CN105032309B - 一种微胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微胶囊技术领域,特别涉及一种蛋白质微胶囊及其制备方法。所述微胶囊以蛋白质为芯材,以带有正负电荷的聚电解质大分子作为壁材,且所述带有正负电荷的聚电解质大分子逐层交替吸附在所述芯材的外层形成囊壁。并且本发明还提供了一种制备所述微胶囊的方法。
Description
技术领域
本发明涉及微胶囊技术领域,特别涉及一种蛋白质微胶囊及其制备方法。
背景技术
微胶囊被认为是目前最好的控制释放(controlled released)的载体工具之一,尤其在诸如药物输送、生物传感器和生物反应器等生物医药领域应用非常广泛。
微胶囊的制备方法有很多。利用层层自组装技术(layer by layer self-assemble,LbL)制备的微胶囊能够对壁材的大小、形状、组成、厚度、结构形态等进行准确的控制,因而备受关注。由于其具备新型的囊壁结构、优良的多功能性和刺激响应性,LbL技术制备的纳米及微米级胶囊在生物科学、催化、环境、食品等多种领域也具有潜在的应用价值。
然而,现阶段的LbL微胶囊一般为中空的聚电解质微胶囊。它一般是用带有相反电荷的聚电解质大分子层层交替吸附在作为模板的胶体粒子表面。胶体粒子一般采用无机材料(如CaCO3和SiO2)、有机材料(如聚苯乙烯和三聚氰胺甲醛)或金纳米粒子,甚至是细胞。然后模板通过强酸或强碱等腐蚀剂被刻蚀掉,最后得到中空的聚电解质微胶囊。这种带有多层聚电解质大分子的中空的微胶囊可通过浸泡在含有目标分子(例如小分子或蛋白质分子)的溶液中使所需封包的物质渗入到中空的聚电解质微胶囊内部,从而得到载有所需物质的聚电解质微胶囊。但是这种模板刻蚀法也存在一定的局限性。例如1)模板的刻蚀和纯化使整个制备过程变得繁琐和困难;2)目标分子需要通过渗入等步骤进入到微胶囊的内部;3)模板通常需要通过特殊方法制备成特定形状以便进行后续的自组装过程;4)去除模板过程中产生的囊内高机械压力容易导致微胶囊穿孔和破碎。
为了克服上述缺点,需要开发出一种新型的微胶囊。
发明内容
本发明提供了一种微胶囊,所述微胶囊以蛋白质为芯材,以带有正负电荷的聚电解质大分子作为壁材,且所述带有正负电荷的聚电解质大分子逐层交替吸附在所述芯材的外层形成囊壁。
本发明制备得到的微胶囊可以是以从生物体内分离纯化的单独的蛋白质为芯材的蛋白质微胶囊,也可以是以经简单分离的蛋白质和芽胞的混合物为芯材,经壁材包裹后形成以蛋白质为芯材的蛋白质微胶囊,并掺杂有被壁材包裹或者未被壁材包裹的芽胞。由于芽胞自身具有非常强的抗逆能力,例如其可以抗高温、抗干燥和抗紫外线等优点,因此,芽胞是否能够被壁材包裹不是本发明关注的问题。这种制备方法的优势在于,不仅保护了蛋白质的生物活性,而且保留了芽胞,在某些情况下,增强了微胶囊的作用效果。
现有技术中有使用蛋白质作为囊壁的示例,从一方面来讲,蛋白质作为囊壁有其自身的优点,尤其是对医药来讲,其生物相容性和可降解性均非常突出。然而,蛋白质作为壁材也存在一定的弊端,例如,其在自然环境中的稳定性能较差,尤其是当其暴露于外界环境或者在与外界环境不能较好隔离的情况下,蛋白质极易被降解而失去其作为壁材的功能。特别是当蛋白质本身为活性物质时,由于外界的紫外线、高温等因素,作为壁材的蛋白质容易失去其活性。正是出于寻找一种能够长时间保持蛋白质活性的方式,本发明突破性的选择了蛋白质直接作为芯材,而非壁材,并省去了将溶解状态的蛋白质渗入到微胶囊核心中去的过程,这不但简化了组装的过程,而且由于不再需要刻蚀芯材,消除了刻蚀芯材的弊端,因此,微胶囊的性能更加稳定。
一般来说,将蛋白质作为芯材需要满足一定的条件,例如需要蛋白质形成具有一定大小的颗粒体,才有助于接下来的组装。
因此,在一个具体实施例中,所述蛋白质为蛋白质聚集体。所述蛋白质聚集体可以是晶体蛋白质和/或包涵体蛋白质。进一步地,所述蛋白质聚集体可以是重组蛋白的包涵体、天然的聚集为特定形状的晶体蛋白质、体外结晶蛋白质或通过体外条件使蛋白质聚集成具有一定结构的蛋白质聚集体中的至少一种。从稳定性方面来讲,蛋白质的聚集体较普通形态的蛋白质更为稳定,因而制备该种类型的蛋白质微胶囊比通过溶解状态的蛋白质渗入到微胶囊中空的内部制备得到的微胶囊的使用价值更高。在一个具体实施例中,优选所述蛋白质为晶体蛋白质;进一步优选所述蛋白质为苏云金芽胞杆菌晶体蛋白质;再进一步优选所述蛋白质为苏云金芽胞杆菌立体菱形和/或球形晶体蛋白质;特别优选所述蛋白质为苏云金芽胞杆菌Cry1类和/或Cry8类晶体蛋白质。通过将蛋白质作为芯材来制备蛋白质微胶囊,尤其对于体内形成的晶体蛋白质和/或包涵体来说,由于省去了将提纯的晶体蛋白和/或包涵体溶解步骤,因而不但大大简化了蛋白质提取的复杂步骤,而且降低制备成本,并进一步提高了微胶囊的稳定性,对于进一步的应用具有潜在价值。
