WO2023043239A1 - 선천성 면역 반응 유도 효과를 갖는 이중가닥 rna 및 이의 용도 - Google Patents

선천성 면역 반응 유도 효과를 갖는 이중가닥 rna 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023043239A1
WO2023043239A1 PCT/KR2022/013822 KR2022013822W WO2023043239A1 WO 2023043239 A1 WO2023043239 A1 WO 2023043239A1 KR 2022013822 W KR2022013822 W KR 2022013822W WO 2023043239 A1 WO2023043239 A1 WO 2023043239A1
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WO
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double
stranded rna
innate immune
seq
sequence
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PCT/KR2022/013822
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홍선우
강영규
김재진
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올릭스 주식회사
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a double-stranded RNA having an innate immune response-inducing effect and a use thereof, and more particularly, provides a double-stranded RNA having a duplex length of 30 to 60 base pairs containing an innate immune activation motif.
  • siRNA small interfering RNA
  • siRNA consists of a sense strand with the same sequence as the target mRNA and an antisense strand with a complementary sequence.
  • Conventional siRNA has a short duplex of 19-21 bp and includes an overhang of 2 nucleotides on both strands 3'.
  • the siRNA with this structure enters cells, attaches to the target mRNA, degrades the target mRNA, inhibits the expression of the target gene, and can target all mRNAs by changing the sequence of the relevant oligonucleotide, so that the expression of proteins with complex structures is also improved.
  • RNAi agents can be suppressed Therefore, it can make it possible to treat diseases such as cancer, viral infections, and genetic diseases that are currently difficult to treat.
  • existing therapeutic approaches using siRNA do not show a sufficient level of therapeutic efficacy in some cases, and therefore, development of more improved RNAi agents is required.
  • RIG-I is the first molecule in the innate immune system to detect foreign RNA and is present in the cytoplasm of all cells in the human body.
  • RIG-I is a pattern recognition receptor (PRR) in the cytoplasm, which detects foreign molecule-specific motifs and sequences through a protein receptor-based recognition system. It is known to discriminate between short dsRNAs. It has been reported that RIG-I usually recognizes foreign RNAs, but sometimes it can also recognize “self” RNAs, which can act as tumor suppressors in cancers such as acute myeloid leukemia and hepatocellular carcinoma.
  • the present inventors have made research efforts to develop a new RNAi agent capable of improving therapeutic efficacy by specifically activating innate immunity together with inhibition of expression of a target gene, resulting in innate RNAi agents derived from structures and specific sequences.
  • the immune response enhancing effect was confirmed, and based on this, the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to provide a double-stranded RNA capable of specifically activating an innate immune response while suppressing the expression of a target gene.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the double-stranded RNA, or a method for treating a disease or improving a pathological condition comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • one aspect is an antisense strand comprising a guide sequence; And a double-stranded RNA having a duplex length of 30 to 60 base pairs consisting of a sense strand complementary to the antisense strand, wherein the 3' end of the antisense strand and the 5' end of the sense strand are blunt ends ), and an innate immune activation motif comprising a sequence having at least 80% or more homology to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is located at the 3' end of the antisense strand or the 5' end of the sense strand, Double-stranded RNA is provided.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition comprising the double-stranded RNA as an active ingredient.
  • Another aspect provides a method for treating a disease comprising administering the double-stranded RNA to a subject.
  • Another aspect provides the use of the double-stranded RNA for the manufacture of a medicament for the treatment or amelioration of a disease or pathological condition.
  • the double-stranded RNA is a double-stranded RNA having a duplex length of 30 to 60 base pairs, and includes a motif including a unique structure and a specific sequence, thereby suppressing the expression of a target gene and specific innate immune response can be activated with
  • the double-stranded RNA can improve the therapeutic efficacy of a target therapeutic agent by inhibiting the expression of a gene associated with a disease or pathological condition and simultaneously enhancing an innate immune response.
  • Figure 2 is a double-stranded RNA having various lengths and structures that simultaneously target Lamin A / C and GAPDH genes according to one aspect was transfected into HAP1 WT or HAP1 Dicer KO cell lines, and then the expression level of the target gene was confirmed.
  • a in FIG. 2 is the result of confirming the expression level of the Lamin A / C gene
  • B in FIG. 2 is the expression level of the GAPDH gene.
  • Figure 3 is a T98G cell line transfected with double-stranded RNA having various lengths and structures in one aspect, and then IFIT1, ISG15, and CXCL10 mRNA levels were confirmed.
