JPWO2013065791A1 - 遺伝子発現抑制用二本鎖核酸分子 - Google Patents
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Abstract
18〜28塩基長のアンチセンス鎖、及びアンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5'末端に2〜100塩基長の一本鎖突出部分とを含む、センス鎖を含み、該相補的部分を介してセンス鎖とアンチセンス鎖が塩基対合する遺伝子発現抑制用二本鎖核酸分子、及びその製造方法、並びに該二本鎖核酸分子を有効成分として含有する医薬組成物。
Description
アンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5'末端に2〜100塩基長の一本鎖突出部分とを含む、センス鎖
を含み、
該相補的部分を介してセンス鎖とアンチセンス鎖が塩基対合する
遺伝子発現抑制用二本鎖核酸分子。
(a)標的遺伝子の標的配列に対して十分に相補的な配列を含むアンチセンス鎖を設計するか、又はmiRNAであるアンチセンス鎖を選択する工程、
(b)アンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5'末端に一本鎖突出部分とを含むセンス鎖を設計する工程、
(c)アンチセンス鎖及びセンス鎖を合成する工程、並びに
(d)合成されたアンチセンス鎖及びセンス鎖を塩基対合させる工程
を含む、前記方法。
1−1.概要
本発明の第1の態様は、遺伝子発現抑制用二本鎖核酸分子である。本発明の二本鎖核酸分子は、アンチセンス鎖、及びアンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5'末端に一本鎖突出部分とを含むセンス鎖を含むことを特徴とする。
本明細書において「核酸」とは、天然型核酸、非天然型核酸及び/又は核酸類似体をいう。
本発明に係る二本鎖核酸分子は、後述のアンチセンス鎖及びセンス鎖を含んでなり、その典型的な模式図(2本の核酸分子からなる場合)を図1Aに示す。なお、本明細書におけるアンチセンス鎖は、一般にsiRNA及びmiRNAの場合にはそれぞれガイド鎖及びmiRNA鎖と称される鎖に対応し、本明細書におけるセンス鎖はそれぞれパッセンジャー鎖及びmiRNA*(miRNAスター)鎖と称される鎖に対応する。本発明に係る二本鎖核酸分子は、細胞内又は生体内において遺伝子サイレンシングを誘導することによって、特定の遺伝子の発現を転写段階及び/又は転写後段階で抑制することができる。
上記二本鎖核酸分子は、当業者であれば容易に設計し、製造することができる。具体的には、上記二本鎖核酸分子を製造する方法は、
(a)標的遺伝子の標的配列に対して十分に相補的な配列からなるアンチセンス鎖を設計するか、又はmiRNAであるアンチセンス鎖を選択する工程、
(b)アンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5'末端に一本鎖突出部分とを含むセンス鎖を設計する工程、
(c)アンチセンス鎖及びセンス鎖を合成する工程、並びに
(d)合成されたアンチセンス鎖及びセンス鎖を塩基対合させる工程
を含む。
上記二本鎖核酸分子は、細胞、組織又は個体において遺伝子発現を抑制する方法に使用することができる。この方法は、細胞、組織又は個体に上記のように製造された二本鎖核酸分子を導入する工程、又は本発明の二本鎖核酸分子を発現するベクターを導入する工程を含む。
本発明に係る二本鎖核酸分子を用いれば、遺伝子サイレンシングを誘導することによって細胞、組織又は個体において配列特異的に遺伝子発現を抑制することができる。特に、センス鎖がリボデオキシヌクレオチドからなる場合に著しく高い遺伝子発現抑制活性が見込まれる。一方、センス鎖がデオキシリボヌクレオチドからなる場合、従来技術では遺伝子発現抑制活性はほとんど見られなかったが、本発明の二本鎖核酸分子は遺伝子発現を有意に抑制することができる。さらにこの場合、製造コストを大きく低下させるという利点が期待できる。
2−1.概要
本発明の第2の態様は、有効成分として前記態様1の二本鎖核酸分子を含む医薬組成物である。この組成物は、被検体において疾患の予防用及び/又は治療用に使用することができる。