需要说明的是,1)在组装过程中,如果蛋白质聚集体的表面无棱角较平滑,那么组装后壁材在芯材表面的沉积比较均匀;若其为有棱角的形状,那么尖锐的棱角会在一定程度上影响微胶囊的组装效果,即对其进行的包裹不够均匀,但是使用其作为芯材形成的蛋白质微胶囊的抗逆实验效果仍然很明显。2)本发明的微胶囊在芯材的制备过程中还可以保留例如苏云金芽胞杆菌产生的芽胞。因为芽胞良好的抗逆性能,并且芽胞的存在增强了微胶囊的杀虫效果和对环境的抵抗力,因而使该微胶囊具有比其它微胶囊更显著的杀虫效果,从而进一步增加了其应用价值。
壁材是限制微胶囊应用的另一个制约因素,特别是将微胶囊制剂作为杀虫剂的情况下,需要价格便宜和/或具有生物相容性的物质作为壁材,才能使微胶囊更具使用价值。然而PAH和PSS均属于生物不相容物质,且价格较昂贵,不适合田间应用。鉴于此,在本发明中制备以生物相容性物质为壁材的微胶囊。该微胶囊能够使晶体蛋白在碱性条件释放,而在中性条件保持稳定。同时,该微胶囊能够在高温条件对晶体蛋白起到一定保护作用。因此,在一个具体实施例中,所述壁材选自带正电荷的壳聚糖和/或多聚赖氨酸,以及带负电荷的海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、硫酸软骨素和透明质酸钠等中的至少一种。在现有技术中,多以无机材料聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)为壁材,其存在价格较昂贵、生物不相容、不可生物降解等弊端,不适合田间应用的缺点。本发明制备的微胶囊使用的壁材克服了现有技术中常用壁材的缺点。
在这里,若囊壁层数较少,包裹厚度便会较薄,这样对蛋白质的保护力度就会降低。而囊壁层数过多的话,不仅在制备过程中由于反复洗涤等步骤会损失更多产品,而且也会增加不必要的工作量。并且在合适的囊壁层数下,囊内蛋白质活性能够被有效保护。因此,在一个具体实施例中,囊壁的层数N为大于或等于5的整数,优选所述囊壁的层数N为5-20的整数,特别优选所述囊壁的层数N为8-12的整数。
在一个具体实施例中,所述微胶囊的粒径为0.5-2.0μm。优选所述粒径为0.6-1.2μm。该微胶囊粒径基本为晶体蛋白质的粒径,也就是说,蛋白质微胶囊的壁材对微胶囊的粒径影响不大。本发明的微胶囊与许多模板刻蚀法制备的微胶囊和申请人已经授权的两个专利中的微胶囊相比,本发明的微胶囊粒径更小,更加适合作为杀虫剂以用于昆虫幼虫喂食以及田间喷洒。
本发明还提供了一种制备上述本发明的微胶囊的方法,所述方法包括如下步骤:1)将芯材与带有正电荷或带有负电荷的壁材在pH值为4.5-6.0的盐溶液中混匀后得到混合液1,震荡所述混合液1以在所述芯材的外层形成第一层囊壁,得到壁材层数为1的微胶囊,然后从所述混合液1中回收所述壁材层数为1的微胶囊;2)将步骤1)中回收的壁材层数为1的微胶囊与带有与步骤1)中的壁材相反电荷的壁材在pH值为4.5-6.0的盐溶液中混匀后得到混合液2,震荡所述混合液2以在所述壁材层数为1的微胶囊的外层形成第二层囊壁,得到壁材层数为2的微胶囊,然后从所述混合液2中回收所述壁材层数为2的微胶囊;循环该步骤N-2次,以获得壁材层数为N的微胶囊,其中,每重复一次则增加一层囊壁;N为大于或等于2的整数。
优选盐溶液的pH值为4.8-5.5,特别优选盐溶液为pH值4.8-5.5的氯化钠溶液。
在一个具体实施例中,所述震荡的时间大于或等于20分钟。
在探索制备本发明的蛋白质微胶囊的过程中,发明人曾经尝试了多种方法,特别是现有技术中一般认为壁材的种类是限制壁材包裹芯材的关键因素。文献研究发现,在微胶囊制备过程中,壁材的选择对于微胶囊的完整性起重要作用。1)不同的壁材组合其结合力度和电荷分布不同,形成的微胶囊的强度则不同;2)不同壁材组合相互之间的作用力不同,微胶囊在环境中的稳定性则不同,比如共价键连接的壁材比氢键连接的壁材制备的微胶囊要更稳定。另外,壁材所在缓冲液的酸碱性不同,其所带电荷则不同,壁材之间的静电吸引力度则不同,应根据实验需要的电荷情况来调节缓冲液的pH值。因此,形成微胶囊的缓冲液的种类及其pH值也可能是其中的一个因素。据此,发明人在研究过程中,主要探索使用不同种类的壁材来对蛋白质芯材进行包裹,同时也测试了改变微胶囊形成的缓冲液及缓冲液pH值等条件来制备微胶囊,然而均无法获得成功。在一个意外的情况下,发明人发现,离心转速在微胶囊制备过程中起着重要作用。在其他外在条件不变的情况下,回收微胶囊时,离心使用较高转速会导致囊壁材料在核心颗粒上的沉积作用减弱,难以形成微胶囊;而较低转速能够减少壁材因离心力而在沉积后又脱离核心的可能性。而在合适的转速下,在静电引力作用下,壁材层层沉积在核心上最终形成一种微胶囊。因此,在一个具体实施例中,所述回收为离心回收,离心的转速小于或等于3500rpm,且大于或等于1500rpm;优选离心的转速小于或等于3100rpm,且大于或等于2500rpm。
在一个具体实施例中,离心的时间为大于或等于15分钟,且小于或等于60分钟;优选所述离心的时间为大于或等于15分钟,且小于或等于30分钟。