  • Figure 3 A shows the double-stranded RNA targeting the Survivin gene
  • the treatment result, and B in FIG. 3 are the results of treatment with double-stranded RNA targeting Lamin A/C and GAPDH genes at the same time.
  • Figure 4 is a result of confirming the activity level of interferon regulatory factor (IRF) after transfecting a wild-type cell line or a cell line lacking RIG-I with double-stranded RNA having various lengths and structures targeting the Survivin gene in one aspect. am.
  • IRF interferon regulatory factor
  • Figure 5 shows the activity level of IRF after transfecting a wild-type cell line or a cell line lacking RIG-I with double-stranded RNA having various lengths and structures, simultaneously targeting Lamin A / C and GAPDH genes according to one aspect. This is the result of checking
  • FIG. 6 is a diagram schematically showing the structure of double-stranded RNA including an innate immune activation motif according to one aspect.
  • Figure 7 is a result of confirming IFIT1, ISG15, and CXCL10 mRNA levels after transfecting the double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 5 according to one aspect into the T98G cell line.
  • Figure 9 is a result of confirming IFIT1, ISG15, and CXCL10 mRNA levels after transfecting the double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 7 according to one aspect into the T98G cell line.
  • 10 is a result of confirming the activity level of IRF after transfecting the double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 5 according to one aspect into a wild-type cell line or a cell line lacking RIG-I.
  • IRF interferon regulatory factor
  • RNA 14 is according to one aspect 30 bp double-stranded RNA in which the position of the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 1 was modified was transfected into a wild-type cell line or a cell line lacking RIG-I, and the activity level of interferon regulatory factor (IRF) was confirmed.
  • IRF interferon regulatory factor
  • Figure 15 is a result of confirming the activity level of IRF after transfecting the double-stranded RNA containing the innate immune activation motif and 5'-triphosphate according to one aspect into a wild-type cell line or a cell line lacking RIG-I.
  • One aspect includes an antisense strand comprising a guide sequence; And a double-stranded RNA having a duplex length of 30 to 60 base pairs (bp) consisting of a sense strand complementary to the antisense strand, the 3' end of the antisense strand and the 5' end of the sense strand
  • An innate immune activation motif comprising a sequence having at least 80% or more homology to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 at the 3' end of the antisense strand or the 5' end of the sense strand, forming a blunt end.
  • a double-stranded RNA wherein is located.
  • double-stranded RNA refers to two strands of RNA complementary to each other.
  • nucleic acid molecules inducing RNAi refers to any agent or nucleic acid molecule capable of inhibiting or down-regulating gene expression or viral replication by mediating the RNA interference in a sequence-specific manner.
  • the term may refer to either an individual nucleic acid molecule, a plurality of the nucleic acid molecules, or a pool of the nucleic acid molecules.
  • the term "gene” should be considered in its broadest sense and may encode structural or regulatory proteins.
  • the regulatory protein includes a transcription factor, a heat shock protein, or a protein involved in DNA/RNA replication, transcription, and/or translation.
  • the target gene to be suppressed is inherent in the viral genome, and may be incorporated into an animal gene or present as an extrachromosomal component.
  • the term "antisense strand” refers to a polynucleotide that is substantially or 100% complementary to a target nucleic acid of interest, for example, a messenger RNA (mRNA), an RNA sequence other than mRNA (e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA and hnRNA) or coding or non-coding DNA sequences, in whole or in part.
  • mRNA messenger RNA
  • RNA sequence other than mRNA e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA and hnRNA
  • the antisense strand includes a guide sequence of 8 nt or more complementary to the target mRNA, and the number of target mRNAs that bind to the guide sequence may be at least one, for example, one, two, or three.
  • guide sequence is a polynucleotide sequence capable of suppressing or suppressing the expression of a target mRNA or target gene by forming a complementary bond, and may have a length of 15 to 25 nucleotides And, for example, 15 to 23, 15 to 21, 15 to 19, 15 to 17, 17 to 25, 17 to 23, 17 to 21, 17 to It may have a length of 19, 19 to 25, 19 to 23, or 19 to 21 nucleotides, and may optionally be engineered to complementarily bind to one or more target mRNAs.
  • the guide sequence is located at the 5' end region and can target, for example, enzymes, transcription factors, secreted signaling proteins, signal transduction proteins, kinases, phosphatases, cell receptors, ion channels, or combinations thereof. and proteins associated with the growth and survival of cells associated with a disease state, for example, cancer cells, but are not limited thereto.
