｏｌ～１２，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有するポリエチレングリコールと、ポリフェノールと、を含む。
本明細書で使用される場合、「及び／又は」という用語は、２つ以上の項目の列挙で使用される場合、列挙された項目のうちのいずれか１つをそれ自体で用いることができるか、又は列挙された項目のうちの２つ以上の任意の組み合わせを用いることができることを意味する。例えば、組成物が成分Ａ、Ｂ、及び／又はＣを含有するものとして説明されている場合、組成物はＡを単独で、Ｂを単独で、Ｃを単独で、Ａ及びＢを組み合わせて、Ａ及びＣを組み合わせて、Ｂ及びＣを組み合わせて、又はＡ、Ｂ、及びＣを組み合わせて、含有することができる。
別途記載のない限り、すべての範囲は、終点を含む。ポリマー式の下付き文字値は、ポリマー中の指定された成分のモル平均値を指す。
試験方法は、試験方法番号でハイフン付きの２桁の数字で日付が示されていない限り、この文書の優先日における最新の試験方法を指す。試験方法への言及は、試験の協会及び試験方法番号への参照の両方を含む。試験方法組織は、以下の略語のうちの１つによって参照され、ＡＳＴＭは、ＡＳＴＭインターナショナル（ASTM International）（旧称、米国材料試験協会、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）を指し、ＥＮは、欧州規格（European Norm）を指し、ＤＩＮは、ドイツ規格協会（Deutsches Institut fuer Normung）を指し、ＩＳＯは国際標準化機構（International Organization for Standards）を指す。
本明細書で使用される場合、「平均分子量」という用語は、数平均分子量であり、ＡＳＴＭ標準Ｄ４２７４によって記載されるようなヒドロキシル数分析を使用して試験される。
本明細書で使用される場合、成分の「重量％」又は「重量パーセント」又は「重量パーセント」は、特に反対の記載がない限り、成分が含まれる組成物又は物品の総重量に基づく。本明細書で使用される場合、すべての百分率は、特に明記されていない限り、重量による。
殺虫製剤
本発明には、バチルス・チューリンゲンシスと、ポリエチレングリコールと、ポリフェノールと、を含む、殺虫製剤を含む。様々な実施形態によれば、殺虫製剤は、水と、バチルス・チューリンゲンシスと、ポリエチレングリコールと、ポリフェノールと、からなる。殺虫製剤は、殺虫製剤が作物防御製剤の５０重量％以下である、作物防御製剤において利用され得る。
本発明には、バチルス・チューリンゲンシスと、ポリエチレングリコールと、ポリフェノールと、を含む、殺虫製剤を含む。様々な実施形態によれば、殺虫製剤は、水と、バチルス・チューリンゲンシスと、ポリエチレングリコールと、ポリフェノールと、からなる。殺虫製剤は、殺虫製剤が作物防御製剤の５０重量％以下である、作物防御製剤において利用され得る。
ポリエチレングリコール
殺虫製剤は、ポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコールは、式Ｈ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｑ－ＯＨによって表されるエチレンオキシドのオリゴマー又はポリマーを指し、式中、ｑは、ポリエチレングリコールポリマーの繰り返し単位の数を指す。ポリエチレングリコールのｑ値は、２０～２５０の範囲であり得る。
殺虫製剤は、ポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコールは、式Ｈ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｑ－ＯＨによって表されるエチレンオキシドのオリゴマー又はポリマーを指し、式中、ｑは、ポリエチレングリコールポリマーの繰り返し単位の数を指す。ポリエチレングリコールのｑ値は、２０～２５０の範囲であり得る。