在一个具体实施例中,混合的所述芯材与所述壁材的质量比大于或等于1:1;优选混合的所述芯材与所述壁材的质量比应该小于或等于1:2。
在一个具体实施例中,所述沉淀物1和/或所述沉淀物2被水洗至少2次。
此外,本发明还提供了一种上述本发明的蛋白质微胶囊在农业中的应用,特别是在农业病虫害防治中的应用。
附图说明
图1为扫描电镜下Cry8Ca2晶体蛋白质及实施例1制备的微胶囊的形态。其中,A为未包裹壁材的Cry8Ca2晶体蛋白质,B和C为Cry8Ca2晶体蛋白质的微胶囊。
图2为透射电镜下Cry8Ca2晶体蛋白质及实施例1制备的微胶囊的切面图。其中,A为未包裹壁材的Cry8Ca2晶体蛋白质,B和C为Cry8Ca2晶体蛋白质的微胶囊。
图3为扫描电镜下Cry1Ac晶体蛋白质和芽胞及实施例2制备的微胶囊的形态。其中,A为未包裹壁材的Cry1Ac晶体蛋白质和芽胞,B和C为Cry1Ac晶体蛋白质微胶囊和芽胞或芽胞微胶囊的混合物。
图4为实施例1制备的Cry8Ca2晶体蛋白质微胶囊体外释放的SDS-PAGE效果。其中,图4A为(壳聚糖-海藻酸钠)5微胶囊体的外释放效果,图4B为(海藻酸钠-壳聚糖)5微胶囊的体外释放效果。1为分子量参照物;2为微胶囊在蒸馏水中25℃放置6小时离心后的上清样品;3为微胶囊在pH 7.00.1M Tris-HCl缓冲液中25℃放置6小时离心后的上清样品;4为微胶囊在pH 8.00.1M Tris-HCl缓冲液中25℃放置6小时离心后的上清样品;5为微胶囊在pH9.00.1M Tris-HCl缓冲液中25℃放置6小时离心后的上清样品;6为微胶囊在pH 10.250mMNa2CO3溶液中25℃放置6小时离心后的上清样品。
图5为实施例2制备的Cry1Ac晶体蛋白质微胶囊体外释放的SDS-PAGE效果。其中,图5A为(壳聚糖/海藻酸钠)5微胶囊的体外释放效果,图5B为(海藻酸钠/壳聚糖)5微胶囊的体外释放效果。1为分子量参照物;2为微胶囊在蒸馏水中25℃放置6小时离心后的上清样品;3为微胶囊在pH 7.00.1M Tris-HCl缓冲液中25℃放置6小时离心后的上清样品;4为微胶囊在pH 8.00.1M Tris-HCl缓冲液中25℃放置6小时离心后的上清样品;5为微胶囊在pH9.00.1M Tris-HCl缓冲液中25℃放置6小时离心后的上清样品;6为微胶囊在pH 10.250mMNa2CO3溶液中25℃放置6小时离心后的上清样品。
图6为实施例1制备的Cry8Ca2晶体蛋白质微胶囊对50℃高温抵抗力的SDS-PAGE效果。其中,1、11和21为分子量参照物;2、12和22为4℃下保存的Cry8Ca2晶体蛋白质样品;3、13和23为50℃下分别保存2天、4天和6天的Cry8Ca2晶体蛋白质样品;4、14和24为50℃下分别保存2天、4天和6天的Cry8Ca2晶体蛋白质经pH 10.2的50mM的Na2CO3溶液处理并离心后的上清样品;5、15和25为4℃下保存的(壳聚糖/海藻酸钠)5微胶囊;6、16和26为50℃下分别保存2天、4天和6天的(壳聚糖/海藻酸钠)5微胶囊;7、17和27为50℃下分别保存2天、4天和6天的(壳聚糖/海藻酸钠)5微胶囊经pH 10.2的50mM的Na2CO3溶液处理并离心后的上清样品;8、18和28为4℃下保存的(海藻酸钠/壳聚糖)5微胶囊样品;9、19和29为50℃下分别保存2天、4天和6天的(海藻酸钠/壳聚糖)5微胶囊样品;10、20和30为50℃下分别保存2天、4天和6天的(海藻酸钠/壳聚糖)5微胶囊经pH 10.2的50mM的Na2CO3溶液处理并离心后的上清样品。
图7为实施例2制备的Cry1Ac晶体蛋白质微胶囊对50℃高温抵抗力SDS-PAGE效果。其中,1、11和21为分子量参照物;2、12和22为4℃下保存的Cry1Ac晶体蛋白质样品;3、13和23为50℃下分别保存2天、4天和6天的Cry1Ac晶体蛋白质样品;4、14和24为50℃下分别保存2天、4天和6天的Cry1Ac晶体蛋白质经pH 10.2的50mM的Na2CO3溶液处理并离心后的上清样品;5、15和25为4℃下保存的(壳聚糖-海藻酸钠)5微胶囊样品;6、16和26为50℃下分别保存2天、4天和6天的(壳聚糖/海藻酸钠)5微胶囊样品;7、17和27为50℃下分别保存2天、4天和6天的(壳聚糖/海藻酸钠)5微胶囊经pH 10.2的50mM的Na2CO3溶液处理并离心后的上清样品;8、18和28为4℃下保存的(海藻酸钠/壳聚糖)5微胶囊样品;9、19和29为50℃下分别保存2天、4天和6天的(海藻酸钠/壳聚糖)5微胶囊样品;10、20和30为50℃下分别保存2天、4天和6天的(海藻酸钠/壳聚糖)5微胶囊经pH 10.2的50mM的Na2CO3溶液处理并离心后的上清样品。
具体实施方式
下面以苏云金苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)的杀虫晶体蛋白质作为靶标蛋白质芯材结合实施例和附图对本发明做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