  • the term "sense strand” refers to a polynucleotide having the same nucleic acid sequence as a target nucleic acid, which includes messenger RNA (mRNA) and non-mRNA RNA sequences (e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA and hnRNA). or a polynucleotide that is identical in whole or in part to a coding or non-coding DNA sequence.
  • mRNA messenger RNA
  • non-mRNA RNA sequences e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA and hnRNA
  • complementarity or “complementary” refer to meanings generally accepted in the art.
  • the term generally refers to the formation or existence of hydrogen bond(s) between one nucleic acid sequence and another nucleic acid sequence, either by traditional Watson-Crick or other non-traditional types of bonding described herein. can refer to Perfect complementarity can mean that all contiguous residues in a nucleic acid sequence hydrogen bond with the same number of contiguous residues in a second nucleic acid sequence.
  • Partial complementarity is the presence of various mismatches or non-based paired nucleotides (e.g., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more mismatches, eg, 1 to 3 mismatches, non-nucleotide linkers, or non-base pair nucleotides).
  • the partial complementarity is caused by bulges, loops, overhangs, or blunt ends between the sense strand and the antisense strand of a nucleic acid molecule, or between the antisense strand of a nucleic acid molecule and its corresponding target nucleic acid molecule. (blunt end).
  • RNAi agents depends on the length of the duplex or the structure of the terminal region of the duplex. Therefore, as a technical means for enhancing the innate immune response, an approach of introducing 5'-triphosphate or introducing a modified terminal structure has been reported.
  • the present inventors have newly identified that the innate immune response by double-stranded RNA can be enhanced by introducing a specific sequence, specifically, the innate immune activation motif of the present application.
  • innate immune response is an innate defense immune system in vivo derived from double-stranded RNA, and refers to an in vivo response that can contribute to improving the efficacy of treatment by improving the immunity of an individual from a therapeutic point of view.
  • the innate immune response may be, for example, induced by interferon or mediated by retinoic acid-inducible gene I (RIG-I).
  • the term "innate immune activation motif" refers to a functional structure for inducing or enhancing the innate immune response of an individual to which double-stranded RNA is administered, specifically, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence and 80 It may include variants of nucleotide sequences including sequences having % or more homology.
  • the innate immune activation motif may be located or inserted/introduced in the terminal region of the duplex, and may be, for example, located at the 3' end of the antisense strand or the 5' end of the sense strand.
  • the innate immune activation motif may be 10 to 20 nucleotides comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and the length of the nucleotides is, for example, 10 to 18, 10 to 16, 10 to 14 10 to 12, 12 to 20, 12 to 18, 12 to 16, 12 to 14, 14 to 20, 14 to 18, or 14 to 16 days can
  • the innate immune activation motif is a functional construct comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, for example, a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, or SEQ ID NO: 7 , or a variant of the nucleotide sequence having at least 80% or more sequence identity with the nucleotide sequence.
  • variants refers to entities that exhibit significant structural identity to a reference entity (eg, a wild-type sequence) but differ structurally from the reference entity in one or more respects. Whether or not a particular entity is properly considered a "variant" of a reference entity is based on the degree of structural or functional identity with the reference entity. Any biological or chemical reference entity has certain unique structural elements, and the variant, by definition, refers to a distinct chemical entity that shares one or more such unique structural elements.
  • a polynucleotide may have unique sequence elements comprising a plurality of nucleotide residues having designated positions relative to each other in linear or three-dimensional space.
  • a polynucleotide may differ from a reference polynucleotide due to one or more differences in nucleotide sequence and/or one or more differences in chemical moieties (e.g., carbohydrates, lipids, etc.) covalently linked to the polynucleotide backbone.
  • Said variant is at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% %, 96%, 97%, 98% or 99% overall sequence identity with the reference polynucleotide.
  • identity refers to the overall relationship between polymer molecules, eg, between nucleic acids (eg, DNA molecules and/or RNA molecules).
  • polynucleotide sequences are "substantially identical” to one another if their sequences are at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, or 99% identical. is considered Calculation of percent identity of two polynucleotide sequences can be performed, for example, by aligning the two sequences for optimal comparison purposes (e.g., one or both of the first and second sequences for optimal alignment). Gaps may be introduced in both, and non-identical sequences may be disregarded for comparison purposes).