ポリエチレングリコールの平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィに従って測定されたとき、１，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は２，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は３，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は３，５００ｇ／ｍｏｌ以上、又は４，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は４，５００ｇ／ｍｏｌ以上、又は５，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は５，５００ｇ／ｍｏｌ以上、又は６，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は６，５００ｇ／ｍｏｌ以上、又は７，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は７，５００ｇ／ｍｏｌ以上、又は８，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は８，５００ｇ／ｍｏｌ以上、又は９，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は９，５００ｇ／ｍｏｌ以上、又は１０，０００ｇ／ｍｏｌ以上、又は１０，５００ｇ／ｍｏｌ以上、又は１１，０００ｇ／ｍｏｌ以上であり、同時に、１２，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は１０，５００ｇ／ｍｏｌ以下、又は１０，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は９，５００ｇ／ｍｏｌ以下、又は９，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は８，５００ｇ／ｍｏｌ以下、又は８，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は７，５００ｇ／ｍｏｌ以下、又は７，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は６，５００ｇ／ｍｏｌ以下、又は６，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は５，５００ｇ／ｍｏｌ以下、又は５，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は４，５００ｇ／ｍｏｌ以下、又は４，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は３，５００ｇ／ｍｏｌ以下、又は３，０００ｇ／ｍｏｌ以下、又は２，０００ｇ／ｍｏｌ以下であり得る。例えば、ポリエチレングリコールの平均分子量は、３，０００ｇ／ｍｏｌ～９，０００ｇ／ｍｏｌ、又は４，０００ｇ／ｍｏｌ～８，０００ｇ／ｍｏｌ、又は５，０００ｇ／ｍｏｌ～７，０００ｇ／ｍｏｌ、又は６，０００ｇ／ｍｏｌであり得る。同じ又は異なる重量パーセントの異なる平均分子量ポリエチレングリコールのブレンドは、殺虫製剤において利用され得る。
ポリエチレングリコールは、殺虫製剤の０．２重量％～１０重量％であり得る。殺虫製剤は、０．２重量％以上、又は０．５重量％以上、又は１．０重量％以上、又は１．５重量％以上、又は２．０重量％以上、又は２．５重量％以上、又は３．０重量％以上、又は３．５重量％以上、又は４．０重量％以上、又は４．５重量％以上、又は５．０重量％以上、又は５．５重量％以上、又は６．０重量％以上、又は６．５重量％以上、又は７．０重量％以上、又は７．５重量％以上、又は８．０重量％以上、又は８．５重量％以上、又は９．０重量％以上、又は９．５重量％以上、一方で同時に１０重量％以下、又は９．５重量％以下、又は９．０重量％以下、又は８．５重量％以下、又は８．０重量％以下、又は７．５重量％以下、又は７．０重量％以下、又は６．５重量％以下、又は６．０重量％以下、又は５．５重量％以下、又は５．０重量％以下、又は４．５重量％以下、又は４．０重量％以下、又は３．５重量％以下、又は３．０重量％以下、又は２．５重量％以下、又は２．０重量％以下、又は１．５重量％以下、又は１．０重量％以下、又は０．５重量％以下のポリエチレングリコールを含み得る。