Bt是一种革兰氏阳性菌,其营养细胞在稳定期后期产生芽胞的同时能产生具有杀虫活性的碱溶性的晶体蛋白质——伴胞晶体(也可以称作蛋白质晶体,或简称为晶体),又称杀虫晶体蛋白质。不同的Bt菌株能够产生不同类型的伴胞晶体,有立体菱形、球形、双锥形、立方体、椭球形、不规则形等形状。随着菌体裂解,伴胞晶体释放到胞外,发挥杀虫作用。从Bt中分离的不同种类的伴胞晶体具有不同的杀虫谱,现已发现的杀虫谱主要有鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、半翅目、同翅目、直翅目等。伴胞晶体进入靶标昆虫中肠后,会被中肠中的碱性环境溶解为原毒素,原毒素经胰蛋白酶处理后转变为活性毒素,活性毒素能够与昆虫中肠上皮的特异性受体蛋白结合并形成孔道,破坏昆虫细胞渗透压致昆虫死亡。基于其独特的杀虫方式,Bt菌株具有特异性强、不破坏环境、对人畜无害等特点,是一种环境友好型的杀虫剂。同时,Bt菌株代表了约95%的用于农作物害虫生物防治的微生物,被广泛应用于农作物保护领域,是最主要的微生物杀虫剂。然而,外界环境中存在许多诸如紫外辐射、高温照射、雨水冲刷等不确定性因素,会导致Bt伴胞晶体不稳定甚至失活,影响其田间应用。
为了提高Bt晶体蛋白质在环境中的稳定性和/或延长杀虫活性的持效期,各种Bt制剂应运而生,不仅提高了农作物产量,而且有效减少了化学农药的使用。作为Bt制剂的一种,微胶囊剂型因其良好的控释性能而受到关注。将其应用于Bt杀虫晶体蛋白质的保护,能够有效解决微生物杀虫剂的抗逆性和田间使用的持效性等问题。在现有技术中,已利用基于相反电荷相互作用的LbL技术制备了两种装载Bt原毒素的微胶囊,但其均以无机材料聚丙烯胺盐酸盐(PAH)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)为壁材,存在价格较昂贵、生物不相容、不可生物降解等弊端,不适合田间应用。
需要说明的是,本专利中利用的壳聚糖根据其脱乙酰度(DD)的不同而分为两种,一种为90%DD的壳聚糖,另一种为95%DD的壳聚糖。壳聚糖是甲壳素(chitin)脱去50%以上的乙酰基后制备形成的天然高分子多糖。脱乙酰化程度不同,则壳聚糖分子链中伯氨基数目不同。脱乙酰度是壳聚糖材料的重要参数,能够影响其理化性质(溶解度、结晶度、溶胀性能、机械性能)和生物学特性(蛋白质吸收能力)。脱乙酰度越高,壳聚糖的拉伸强度和弹性越高,但其脆性也越高。
实施例1
A)芯材的制备
Cry8Ca2球形晶体蛋白质和芽胞混合物的提取的过程或参考Ke Luo,DavidBanks,Michael J.Adang.Toxicity,binding,and permeability analyses of fourBacillus thuringiensis Cry1 delta-endotoxins using brush border membranevesicles of Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda.Appl Environ Microb,1999,65:457–464进行。需要说明的是,该方法提取到的是晶体蛋白质和芽胞的混合物。因为芽胞萌发后也可发挥杀虫作用,并且其具有较强的抗逆能力,同时也不影响蛋白质晶体作为芯材被壁材包裹,故利用晶体蛋白质进行微胶囊制备前可以不用去除芽胞。但在本实施例中采用除去芽胞而使用纯的蛋白质晶体作为芯材被包裹。
晶体蛋白质与芽胞的分离过程或参考Jihane Rahbani Mounsef,DominiqueSalameh,Mireille kallassy Awad,Laure Chamy,Cedric Brandam,RogerLteif.A simplemethod for the separation of Bacillus thuringiensis spores and crystals.JMicrobiol Meth,2014,107:147-149进行。
1.0mg/ml Cry8Ca2晶体蛋白质:50mg Cry8Ca2晶体蛋白质溶于50ml蒸馏水中。其中,蛋白质的浓度为利用SDS-PAGE进行蛋白质电泳后测定的蛋白质浓度。
取10ml如上配制的1.0mg/ml Cry8Ca2球形晶体蛋白质溶液,6000rpm离心20分钟(min),弃上清。将沉淀物水洗后再6000rpm离心20min,弃上清,重复1-2次。其中的沉淀物即为Cry8Ca2球形晶体蛋白质。
B)蛋白质微胶囊的制备
0.5M NaCl溶液:称取11.69g NaCl溶于400ml蒸馏水中;
1.0mg/ml 90%DD的壳聚糖溶液(pH 5.0):称取0.2g壳聚糖溶于200ml 0.5M NaCl溶液中,用HCl调节pH至5.0。