  • the length of a sequence aligned for comparison purposes is at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or substantially 100% of the length of the reference sequence.
  • the polynucleotide sequences at corresponding positions are then compared. Determination of percent identity between two sequences and comparison of sequences can be accomplished using mathematical algorithms. As is well known to those skilled in the art, nucleotide sequences can be compared using any of a variety of algorithms, including those available in commercial computer programs such as BLASTN.
  • the innate immune activation motif can operate independently of the aforementioned guide sequence, and is introduced into the terminal region of a long double-stranded RNA comprising 30 or more base pairs to activate the RIG-I-mediated innate immune response. can promote
  • the double-stranded RNA of the present specification may enhance an innate immune response along with inhibiting expression of a target gene.
  • the double-stranded RNA may satisfy the following conditions: 1) have a duplex length of 30 to 60 base pairs, 2) the 3' end of the antisense strand and the 5' end of the sense strand forms a blunt end, and 3) an innate immune activation motif is located at the 3' end of the antisense strand or the 5' end of the sense strand.
  • expression refers to a meaning generally accepted in the art. In general, the term may refer to a process in which a gene ultimately produces a protein. Such expression includes, but is not limited to, transcription, splicing, post-transcriptional modification, or translation. As used herein, expression levels can be determined or monitored by detection of mRNA levels or protein levels. In the double-stranded RNA of the present disclosure, expression inhibition of the target gene can be achieved by a guide sequence located at the 5' end of the antisense strand and a sequence at the 3' end of the sense strand complementary to the guide sequence.
  • inhibitors refer to a statistically significant reduction compared to an untreated group or a normal control group. Said reduction is, for example, at least 30%; 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 60%, 65%, 70%, 70%, 80%, 85%, 90%, or 95% or greater, which detects or measures Depending on the method, it may be below the level of detection.
  • the double-stranded RNA may have a duplex length of 30 to 60 base pairs.
  • the duplex length of 30 to 60 base pairs may be formed by binding between an antisense strand including a guide sequence and a sense strand complementary to the antisense strand.
  • the duplex may have a length of 38 to 60 base pairs, for example, 30 to 55, 30 to 50, 30 to 45, 30 to 40, 30 to 35 , 35 to 60, 35 to 55, 35 to 50, 35 to 45, 35 to 40, 40 to 60, 40 to 55, 40 to 50, 40 to 45, 45 to 60, 45 to 55, 45 to 50, 50 to 60, or 55 to 60 base pairs in length.
  • the 3' end of the antisense strand and the 5' end of the sense strand of the double-stranded RNA may form a blunt end.
  • blunt end refers to a meaning generally accepted in the art and may be used interchangeably with blunt end.
  • the term may refer to the end of a double-stranded RNA without overhanging nucleotides at at least either end.
  • the blunt end may be formed at a terminal region where the innate immune activation motif is located, or at both ends of the double-stranded RNA.
  • the double-stranded RNA may have an innate immune activation motif located at the 3' end of the antisense strand or the 5' end of the sense strand.
  • the innate immune activation motif may be 10 to 20 nucleotides comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, for example, any one sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 It may refer to a nucleotide consisting of or a variant of the nucleotide.
  • the innate immune activation motif can contribute to enhancing the innate immune response of individuals, specifically, the retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) mediated innate immune response in a sequence-dependent manner.
  • RIG-I retinoic acid-inducible gene I
  • the long-length and modified terminal region can be applied to the expression control of one or more target genes, and the terminal structure of the double-stranded RNA It was confirmed that by modifying the sequence with, the innate immune response, for example, the RIG-I mediated innate immune response can be enhanced.
  • the innate immune activation motif comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 operates independently of the guide sequence, and when located in the terminal region of the double-stranded RNA in a long double-stranded RNA of 30 bp or longer, an effective level of innate immune response can be achieved. could induce
  • the sense strand or antisense strand may include one or more chemical modifications.
  • the chemical modification introduced into the double-stranded RNA may be for enhancing an innate immune response.
  • the chemical modification may be to introduce 5'-triphosphate into the terminal region of the double-stranded RNA, for example, 5'-triphosphate to at least one of the 5' end of the antisense strand and the 5' end of the sense strand.
  • Triphosphate may be introduced, but techniques known in the art for enhancing the innate immune response may be applied without limitation.
  • the chemical modification introduced into the double-stranded RNA may be to improve the therapeutic efficacy under in vivo conditions and to improve the cell target delivery ability.