バチルス・チューリンゲンシス
殺虫製剤は、バチルス・チューリンゲンシスを含む。本明細書で定義されるように、「バチルス・チューリンゲンシス」は、種バチルス・チューリンゲンシスの胞子及び／又は結晶化タンパク質として定義され、殺虫特性を示すすべてのバチルス・チューリンゲンシス亜種が含まれる。かかる亜種の例としては、ｋｕｒｓｔａｋｉ、ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ及びａｉｚａｗａが挙げられる。バチルス・チューリンゲンシスは、固体又は液体製剤の一部として殺虫製剤に添加され得る。バチルス・チューリンゲンシスの存在及び亜種は、ランダム増幅多形ＤＮＡ分析によって判定される。バチルス・チューリンゲンシスの市販の液体製剤は、ＣＥＲＴＩＳ ＵＳＡ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販されているＴＨＵＲＩＣＩＤＥ（商標）殺虫剤である。
殺虫製剤は、バチルス・チューリンゲンシスを含む。本明細書で定義されるように、「バチルス・チューリンゲンシス」は、種バチルス・チューリンゲンシスの胞子及び／又は結晶化タンパク質として定義され、殺虫特性を示すすべてのバチルス・チューリンゲンシス亜種が含まれる。かかる亜種の例としては、ｋｕｒｓｔａｋｉ、ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ及びａｉｚａｗａが挙げられる。バチルス・チューリンゲンシスは、固体又は液体製剤の一部として殺虫製剤に添加され得る。バチルス・チューリンゲンシスの存在及び亜種は、ランダム増幅多形ＤＮＡ分析によって判定される。バチルス・チューリンゲンシスの市販の液体製剤は、ＣＥＲＴＩＳ ＵＳＡ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から市販されているＴＨＵＲＩＣＩＤＥ（商標）殺虫剤である。
ポリフェノール
殺虫製剤は、１つ以上のポリフェノールを含む。本明細書で使用される場合、「ポリフェノール」という用語は、フミン酸、フルビン酸、及びタンニン酸のうちの１つ以上からなる液体を意味するものとして定義される。フミン酸、フルビン酸、及びタンニン酸は各々、複数のフェノール官能基を含み、それによって各ポリフェノールをレンダリングする。フミン酸は、土壌中に見出される腐植土、堆積物、又は水生環境から抽出することができる酸性有機ポリマーである。フミン酸は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）番号１４１５－９３－６によって識別され、Ｃ１８７Ｈ１８６Ｏ８９Ｎ９Ｓ１の平均化学式を有する。フルビン酸は、ＣＡＳ番号４７９－６６－３及びＣ１４Ｈ１２Ｏ８の化学式を有する有機酸である。タンニン酸は、ＣＡＳ番号１４０１－５５－４及びＣ７６Ｈ５２Ｏ４６の化学式を有する有機酸である。フミン酸及びフルビン酸のブレンドは、ＯＲＧＡＮＯＣＡＴ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）から土壌栄養素ＦＬＯＲＩＳ（商標）として市販されている。タンニン酸は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。殺虫製剤内のポリフェノールの存在は、高速液体クロマトグラフィによって判定される。製剤は、ポリフェノールを、０．２重量％以上、又は０．５重量％以上、又は１．０重量％以上、又は１．５重量％以上、又は２．０重量％以上、又は２．５重量％以上、又は３．０重量％以上、又は３．５重量％以上、又は４．０重量％以上、又は４．５重量％以上、一方で同時に、５．０重量％以下、又は４．５重量％以下、又は４．０重量％以下、又は３．５重量％以下、又は３．０重量％以下、又は２．５重量％以下、又は２．０重量％以下、又は１．５重量％以下、又は１．０重量％以下、又は０．５重量％以下の濃度で含み得る。殺虫製剤中のポリフェノールの重量％は、殺虫製剤に添加されたポリフェノール含有材料の量及びポリフェノール濃度に基づいて判定される。ポリフェノールは、フミン酸、フルビン酸、又はタンニン酸を、単独で、又は任意の組み合わせで、殺虫製剤内で上記のポリフェノール濃度に達するように含み得る。