1.0mg/ml海藻酸钠溶液(pH 5.0):称取0.2g海藻酸钠溶于200ml 0.5M NaCl溶液中,用HCl调节pH至5.0。
取10ml上述制备的1.0mg/ml的壳聚糖溶液与Cry8Ca2球形晶体蛋白质的沉淀物混匀,利用定轨振荡器在70rpm/min下震荡20min。离心,3000rpm,15min,弃上清。将沉淀物悬浮水洗后离心,3000rpm,15min,弃上清,重复2-3次。此为第1层囊壁。
取10ml 1.0mg/ml海藻酸钠与上述沉淀混匀,震荡20min。离心,3000rpm,15min。弃上清。将沉淀物悬浮水洗后离心,3000rpm,15min,弃上清,重复2-3次。此为第2层囊壁。
重复上述步骤,依次组装第3-9层囊壁,囊壁从内向外的顺序为:壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖。
最终得到以Cry8Ca2球形晶体蛋白质为芯材,以从内向外的壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为9层。
实施例2
芯材的制备:Cry1Ac立体菱形晶体蛋白质和芽胞的混合物的提取的过程或参考KeLuo,David Banks,Michael J.Adang.Toxicity,binding,and permeability analyses offour Bacillus thuringiensis Cry1 delta-endotoxins using brush border membranevesicles of Spodoptera exigua and Spodoptera frugiperda.Appl Environ Microb,1999,65:457–464进行。
1.0mg/ml Cry1Ac立体菱形晶体蛋白质和芽胞的混合物:50mg Cry1Ac晶体蛋白质和芽胞的混合物溶于50ml蒸馏水中。其中的浓度为蛋白质的浓度,且浓度的确定方法为为利用SDS-PAGE进行蛋白质电泳后测定的蛋白质浓度。
取10ml如上配制的1.0mg/ml Cry1Ac晶体蛋白质和芽胞的混合物溶液,6000rpm离心20分钟(min),弃上清。将沉淀物水洗后再6000rpm离心20min,弃上清,重复1-2次。其中的沉淀物即为Cry1Ac晶体蛋白质和芽胞的混合物。
以Cry1Ac晶体蛋白质和芽胞的混合物为芯材。
其他同实施例1。
最终得到以Cry1Ac晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(壳聚糖-海藻酸钠)5的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为10层。且制备得到的蛋白质微胶囊中掺杂有芽胞或被壁材包裹的芽胞微胶囊。
实施例3
以95%DD的壳聚糖和海藻酸钠为壁材,其他同实施例2。
最终得到以Cry1Ac晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(壳聚糖-羧甲基纤维素钠)5的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为10层。且制备得到的蛋白质微胶囊中掺杂有芽胞或被壁材包裹的芽胞微胶囊。
实施例4
以90%DD的壳聚糖和羧甲基纤维素钠为壁材,其他同实施例2。
最终得到以Cry1Ac晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(壳聚糖-羧甲基纤维素钠)5的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为10层。且制备得到的蛋白质微胶囊中掺杂有芽胞或被壁材包裹的芽胞微胶囊。
实施例5
以Cry8Ca2球形晶体蛋白质和芽胞的混合物为芯材。Cry8Ca2球形晶体蛋白质和芽胞的混合物的提取方法同实施例2。
以海藻酸钠为第一层囊壁,90%DD的壳聚糖为第二层囊壁的顺序组装蛋白质微胶囊。
其他同实施例1。
最终得到以Cry8Ca2晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(海藻酸钠-壳聚糖)5的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为10层。且制备得到的蛋白质微胶囊中掺杂有芽胞或被壁材包裹的芽胞微胶囊。
实施例6
以Cry1Ac晶体蛋白质和芽胞的混合物为芯材,其他同实施例3。
最终得到以Cry1Ac立体菱形晶体蛋白质为芯材,以从内向外的海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为9层。且制备得到的蛋白质微胶囊中掺杂有芽胞或被壁材包裹的芽胞微胶囊。
实施例7
包裹的层数为5层,其他同实施例1。