一実施形態では、医薬組成物の有効成分である本発明の二本鎖核酸分子に含まれるアンチセンス鎖は、予防及び/又は治療対象の疾患に関与する遺伝子の発現を抑制することができるものであってよい。予防及び/又は治療対象の疾患として、具体的には、APC遺伝子(大腸癌)、BRCA1/BRCA2遺伝子(乳癌)等が関与する癌、PS1遺伝子(アルツハイマー)等が関与する神経変性症、LPL遺伝子(高脂血症)、INS/INSR遺伝子(糖尿病)等が関与する疾患が挙げられる。予防及び/又は治療対象となる癌としては、例えば、胃癌、食道癌、大腸癌、肝細胞癌、膵癌、胆管癌、乳癌、肺癌、肺腺癌、腎癌、前立腺癌、膀胱癌、子宮体癌、子宮頚癌、甲状腺癌、卵巣癌、皮膚癌、白血病、骨髄腫、リンパ腫、リンパ肉腫等が含まれる。また、ウイルスや細菌等の感染症において、本発明の二本鎖核酸分子をウイルス遺伝子又は細菌遺伝子の発現を抑制するために用いることができる。ウイルス及び細菌としては、HIV、HBV、HCV、HTLV-1、HTLV-2、インフルエンザウイルス、SARSコロナウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、腸管出血性大腸菌、結核菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、緑膿菌、溶連菌、カンジダ、ヘリコバクターピロリ等が挙げられる。これらの全部又は部分的なゲノム配列と遺伝子情報は公知であり、該ゲノムおよび遺伝子情報に従って、標的配列を選択し、それにより、医薬組成物の有効成分である本発明の二本鎖核酸分子を構成するアンチセンス鎖を設計することができる。
本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患の治療のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、例えばヒトである。
本発明の二本鎖核酸分子を有効成分として含む医薬組成物は、低用量かつコストの安い遺伝子発現抑制剤として有効であり、アンチセンス鎖の配列を適切に設計することによって、様々な遺伝子の発現を抑制することが期待され、幅広い疾患の予防及び/又は治療に適用できる。さらに、通常のsiRNAは二重鎖RNAの認識により自然免疫応答を引き起こすことが知られているが、本発明の二本鎖核酸分子はこのような副作用がほとんどなく、安全性の高い医薬組成物を提供することができる。
以下の実施例で使用したオリゴヌクレオチドの配列を表1−1、1−2、2−1、2−2及び3に示す。アンチセンス鎖は3'-5'方向に、センス鎖は5'-3'方向に示す(双方の鎖で塩基対合する塩基の位置をそろえて表示する)。大文字はデオキシリボヌクレオチドを、小文字はリボヌクレオチドを示す。斜体太文字はセンス鎖に含まれる一本鎖突出部分を、下線太文字はセンス鎖上のアンチセンス鎖に対するミスマッチ塩基を示す。
pDsRed2-C1(Clontech社、カタログ番号632407)のマルチクローニングサイト(1288位〜1363位)を改変して5'-AGATCTCGAGAAGCTTAGATATCGTCGACCCGGGATCCACCGGATCTAGATAACTGA-3'(配列番号3)としたpDsRed2ERVSMAを作製した。作製に用いた遺伝子工学的手法、例えば、プラスミドDNAの抽出・精製、コンピテントセルの調製、大腸菌の形質転換、DNAクローニング、リガーゼ反応等は標準の手順(Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Now York)に従った。この配列はDsRed2タンパク質のC末端としてArg-Ser-Arg-Glu-Ala-翻訳停止コドンをコードし、その直後にEcoRV部位(GATATC)を有する。pDsRed2ERVSMAをEcoRVで切断した平滑末端に、5'-GTAGGAGCTACAGTGCTTCATCTCAGAGCTACAGTGCTTCATCTCAGAGCTACAGTGCTTCATCTCA-3'(配列番号4)/5'-TGAGATGAAGCACTGTAGCTCTGAGATGAAGCACTGTAGCTCTGAGATGAAGCACTGTAGCTCCTAC-3'(配列番号5)又は5'-GTAGCAACGTTGAGGAAGGTGACTGCCAACAACGTTGAGGAAGGTGACTGCCAACAACGTTGAGGAAGGTGACTGCCAA-3'(配列番号6)/5'-TTGGCAGTCACCTTCCTCAACGTTGTTGGCAGTCACCTTCCTCAACGTTGTTGGCAGTCACCTTCCTCAACGTTGCTAC-3'(配列番号7)をアニーリングさせたDNA鎖を連結し、それぞれpDsRed2-miR143標的及びpDsRed2-siPolR2A標的を作製した。これらの連結した配列には、miR-143(配列番号1)又はsiPolR2A-AS(配列番号2)に完全に相補的な配列が3回繰り返して設計されている。