殺虫製剤は、１つ以上のポリフェノールを含む。本明細書で使用される場合、「ポリフェノール」という用語は、フミン酸、フルビン酸、及びタンニン酸のうちの１つ以上からなる液体を意味するものとして定義される。フミン酸、フルビン酸、及びタンニン酸は各々、複数のフェノール官能基を含み、それによって各ポリフェノールをレンダリングする。フミン酸は、土壌中に見出される腐植土、堆積物、又は水生環境から抽出することができる酸性有機ポリマーである。フミン酸は、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＡＳ）番号１４１５－９３－６によって識別され、Ｃ１８７Ｈ１８６Ｏ８９Ｎ９Ｓ１の平均化学式を有する。フルビン酸は、ＣＡＳ番号４７９－６６－３及びＣ１４Ｈ１２Ｏ８の化学式を有する有機酸である。タンニン酸は、ＣＡＳ番号１４０１－５５－４及びＣ７６Ｈ５２Ｏ４６の化学式を有する有機酸である。フミン酸及びフルビン酸のブレンドは、ＯＲＧＡＮＯＣＡＴ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）から土壌栄養素ＦＬＯＲＩＳ（商標）として市販されている。タンニン酸は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。殺虫製剤内のポリフェノールの存在は、高速液体クロマトグラフィによって判定される。製剤は、ポリフェノールを、０．２重量％以上、又は０．５重量％以上、又は１．０重量％以上、又は１．５重量％以上、又は２．０重量％以上、又は２．５重量％以上、又は３．０重量％以上、又は３．５重量％以上、又は４．０重量％以上、又は４．５重量％以上、一方で同時に、５．０重量％以下、又は４．５重量％以下、又は４．０重量％以下、又は３．５重量％以下、又は３．０重量％以下、又は２．５重量％以下、又は２．０重量％以下、又は１．５重量％以下、又は１．０重量％以下、又は０．５重量％以下の濃度で含み得る。殺虫製剤中のポリフェノールの重量％は、殺虫製剤に添加されたポリフェノール含有材料の量及びポリフェノール濃度に基づいて判定される。ポリフェノールは、フミン酸、フルビン酸、又はタンニン酸を、単独で、又は任意の組み合わせで、殺虫製剤内で上記のポリフェノール濃度に達するように含み得る。
ポリフェノールは、２：１００以上、又は４：１００以上、又は６：１００以上、又は８：１００以上、又は１０：１００以上、又は１２：１００以上、又は１４：１００以上、又は１６：１００以上、又は１８：１００、一方で同時に２０：１００以下、又は１８：１００以下、又は１６：１００以下、又は１４：１００以下、又は１２：１００以下、又は１０：１００以下、又は８：１００以下、又は６：１００以下、又は４：１００以下、又は２：１００以下の、フルビン酸対フミン酸の重量比を有し得る。
アジュバント
殺虫製剤は、１つ又は添加剤又はアジュバントを含み得る。添加剤の例としては、とりわけ、本明細書に提供される教示から逸脱することなく、粘度調整剤、ｐＨ調整剤、除草剤、殺真菌剤、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
殺虫製剤は、１つ又は添加剤又はアジュバントを含み得る。添加剤の例としては、とりわけ、本明細書に提供される教示から逸脱することなく、粘度調整剤、ｐＨ調整剤、除草剤、殺真菌剤、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
作物防御製剤
殺虫製剤は、作物防御製剤内で利用され得る。作物防御製剤は、殺虫製剤を、１重量％以上、又は５重量％以上、又は１０重量％以上、又は１５重量％以上、又は２０重量％以上、又は２５重量％以上、又は３０重量％以上、又は３５重量％以上、又は４０重量％以上、又は４５重量％以上、一方で同時に、５０重量％以下、又は４５重量％以下、又は４０重量％以下、又は３５重量％以下、又は３０重量％以下、又は２５重量％以下、又は２０重量％以下、又は１５重量％以下、又は１０重量％以下の濃度で含み得る。殺虫製剤の個々の成分は、本明細書で提供される教示から逸脱することなく、作物防御製剤に別個に添加され得る。