最终得到以Cry8Ca2晶体蛋白质为芯材,以从内向外的壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠-壳聚糖的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为5层。
实施例8
包裹的层数为8层,其他同实施例1。
最终得到以Cry8Ca2晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(壳聚糖-海藻酸钠)4的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为8层。
实施例9
包裹的层数为12层,其他同实施例1。
最终得到以Cry8Ca2晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(壳聚糖-海藻酸钠)6的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为12层。
实施例10
包裹的层数为20层,其他同实施例1。
最终得到以Cry8Ca2晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(壳聚糖-海藻酸钠)10的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为20层。
实施例11
以90%DD的壳聚糖和硫酸软骨素为壁材,其他同实施例1。
最终得到以Cry8Ca2晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(壳聚糖-硫酸软骨素)5的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为10层。
实施例12
以90%DD的壳聚糖和透明质酸钠为壁材,其他同实施例1。
最终得到以Cry8Ca2球形晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(壳聚糖-透明质酸钠)5的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为10层。
实施例13
以多聚赖氨酸和海藻酸钠为壁材,其他同实施例1。
得到以Cry8Ca2晶体蛋白质为芯材,以从内向外的(多聚赖氨酸-海藻酸钠)5的顺序组装的蛋白质微胶囊。该蛋白质微胶囊的囊壁为10层。
实施例14
配制50mM Na2CO3溶液(pH 10.2):称取0.53g Na2CO3溶于100ml蒸馏水中,用HCl调节pH至10.2。
分别配制pH7.0、pH8.0和pH9.0的0.1M Tris-HCl缓冲液。
I)蛋白质微胶囊的电子显微镜下的形态
采用常规方法,将合成的蛋白质微胶囊样品或晶体蛋白质样品或晶体蛋白质与芽胞的混合物样品(对照样品)悬浮液置于干净锡箔纸上并自然晾干,之后利用溅射镀膜机对样品喷金。将喷金后的样品置于扫描电镜(SEM)内观察。
采用常规方法,将合成的蛋白质微胶囊样品或晶体蛋白质样品(对照样品)用2.5%戊二醛固定,用乙醇和丙酮进行常规的梯度洗脱,然后包埋在树脂混合物中,然后利用超薄切片机进行切片,利用醋酸双氧铀、柠檬酸铅进行染色。将处理后的样品置于透射电镜(TEM)内观察。
图1为实施例1制备的蛋白质微胶囊及未包裹壁材的晶体蛋白质的对照样品的扫描电镜形态图;图2为实施例1制备的蛋白质微胶囊及未包裹壁材的晶体蛋白质的对照样品的透射电镜形态图。从图中可以看出,对照样品,即晶体蛋白质或晶体蛋白质与芽胞的混合物中的晶体蛋白质的表面较为光滑(图1A和图3A),而蛋白质微胶囊的表面粗糙(图1B、1C、3B和3C),该图像证明晶体蛋白质被成功地组装成微胶囊。包裹球形晶体蛋白质的微胶囊呈球形,包裹立体菱形晶体蛋白质的微胶囊呈立体菱形。蛋白质微胶囊的粒径约为0.6-1.2μm。
本发明制备的微胶囊的尺寸较小,并且微胶囊之间及微胶囊与芽胞或芽胞微胶囊之间黏连性较小,适合喂食昆虫。其中,在进行扫描电镜观察的过程中,扫描电镜图中都有标尺,可以根据标尺和晶体图片推算出晶体粒径大小。
图2为实施例1制备的微胶囊及未包裹壁材的晶体蛋白质的对照样品的透射电镜形态图。
图2A为未包裹壁材的晶体蛋白质在透射电镜下的切面图,图2B和2C为蛋白质微胶囊在透射电镜下的切面图。从图中可以看出,相比于晶体蛋白质的图像,图2B和2C中的图像呈现出晶体蛋白质的外层包裹有一层较薄的白色薄膜,该白色薄膜即为微胶囊的囊壁,该图像佐证了晶体包裹成功。
II)蛋白质微胶囊对蛋白质的体外控释情况