  • Chemical modifications in the sense strand or antisense strand may include at least one selected from the group consisting of: binding with an N-acetylgalactosamine (GalNAc) derivative; modification of nucleotide bonds to phosphorothioate, boranophosphate, or methyl phosphonate;
  • the -OH group at the 2' carbon position of the sugar structure in the nucleotide is -CH 3 (methyl), -OCH 3 (methoxy), -NH 2 , -F, -O-2-methoxyethyl-O-propyl, -O- substituted with 2-methylthioethyl, -O-3-aminopropyl, or -O-3-dimethylaminopropyl; Combination of phosphate group, E-Vinylphosphonate, or cell pe
  • the innate immune activation motif was able to enhance the RIG-I-mediated innate immune response not only in double-stranded RNA in which no chemical modification was introduced, but also in double-stranded RNA to which the above-described known technology was applied, It can be applied in conjunction with known chemical modification techniques for double-stranded RNA or RNAi preparations.
  • the term "effective ingredient” means an appropriately effective amount of an ingredient that affects beneficial or desirable clinical or biochemical results. Specifically, it may mean an effective amount of an agent, active agent, or double-stranded RNA.
  • the effective amount can be administered once or more and prevent disease, or, without limitation, alleviation of symptoms, reduction of disease extent, stabilization of disease state (i.e., not worsening), delay of disease progression, or It may be an appropriate amount for reduction in rate, or amelioration or palliation and alleviation (partial or total) of the disease state.
  • prevention refers to any action that blocks the occurrence of a disease in advance, suppresses the disease, or delays the progression of the disease. For example, it refers to preventing the occurrence of the disease or characteristic characteristic thereof, preventing the occurrence, or protecting or protecting from the occurrence of the disease or characteristic characteristic thereof.
  • treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or prophylactic measures.
  • it means any action that improves or beneficially changes the symptoms of a disease. For example, preventing, reducing or ameliorating the liver disease or its characteristic feature, or delaying (attenuating) the progression of the disease or its characteristic feature in a subject.
  • the term "effective amount” refers to a meaning generally accepted in the art.
  • the term generally refers to a molecule, compound, or construct that will elicit an intended biological response (eg, a beneficial response) in a cell, tissue, system, animal, or human being sought by a researcher, veterinarian, physician, or other clinician. can mean quantity.
  • a "therapeutically effective amount” is a therapeutically relevant change in a measurable parameter associated with a disease or disorder that produces a desirable medical response to the extent that a particular clinical treatment can be considered effective. It can refer to the amount of a molecule, compound, or constituent that can be derived.
  • a therapeutically effective amount of a drug for treatment of the disease or disorder may be that amount necessary to effect a therapeutically relevant change in the above parameter.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition can be determined by a person skilled in the art based on the symptoms of a typical patient and the severity of the disease.
  • it can be formulated in various forms such as powders, tablets, capsules, solutions, injections, ointments, syrups, etc., and may be provided in unit-dose or multi-dose containers, such as sealed ampoules and bottles. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • the administration route of the composition according to the present invention is not limited to these, but for example, oral cavity, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intestinal, sublingual or topical administration.
  • the dosage of the composition according to the present invention varies in its range depending on the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, method, excretion rate or severity of disease, etc. can decide
  • the composition of the present invention can be formulated into a suitable dosage form for clinical administration using known techniques.
  • Another aspect provides a method of reducing the expression level of one or more target genes comprising administering the double-stranded RNA to a subject.
  • Another aspect provides a method for treating a disease or improving a pathological condition comprising administering the double-stranded RNA to a subject.
  • the method of reducing the expression level of the target gene or the method of treating a disease includes or uses the above-described double-stranded RNA or pharmaceutical composition, the common information between them is to avoid excessive complexity of the present specification. , the description is omitted.
  • the term "individual” means a subject in need of treatment of a disease, specifically a liver disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, dog, cat, horse, It may include all mammals such as cattle, sheep, pigs, goats, camels, and antelopes.
  • double-stranded RNAs having duplexes of various lengths were prepared.
  • the double-stranded RNA was prepared as a double-strand having a duplex of 19, 40, 50, or 60 base pairs, and containing a guide sequence targeting Survivin, LaminA/C, and/or GAPDH, respectively.
  • the short double-stranded (19 bp) double-stranded RNA was designed to form a blunt end or form two overhangs
  • the long double-stranded (40 bp, 50 bp, 60 bp) RNA was blunt. It is made to form an end or to form one or two protrusions.