殺虫製剤は、作物防御製剤内で利用され得る。作物防御製剤は、殺虫製剤を、１重量％以上、又は５重量％以上、又は１０重量％以上、又は１５重量％以上、又は２０重量％以上、又は２５重量％以上、又は３０重量％以上、又は３５重量％以上、又は４０重量％以上、又は４５重量％以上、一方で同時に、５０重量％以下、又は４５重量％以下、又は４０重量％以下、又は３５重量％以下、又は３０重量％以下、又は２５重量％以下、又は２０重量％以下、又は１５重量％以下、又は１０重量％以下の濃度で含み得る。殺虫製剤の個々の成分は、本明細書で提供される教示から逸脱することなく、作物防御製剤に別個に添加され得る。
材料
以下の試料で使用するためのバチルス・チューリンゲンシス製剤は、ＣＥＲＴＩＳ ＵＳＡ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から、ＴＨＵＲＩＣＩＤＥ（商標）ＨＰＣ－Ｏ生物系殺虫剤として市販されている、９８．３５重量％のｋｕｒｓｔａｋｉ亜種のバチルス・チューリンゲンシスを含有する溶液（「ＢＴ溶液」）である液体殺虫剤である。
以下の試料で使用するためのバチルス・チューリンゲンシス製剤は、ＣＥＲＴＩＳ ＵＳＡ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から、ＴＨＵＲＩＣＩＤＥ（商標）ＨＰＣ－Ｏ生物系殺虫剤として市販されている、９８．３５重量％のｋｕｒｓｔａｋｉ亜種のバチルス・チューリンゲンシスを含有する溶液（「ＢＴ溶液」）である液体殺虫剤である。
以下の試料で使用するためのポリフェノールは、５．２重量％のフミン酸と、０．５重量％のフルビン酸と、残部としての水と、のブレンドであり、その一例は、ＯＲＧＡＮＯＣＡＴ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）から、ＦＬＯＲＩＳ（商標）土壌栄養素として市販されている。
以下の試料で使用するためのＰＥＧは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている６０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有するポリエチレングリコールである。
試料調製
以下の手順に従って、比較例（「comparative example、ＣＥ」）ＣＥ１～ＣＥ３及び本発明の実施例（「inventive example、ＩＥ」）ＩＥ１～ＩＥ６を調製する。
以下の手順に従って、比較例（「comparative example、ＣＥ」）ＣＥ１～ＣＥ３及び本発明の実施例（「inventive example、ＩＥ」）ＩＥ１～ＩＥ６を調製する。
バチルス・チューリンゲンシス製剤を未希釈でサンプリングすることによって、ＣＥ１を調製する。
２グラムのバチルス・チューリンゲンシス製剤と、ＣＥ２の重量に基づいて、５重量％のＰＥＧと、を組み合わせ、磁気撹拌棒で混合することによって、ＣＥ２を調製する。
２グラムのバチルス・チューリンゲンシス製剤と、ＣＥ３の重量に基づいて、５重量％のポリフェノールと、を組み合わせ、磁気撹拌棒で混合することによって、ＣＥ３を調製する。
予備製剤の重量に基づいて、２．５重量％のＰＥＧ、２．５重量％のポリフェノール、及び残部としての水を含有する予備製剤を作製することによって、ＩＥ１を調製する。予備製剤（１ｍＬ）、バチルス・チューリンゲンシス製剤（２グラム）、及び水（１７グラム）を組み合わせ、磁気撹拌棒で混合することによって、ＩＥ１を得る。
予備製剤の重量に基づいて、５重量％のＰＥＧ、５重量％のポリフェノール、及び残部としての水を含有する予備製剤を作製することによって、ＩＥ２を調製する。予備製剤（１ｍＬ）、バチルス・チューリンゲンシス製剤（２グラム）、及び水（１７グラム）を組み合わせ、磁気撹拌棒で混合することによって、ＩＥ２を提供する。
予備製剤の重量に基づいて、１．５重量％のＰＥＧ、及び３．５重量％のポリフェノール、及び残部としての水を含有する予備製剤を作製することによって、ＩＥ３を調製する。予備製剤（１ｍＬ）、バチルス・チューリンゲンシス製剤（２グラム）、及び水（１７グラム）を組み合わせ、磁気撹拌棒で混合することによって、ＩＥ３を得る。