特に断りがない限り、二本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制活性は次のように測定した。
pDsRed2-miR143標的及びpDsRed2-siPolR2A標的にはCMVプロモータ下流にDsRed2遺伝子がある。この遺伝子の3'-非翻訳領域(3'-UTR)には、活性測定対象の二本鎖核酸分子に含まれるアンチセンス鎖に完全に相補的な配列が3回繰り返して設計されている。アンチセンス鎖によって、標的配列を3'-UTRに有するDsRed2の遺伝子サイレンシングが誘導され、発現が著しく抑制される。このプラスミドと同時にトランスフェクションしたGFP発現ベクターpCAGGS-AFPからの蛍光を用いて、導入効率の違いを補正する(GFPは二本鎖核酸分子の活性に関わらず発現する)。対照siRNAを用いた場合の比「DsRed2蛍光/GFP蛍光」を1としたときの、各二本鎖核酸分子を用いた場合の比「DsRed2蛍光/GFP蛍光」は、二本鎖核酸分子の遺伝子発現抑制活性がある場合、1以下の値を取る。実験毎に値は変動するが、典型的には、この値が0.2以下の場合に十分な遺伝子発現抑制活性があるとみなす。この値を正規化DsRed2/GFP比(相対値)とした。
(5'突出部分を有するDNAセンス鎖)
(1)5'突出部分を有するDNAセンス鎖を用いた場合の遺伝子発現抑制活性
天然型miRNA/miRNA*二本鎖を用いて、上記活性測定法によって遺伝子発現抑制活性を確認した。miR-143(配列番号1)/miR143*(配列番号10)(表1−1)を用いたところ、濃度の増加に伴って正規化DsRed2/GFP比は低下し、濃度依存的な遺伝子発現抑制活性が見られた(図3、miR-143*)。
様々なDNAセンス鎖を作製して、さらに活性を評価した。
突出部分をさらに改変して遺伝子発現抑制活性を調べた。なおここでは、アンチセンス鎖としてsiPolR2A-ASを用い、DNAセンス鎖の一本鎖突出部分を改変し、測定方法は以下のとおり行った。
(5'突出部分を有するRNAセンス鎖)
(1)5'突出部分を有するRNAセンス鎖を用いた場合の高い遺伝子発現抑制活性
実施例1では、5'突出部分を有するDNAセンス鎖を用いるとRNAアンチセンス鎖による遺伝子発現抑制活性が見られることが明らかとなった。実施例2では、5'突出部分を有するRNAセンス鎖を用いた場合の活性を評価した。
様々なRNAセンス鎖を作製して、さらに活性を評価した。
ここまでの実施例では、断りがない限り上述の「遺伝子発現抑制活性の測定法」に従って活性を評価した。異なるアッセイ系でも同様の結果が得られることを確かめるために、正規化用に使用したGFPと、遺伝子発現抑制活性評価に使用したDsRed2を置換した。すなわち、正規化用プラスミドとしてpDsRed2-C1(Clontech社)を使用し、活性評価用プラスミドとしてpCAGGS-AFP-miR143標的を使用した(図17A)。pCAGGS-AFP-miR143標的は、pCAGGS-AFPのGFP遺伝子の3'側をEcoRVで切断した平滑末端に、上記配列番号4及び配列番号5のDNA鎖をアニーリングさせた分子を連結して作製した。アンチセンス鎖としてmiR-143を用い、センス鎖として5'突出部分を持たないRNA鎖(表1−1、R143(4m)、配列番号46)、9又は16塩基長の5'突出部分を有するRNA鎖(表1−1、R143(4m)9L、配列番号48;R143(4m)16L、配列番号47)を用いた。その結果、アッセイ系を変えた場合(図17C)でも、これまでのアッセイ系(図17D)と同様の活性の傾向が見られ、5'突出部分を有するRNAセンス鎖を用いると著しく高い活性が見られた。このことから、ここまでの活性評価から得られた結果の有効性が裏付けられた。
(5'突出部分を有するDNA/RNAキメラセンス鎖)
センス鎖に含まれるアンチセンス鎖に対する相補的部分及び5'突出部分を、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの様々な組み合わせで有するDNA/RNAキメラセンス鎖を有する場合について、遺伝子発現抑制活性を検討した。
図19では、3'突出部分を有するセンス鎖を用いて、活性を検討した。用いたオリゴヌクレオチドは表1−2に示す。その結果、DNA鎖及びRNA鎖ともに、センス鎖の3'末端に突出部分を有しても有効な遺伝子発現抑制活性は見られなかった。
(ヒトHeLa-S3細胞における内在性遺伝子に対する効果)