将制备的微胶囊的悬浮液分装成等量的5份样品,然后对所述样品3000rpm离心15min,然后弃去上清。向每个沉淀物中分别加入等量的蒸馏水、0.1M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)、0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)、0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)、和50mM Na2CO3溶液(pH 10.2),震荡混匀。在20℃-37℃的温度范围,优选为20℃-30℃的温度范围,放置6小时后将悬浮液12000rpm离心20min,然后取上清进行SDS-PAGE,以检测蛋白质释放效果。
通常情况下,晶体蛋白质在碱性环境中会裂解为可溶性的原毒素。因此,设定不同pH的碱性环境作为测定晶体从微胶囊中释放的引发条件,利用SDS-PAGE检测释放效果(图4、图5)。从图4A和4B的图中可以看出,泳道2中均无可见条带,表明实施例1制备的微胶囊在水溶液中能够保持稳定;泳道3-5中均无可见条带,表明实施例1制备的微胶囊在pH 7.0-9.0环境中保持稳定,不释放晶体蛋白质;而泳道6中均有明显条带,说明其相对应的上清液样品中含有大量释放的蛋白质,并且该蛋白质的分子量与靶标蛋白质Cry8Ca2的分子量相吻合,表明Cry8Ca2晶体蛋白质微胶囊在pH 10.2环境中能够控制释放晶体蛋白质。同样,图5A和5B两图中,泳道2中均无可见条带,表明实施例2制备的微胶囊在水溶液中能够保持稳定;泳道3-4中均无可见条带,表明实施例2制备的微胶囊在pH 7.0-8.0环境中保持稳定,不释放晶体蛋白质;泳道5-6中均有明显条带,其上清液含有大量释放的蛋白质,表明Cry1Ac晶体微胶囊在pH 9.0以上的环境中能够控制释放晶体蛋白质。该结果证明,以壳聚糖和海藻酸钠为壁材通过层层自组装制备的包裹伴胞晶体的微胶囊能够在特定碱性环境中控释,而在中性环境中保持稳定。
其他实施例制备的微胶囊也取得了类似的效果。
III)蛋白质微胶囊在50℃的高温下的抗逆性
将0.8-1.2mg/ml的与微胶囊中的蛋白质相同的蛋白质作为对照样品与0.8-1.2mg/ml的蛋白质微胶囊共同在50℃恒温箱中保存。并对保存2天、4天和6天的样品取样后置于负30℃或负70℃的冰箱中保存备用,以便进行后续的SDS-PAGE检测。之后将样品3000rpm离心15min,然后弃上清。并分别向沉淀中加入等量的50mM Na2CO3溶液(pH 10.2),震荡混匀。在20℃-37℃,优选为20℃-30℃的温度范围放置6小时后将悬浮液12000rpm离心20min,然后取上清进行SDS-PAGE,以检测蛋白质释放效果。
伴胞晶体本身在高温环境不稳定,易失活。50℃高温环境较极端,将伴胞晶体与微胶囊分别置于50℃高温环境处理,利用SDS-PAGE检测微胶囊的抵抗效果(图6、图7)。图6和图7中,泳道3、6、9、13、16、19、23、26和29中均有明显条带,表明伴胞晶体与微胶囊在50℃高温环境均有一定稳定性,不易降解;泳道4、14和24中条带浓度逐渐变浅至无可见条带,表明伴胞晶体在50℃高温处理后逐渐以无活性的沉淀形式存在,在碱性环境不可溶;而泳道7、17和27以及10、20和30中均有明显条带,其上清液含有大量可溶性蛋白质,表明微胶囊在50℃高温环境对伴胞晶体有保护作用。该结果证明,虽然伴胞晶体在高温环境未降解,但几乎全部以无活性的沉淀形式存在,而以壳聚糖和海藻酸钠为壁材通过层层自组装制备的包裹伴胞晶体的微胶囊对伴胞晶体有一定保护作用,能够抵抗50℃高温环境,防止碱溶性的晶体蛋白质大幅度失活。
Ⅳ)微胶囊的生物活性测试
将实施例2、3和4制备的微胶囊稀释为7个梯度分别于与亚洲玉米螟敏感系(ACB-BtS)的饲料均匀混合。混合好的饲料平均放入48孔培养板的每一个孔中,每孔1只初孵幼虫,每个浓度按上述方法做3个重复。并以通过上述方法提取的Cry1Ac晶体与芽胞的混合物作为阳性对照,水作为阴性对照利用相同的方法进行生物活性测试。在适宜条件下培养7天后,记录各组中幼虫的存活与死亡个数,并依此计算其半致死浓度(LC50),见表1。
选择上述7个浓度中比LC50高的那个浓度,对其在50℃条件下处理的Cry1Ac晶体与芽胞的混合物及Cry1Ac晶体微胶囊进行生物活性测定,处理方法与上述相同。培养7天后计算各组的致死率,见表2;同时,对各组中存活幼虫的体重进行测量并比较差异,见表3。
从表1的LC50测定结果显示,利用不同材料包裹的Cry1Ac晶体微胶囊与未作为对照的未包裹的晶体和芽胞混合物对靶标昆虫具有相似的杀虫活性,说明微胶囊壁材未影响到杀虫蛋白发挥杀虫效果,从而进一步证明该微胶囊可以应用于农业生产。