予備製剤の重量に基づいて、３．５重量％のＰＥＧ、及び１．５重量％のポリフェノール、及び残部としての水を含有する予備製剤を作製することによって、ＩＥ４を調製する。予備製剤（１ｍＬ）、バチルス・チューリンゲンシス製剤（２グラム）、及び水（１７グラム）を組み合わせ、磁気撹拌棒で混合することによって、ＩＥ４を得る。
予備製剤の重量に基づいて、７．０重量％のＰＥＧ、及び３．０重量％のポリフェノール、及び残部としての水を含有する予備製剤を作製することによって、ＩＥ５を調製する。予備製剤（１ｍＬ）、バチルス・チューリンゲンシス製剤（２グラム）、及び水（１７グラム）を組み合わせ、磁気撹拌棒で混合することによって、ＩＥ５を得る。
予備製剤の重量に基づいて、１０．５重量％のＰＥＧ、及び４．５重量％のポリフェノール、及び残部としての水を含有する予備製剤を作製することによって、ＩＥ６を調製する。予備製剤（１ｍＬ）、バチルス・チューリンゲンシス製剤（２グラム）、及び水（１７グラム）を組み合わせ、磁気撹拌棒で混合することによって、ＩＥ６を得る。
表１は、使用された材料及び試料調製方法に基づく、比較例及び本発明の実施例の様々な成分の重量パーセントの要約を示す。
試験方法
雨水堅牢性試験
ＰＡＲＡＦＩＬＭ Ｍ（商標）（ＢＥＭＩＳ ＣＯＭＰＡＮＹ製）実験室フィルムを５．０８センチメートル（「ｃｍ」）×１０．１６ｃｍの見本に切断し、黒色のＬＥＮＥＴＡ（商標）チャート（ＬＥＮＥＴＡ ＣＯＭＰＡＮＹ製）上に見本を配置することによって、雨水堅牢性試験を実施する。ＰＡＲＡＦＩＬＭ Ｍ（商標）実験室フィルムの見本を、ＫＩＭＷＩＰＥ（商標）ワイパー（ＫＩＭＢＥＲＬＹ ＣＬＡＲＫ製）を用いてワイプする。雨水堅牢性試験のための使用の前に、１リットルの水当たり、７１ｇのＣＥ１～ＣＥ３及びＩＥ１～ＩＥ６各試料を希釈する。それぞれの見本上に、アレイ状のオートピペッタを使用して、希釈されたＣＥ１～ＣＥ３及び希釈されたＩＥ１～ＩＥ６ １５滴（１５～３０マイクロリットル）を、各ＩＥ及びＣＥ当たり１つの見本で、無作為に配置する。希釈されたＩＥ及び希釈されたＣＥを、各セット５滴で、ボルテックス混合して、組成の均一性を維持する。希釈されたＩＥ１～ＩＥ６及び希釈されたＣＥ１～ＣＥ３の見本を、約２８℃のインキュベータ内で約１時間乾燥させる。
雨水堅牢性試験
ＰＡＲＡＦＩＬＭ Ｍ（商標）（ＢＥＭＩＳ ＣＯＭＰＡＮＹ製）実験室フィルムを５．０８センチメートル（「ｃｍ」）×１０．１６ｃｍの見本に切断し、黒色のＬＥＮＥＴＡ（商標）チャート（ＬＥＮＥＴＡ ＣＯＭＰＡＮＹ製）上に見本を配置することによって、雨水堅牢性試験を実施する。ＰＡＲＡＦＩＬＭ Ｍ（商標）実験室フィルムの見本を、ＫＩＭＷＩＰＥ（商標）ワイパー（ＫＩＭＢＥＲＬＹ ＣＬＡＲＫ製）を用いてワイプする。雨水堅牢性試験のための使用の前に、１リットルの水当たり、７１ｇのＣＥ１～ＣＥ３及びＩＥ１～ＩＥ６各試料を希釈する。それぞれの見本上に、アレイ状のオートピペッタを使用して、希釈されたＣＥ１～ＣＥ３及び希釈されたＩＥ１～ＩＥ６ １５滴（１５～３０マイクロリットル）を、各ＩＥ及びＣＥ当たり１つの見本で、無作為に配置する。希釈されたＩＥ及び希釈されたＣＥを、各セット５滴で、ボルテックス混合して、組成の均一性を維持する。希釈されたＩＥ１～ＩＥ６及び希釈されたＣＥ１～ＣＥ３の見本を、約２８℃のインキュベータ内で約１時間乾燥させる。
２ ＥＸＯ ＴＥＲＲＡ（商標）標準ノズルを延長せずに装着したＥＸＯ ＴＥＲＲＡ ＭＯＮＳＯＯＮ ＲＳ４００ ＲＡＩＮＦＡＬＬ ＳＹＳＴＥＭ（商標）を使用して、乾燥させた見本の各々を、加速雨水に供する。見本をスプレーノズルから３３ｃｍ離して置く。見本に対して、見本界面で５分間測定するときの、１．５リットル／時の水の流量で噴霧する。見本を空気乾燥させる。
見本当たり１つのＩＥ又はＣＥを表す１５回の乾燥液滴の各々が約０．６３ｃｍの正方形を中心となるように、各見本を切断することによって、試料を抽出する。見本ごとに得られた１５個の０．６３ｃｍの正方形をガラスバイアルに入れる。ドデシル硫酸ナトリウム溶液（１ミリリットル、２重量％ドデシル硫酸ナトリウム）を各バイアルに添加する。各バイアルを３回超音波処理し、８時間浸漬させる。