内在性遺伝子に対する遺伝子発現抑制効果を調べるため、ヒトHeLa-S3細胞のDNA依存性RNAポリメラーゼPolR2A遺伝子を標的とする遺伝子抑制実験を行った。RNAポリメラーゼPolR2はmRNAの転写を担う酵素である。このサブユニットをコードするPolR2A遺伝子の発現を、高濃度の二本鎖核酸分子によって、かつレポーター遺伝子などの外来性標的の非存在下で、強く抑制すると細胞の増殖が低下するか、又は致死になると考えられる。
(ヒト癌細胞における腫瘍抑制効果)
miR-143は癌細胞に導入されると細胞増殖が阻害され、腫瘍抑制効果があることが報告されている(Akao Y, et al., 2010, Cancer Gene Ther, 17, 398-408)。本発明の二本鎖核酸分子が、天然型のmiRNAと同様に癌細胞内で機能し、腫瘍抑制効果を有するか次の方法によって調べた。ヒト大腸癌DLD-1細胞(8000細胞)を96ウェルプレートに播種した。1日後、アンチセンス鎖miR-143(配列番号1、表1−1)と、センス鎖miR-143*(配列番号10、表1−1)又はR143(4m)D16L(配列番号59、表1−2)からなる二本鎖核酸分子、あるいは上述の対照siRNA二本鎖核酸分子(配列番号8及び9)を50nMでLipofectamineTM RNAiMAX(Invitrogen)を用いて細胞にトランスフェクションした。さらに3日後、1ウェルあたりの細胞数をカウントし単位面積当たりの細胞数を求めた(細胞/mm2)。
(自然免疫応答に対する影響)
一般に、通常のsiRNAは二重鎖RNAの認識により自然免疫応答を引き起こすことが知られている。自然免疫系の過剰な応答は、医薬開発において障害となる。本発明の二本鎖核酸分子が、自然免疫応答を引き起こすか、次の方法によって調べた。HeLa-S3細胞(8000細胞)を96ウェルプレートに播種した。1日後、X-treamGENE siRNA Transfection Reagent(Roche Applied Science)を用いて、表3に示すアンチセンス鎖(siGFP-AS、配列番号80)とセンス鎖(siGFP-S、配列番号81;siGFP(7m)、配列番号82;またはsiGFP(7m)12L、配列番号83)とからなる3種の二本鎖核酸分子(各40nM)又はpoly I:C(50ng)をトランスフェクションした。9時間後、全RNAを回収し定量的RT-PCR(qRT-PCR)を行って、自然免疫において誘導されるIFNβ、IP10及びOAS1 mRNAの発現量を調べた。この際、以下のプライマーの組み合わせ、IFNβフォワード(5'-TCACTGTGCCTGGACCATAG-3'、配列番号85)とIFNβリバース(5'-CAGCATCTGCTGGTTGAAGA-3'、配列番号86)、OAS1フォワード(5'-GCAGAAGAGGACTGGACCTG-3'、配列番号87)とOAS1リバース(5'-TAGAAGGCCAGGAGTCAGGA-3'、配列番号88)又はIP10フォワード(5'-GCTCTACTGAGGTGCTATGTTC-3'、配列番号89)とIP10リバース(5'-CCCTTGGAAGATGGGAAAGGT-3'、配列番号90)を用いた。結果を、プライマーGAPDHフォワード(5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3'、配列番号91)とGAPDHリバース(5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'、配列番号92)を用いて内在性コントロールGAPDHに対して補正した。
配列番号1、2、10、18、45〜57、61及び79〜81:合成RNA
配列番号3〜7、11〜17、19〜44、60、62〜78及び82〜84:合成DNA
配列番号85〜92:プライマー
Claims (15)
アンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5'末端に2〜100塩基長の一本鎖突出部分とを含む、センス鎖
を含み、
該相補的部分を介してセンス鎖とアンチセンス鎖が塩基対合する
遺伝子発現抑制用二本鎖核酸分子。
(a)標的遺伝子の標的配列に対して十分に相補的な配列を含むアンチセンス鎖を設計するか、又はmiRNAであるアンチセンス鎖を選択する工程、
(b)アンチセンス鎖に対して十分に相補的な配列からなる相補的部分と、5'末端に一本鎖突出部分とを含むセンス鎖を設計する工程、
(c)アンチセンス鎖及びセンス鎖を合成する工程、並びに
(d)合成されたアンチセンス鎖及びセンス鎖を塩基対合させる工程
を含む、前記方法。
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