50℃条件下处理作为对照组的Cry1Ac晶体和芽胞的混合物及作为实验组的Cry1Ac晶体微胶囊后的致死率测定结果显示:未包裹壁材的晶体和芽胞的混合物与利用不同材料作为壁材进行包裹的微胶囊在50℃条件下均有杀虫活性,但是实验组的杀虫活性普遍地显著高于对照组,特别是实施例2和实施例3制备的微胶囊显著高于Cry1Ac晶体和芽胞的混合物。之所以出现该结果,是因为该微胶囊掺杂有芽胞或芽胞微胶囊。一方面微胶囊能够保护囊内蛋白质不被高温破坏而失活,另一方面芽胞能够抵抗高温而在其萌发后发挥毒性,二者共同发挥作用致幼虫死亡率较高。但是,对于未包裹壁材的Cry1Ac晶体和芽胞的混合物而言,50℃的处理可使蛋白质晶体失去活性,不过由于芽胞能够抵抗高温,因而其在高温处理下仍具有一定的活性。此外,50℃处理的对照组明显比室温下处理的对照组的死亡率低,即差异显著(P≤0.05);而50℃处理的实验组与室温下处理的相对应的实验组在处理前后的死亡率差异不显著(P≥0.05)(表2)。同时,室温处理的未包裹壁材的Cry1Ac晶体和芽胞的混合物与50℃处理后的实施例2和实施例3制备的微胶囊的杀虫活性差异不显著,而与50℃处理后的实施例4微胶囊的杀虫活性差异显著。这些结果表明,微胶囊内的晶体在高温下没有受到破坏,保持了较好的杀虫活性而与芽胞共同在幼虫体内发挥杀虫效果。但是,不同材料制备的微胶囊对50℃环境的抵抗力不同,导致其杀虫效果不同。
另外,体重测量结果显示,经50℃处理前后的微胶囊喂养的幼虫的体重差异不显著,而使用50℃处理后的晶体和芽胞的混合物喂养的幼虫的体重明显比室温下的晶体和芽胞的混合物喂养的幼虫的体重大,说明50℃处理后的晶体和芽胞的混合物对幼虫生长的抑制作用较弱(表3)。同时,虽然经卡方检验差异不显著,但是室温处理的晶体和芽胞的混合物与50℃处理后的不同材料制备的微胶囊喂养的幼虫的体重有所区别。结果显示,50℃处理后的微胶囊与作为对照的室温处理的未包裹壁材的晶体和芽胞的混合物对幼虫生长的抑制作用强度相当,且都比50℃处理后的晶体和芽胞的混合物的抑制强度大,说明高温对微胶囊内的晶体蛋白质破坏力度不大,蛋白质作用效果未受到影响。
死亡率和体重抑制研究发现,不同材料制备的微胶囊能够在不同程度上抵抗高温环境,对微胶囊内的晶体蛋白质起到保护作用。
其他实施例制备的微胶囊也取得了类似的效果,但是微胶囊的囊壁在8层或以上,其生物活性基本一致,并优于8层以下的微胶囊制剂。
表1 Cry1Ac晶体蛋白质及其微胶囊的LC50
表2 50℃处理前后的Cry1Ac晶体蛋白质及微胶囊致死率
表3 50℃处理前后的Cry1Ac晶体蛋白质及微胶囊生物学活性测定中的昆虫体重比较
Claims (9)
1.一种制备用于防治病虫害的微胶囊的方法,所述方法包括如下步骤:
1)将芯材与带有正电荷或带有负电荷的壁材在pH值为4.5-6.0的盐溶液中混匀后得到混合液1,震荡所述混合液1以在所述芯材的外层形成第一层囊壁,得到壁材层数为1的微胶囊,然后从所述混合液1中回收所述壁材层数为1的微胶囊;
2)将步骤1)中回收的壁材层数为1的微胶囊与带有与步骤1)中的壁材相反电荷的壁材在pH值为4.5-6.0的盐溶液中混匀后得到混合液2,震荡所述混合液2以在所述壁材层数为1的微胶囊的外层形成第二层囊壁,得到壁材层数为2的微胶囊,然后从所述混合液2中回收所述壁材层数为2的微胶囊;循环该步骤N-2次,以获得壁材层数为N的微胶囊,其中,每重复一次则增加一层囊壁;N为8-12的整数;
其中,所述回收为离心回收,离心的转速小于或等于3100rpm,且大于或等于2500rpm;
所述微胶囊的粒径为0.6-1.2μm;
混合的所述芯材与所述壁材的质量比大于或等于1:1,且小于或等于1:2;
所述微胶囊以蛋白质为芯材,以带有正负电荷的聚电解质大分子作为壁材,且所述带有正负电荷的聚电解质大分子逐层交替吸附在所述芯材的外层形成囊壁;所述蛋白质为苏云金芽胞杆菌晶体蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述壁材选自带正电荷的壳聚糖和/或多聚赖氨酸,以及带负电荷的海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、硫酸软骨素和透明质酸钠中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述盐溶液的pH值为4.8-5.5。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述盐溶液为pH值4.8-5.5的氯化钠溶液。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述震荡的时间大于或等于20分钟。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,离心的时间为大于或等于15分钟,且小于或等于60分钟。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述离心的时间为大于或等于15分钟,且小于或等于30分钟。
8.一种如权利要求1-7任意一项所述的方法制备得到的微胶囊在农业中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述应用为在农业病虫害防治中的应用。
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