以下のように、ビシンコニン酸アッセイ（bicinchoninic acid assay、ＢＣＡ）を通じて、残留タンパク質濃度を判定する。ＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ａ及びＰＩＥＲＣＥ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｂ（両方ともＴＨＥＲＭＯ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ製）を、試薬Ａ（２ミリリットル）及び試薬Ｂ（４０マイクロリットル）で組み合わせて、試薬混合物を形成させた。各抽出試料の１００マイクロリットルをそれぞれのキュベットに入れた。次いで、試薬混合物（２ミリリットル）を各キュベットに添加し、次いで、キュベットを３０℃で約２時間インキュベートした。ＡＧＩＬＥＮＴ製のＣＡＲＹ１００（商標）ＵＶ可視分光光度計により測定された５６２ｎｍでの吸収値を用いて、残留タンパク質濃度を判定した。
ＴＷＥＥＮ（商標）２０ポリソルベート非イオン性界面活性剤の１重量％溶液を用いて、見本から試料を抽出することによって、胞子生存率を判定する。ＴＷＥＥＮ（商標）２０ポリソルベート非イオン性界面活性剤の０．１重量％溶液を使用して試料を希釈し、好適な濃度に連続希釈することにより、抽出されたＣＥ１及びＩＥ１をプレートする。抽出及び希釈されたＣＥ１及びＩＥ１試料を、寒天試料増殖プレート上で１０μＬに均一にプレートする。プレートを、３０℃のインキュベータ内で１２時間保持する。希釈倍率を考慮しながら、ログコロニー形成単位／ｍＬとして表されるコロニー数を計数する。
紫外線（「Ultraviolet Light、ＵＶ」）試験
ＣＥ１及びＩＥ１の光への曝露前後のバチルス・チューリンゲンシス活性を、以下のように判定する。
ＣＥ１及びＩＥ１の光への曝露前後のバチルス・チューリンゲンシス活性を、以下のように判定する。
オートピペッタを使用して、３０μＬの滴のＣＥ１及びＩＥ１を別個のプラスチックペトリ皿上に置き、約１時間乾燥させる。ＣＥ１及びＩＥ１を、自然日光をシミュレートするＨＡＰＲＯ製のＳＵＭＭＥＲ ＧＬＯＷ（商標）ＨＢ１７５ランプを使用して、３５ミリワット／ｃｍ２で２時間光に曝露する。ＴＷＥＥＮ（商標）２０ポリソルベート非イオン性界面活性剤の１重量％溶液を用いて、ＣＥ１及びＩＥ１をペトリ皿から抽出する。ＴＷＥＥＮ（商標）２０ポリソルベート非イオン性界面活性剤の０．１重量％溶液を使用して試料を希釈し、好適な濃度に連続希釈することにより、抽出されたＣＥ１及びＩＥ１をプレートする。抽出及び希釈されたＣＥ１及びＩＥ１試料を、寒天試料増殖プレート中で１０μＬに均一にプレートする。プレートを、３０℃のインキュベータ内で１２時間保持する。希釈倍率を考慮しながら、ログコロニー形成単位／ｍＬとして表されるコロニー数を計数する。
結果
表２は、シミュレートされた雨水条件への所与の曝露時間に対するＣＥ１～ＣＥ３及びＩＥ１～ＩＥ６のタンパク質保持率を示す。
表２は、シミュレートされた雨水条件への所与の曝露時間に対するＣＥ１～ＣＥ３及びＩＥ１～ＩＥ６のタンパク質保持率を示す。
結果によって示されるように、作物に対するバチルス・チューリンゲンシスのみの施用を表すＣＥ１は、曝露時間に関係なく、保持されたタンパク質が０であることを示し、バチルス・チューリンゲンシスの結晶タンパク質がほとんど又は全くないことを示す。ＣＥ２及びＣＥ３は、ポリエチレングリコール及びポリフェノール単独の、バチルス・チューリンゲンシスへの添加が、結晶タンパク質の雨水堅牢性を増加させることを示す。上で説明したように、フェノール及び非イオン性ポリマーシステムについての従来の理解は、フェノール及び非イオン性ポリマーが水素結合を通じて凝集し、系全体を通して両方の成分の分散性が損なわれることを示唆する。それに応じて、雨水堅牢性は、予想される凝集及び分離に起因して、２つの成分の累積加算よりも少ないことが予想されるであろう。驚くべきことに発見されたように、ＩＥ１～ＩＥ６の雨水堅牢性は、ポリフェノール及びポリエチレングリコールの両方の累積的な特性を示す。したがって、バチルス・チューリンゲンシス、ポリエチレングリコール、及びポリフェノールのＩＥ１～ＩＥ６の製剤は、ＣＥ１～ＣＥ３のいずれよりも大きな割合で結晶タンパク質を保持することによって、効果的な雨水堅牢性を示すことができることを実証している。
表３は、シミュレートされた雨水条件に曝露された所定時間後のバチルス・チューリンゲンシスの胞子の生存率を示す。
結果によって示されるように、作物に対するバチルス・チューリンゲンシスのみの施用を表すＣＥ１は、雨水堅牢性試験後、バチルス・チューリンゲンシス胞子の６８％の生存率を示す。ＩＥ１は、ポリエチレングリコール及びポリフェノールの両方のバチルス・チューリンゲンシスへの添加が、驚くべきことに、水への曝露後のバチルス・チューリンゲンシス胞子の生存率を増加させることを実証している。この結果は、結晶性タンパク質の雨水堅牢性を増加させるのに有効なポリフェノール及びポリエチレングリコールの組み合わせ系であるのみならず、バチルス・チューリンゲンシスの胞子の生存率を維持するのにも有効であることを示す。
表４は、シミュレートされた光条件に曝露された所定時間後のバチルス・チューリンゲンシスの胞子の生存率を示す。
結果によって示されるように、ＣＥ１は、シミュレートされた太陽光に曝露させた後に、バチルス・チューリンゲンシスのみを作物に施用したとき、０％の胞子生存率を示す。上で説明したように、フェノール及び非イオン性ポリマーシステムについての従来の理解は、フェノール及び非イオン性ポリマーが水素結合を通じて凝集し、系全体を通して両方の成分の分散性が損なわれることを示唆する。ポリフェノールによって提供される紫外線保護は、ポリエチレングリコールによる凝集及び分離のために最小化又は排除されることが予想されるであろう。驚くべきことに発見されたように、ＩＥ１～ＩＥ６の生存率は、ポリフェノールが依然としてバチルス・チューリンゲンシスを積極的に保護することを実証している。したがって、ＩＥ１～ＩＥ６は、バチルス・チューリンゲンシス、ポリエチレングリコール及びの製剤が、効果的な紫外線保護を示すことができることを示す。
Claims (10)
- 殺虫製剤であって、
バチルス・チューリンゲンシスと、
ポリエチレングリコールであって、ゲル浸透クロマトグラフィに従って測定されたとき、１，０００ｇ／ｍｏｌ～１２，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する、ポリエチレングリコールと、
ポリフェノールと、を含む、殺虫製剤。 - 前記ポリエチレングリコールが、ゲル浸透クロマトグラフィに従って測定されたとき、５，０００ｇ／ｍｏｌ～７，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する、請求項１に記載の殺虫製剤。
- 前記ポリエチレングリコールが、ゲル浸透クロマトグラフィに従って測定されたとき、６，０００ｇ／ｍｏｌの重量平均分子量を有する、請求項２に記載の殺虫製剤。
- 前記殺虫製剤が、前記殺虫製剤の総重量に基づいて、０．２重量％～１０重量％のポリエチレングリコールを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の殺虫製剤。
- 前記殺虫製剤が、前記殺虫製剤の総重量に基づいて、０．２重量％～５重量％のポリエチレングリコールを含む、請求項４に記載の殺虫製剤。
- 前記バチルス・チューリンゲンシスが、ｋｕｒｓｔａｋｉ亜種であるバチルス・チューリンゲンシスを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の殺虫製剤。
- 前記ポリフェノールが、フルビン酸を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の殺虫製剤。
- 前記ポリフェノールが、フミン酸を含み、前記フルビン酸とフミン酸との間の重量比が、２：１００～２０：１００である、請求項７に記載の殺虫製剤。
- 前記ポリフェノールが、フルビン酸及びフミン酸を含み、更に、フルビン酸とフミン酸との間の重量％比が、２：１００～２０：１００である、請求項１～６のいずれか一項に記載の殺虫製剤。
- 前記フルビン酸とフミン酸との間の重量％比が、８：１００～１４：１００である、請求項８に記載の殺虫製剤。
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