  • the double-stranded RNA is Bioneer Co. Ltd (Republic of Korea), and Dharmacon, Inc (UK), and the double-stranded RNA containing the guide sequence for Survivin is shown in Table 1, and the guide sequence for LaminA/C and/or GAPDH The included double-stranded RNA is as shown in Table 2.
  • Tables 1 and 2 guide sequences for target genes are indicated in bold, and protrusions formed in the distal regions are indicated in shade.
  • Example 2 we tried to confirm the knockdown effect of the double-stranded RNA according to Example 1 on the target gene. Specifically, 19, 40, 50, or 60 bp double-stranded RNA targeting the Survivin gene prepared in Example 1 and 19, 40, 50, or 60 bp double-stranded RNA simultaneously targeting Lamin A / C and GAPDH The knockdown effect on the target gene of was evaluated. To this end, the HeLa (CCL-2, ATCC) cell line was plated in a 24-well plate at 30% confluency in complete medium without antibiotics.
  • the HAP1 cell line (WT) or the HAP1 Dicer KO cell line (Dicer knock-out) was plated in a 24-well plate at 30% confluency in antibiotic-free complete medium, and in the same manner as above, thereafter , 0.3 nM of 19, 40, 50 or 60 bp of double-stranded RNA targeting Survivin or 1 nM of 19, 40, 50 or 60 bp of double-stranded RNA targeting Lamin A / C-GAPDH was added to the cell line by Lipofectamine RNAiMAX (13778150). ; Invitrogen), and target gene mRNA levels were measured.
  • the control group used only the transfection reagent was added (mock) and double-stranded RNA was not treated (NT).
  • the effect of the terminal structure of double-stranded RNA on the innate immune response was investigated.
  • the double-stranded RNA prepared in Example 1 was transfected into the T98G cell line and cytokine expression related to the innate immune response was analyzed.
  • the T98G (CRL-1690, ATCC) cell line was plated in a 24-well plate at 30% confluency in antibiotic-free complete medium.
  • double-stranded RNA having a length of 40 bp or more induced high expression of cytokines related to the innate immune response was obtained when the terminal structure of the double-stranded RNA was blunt-ended. was more pronounced.
  • the innate immune response is affected by the terminal structure of double-stranded RNA.
  • the effect of inducing expression according to the change in the length of the double-stranded RNA showed opposite tendencies between the double-stranded RNA targeting Survivin and the double-stranded RNA targeting Lamin A/C-GAPDH. In addition to the structure, it was found that it could be controlled by other functional factors.
  • Example 2 As a factor mediating the innate immune response, it was attempted to confirm the relationship with RIG-I (retinoic acid-inducible gene I).
  • RIG-I retinoic acid-inducible gene I
  • the induced The level of the innate immune response was evaluated as the activity of IRF.
  • the RAW-Lucia ISG cell line and the RAW-Lucia ISG-KO-RIG-I cell line were plated in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 5 per well.
  • the double-stranded RNA was transfected into the cell line using Lipofectamine RNAiMAX (13778150; Invitrogen), and the transfected cells were cultured for 24 hours, respectively, and then the supernatant was obtained. Subsequently, the level of interferon regulatory factor (IRF) activity was detected in the supernatant using a plate reader (VICTORX2; PerkinElmer).
  • IRF interferon regulatory factor
  • the positive control group was a group administered with Poly I:C and/or LPS, and the control group was a group to which only the transfection reagent was added (mock) and a group not treated with double-stranded RNA (NT).
  • double-stranded RNAs having duplexes of various lengths capable of suppressing the expression of target genes and activating innate immunity were prepared.
  • the double-stranded RNA is a double-strand having a duplex of 38 to 60 base pairs, 1) a guide sequence for a target gene at the 5' end of the antisense strand, and 2) complementary to the antisense strand. It was constructed so that the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 5 (19nt) or SEQ ID NO: 7 (20nt) was located at the 5' terminal region of the sense strand forming a natural bond.
  • the terminal portion of the double-strand was modified to prepare double-stranded RNA having a blunt end, one protrusion, or two protrusions.
  • the double-stranded RNA is Bioneer Co. Ltd (Republic of Korea), and Dharmacon, Inc (UK), and the double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 5 is shown in Table 4, and the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 7
  • Table 5 the innate immune activation motif sequence is underlined, the guide sequence for the target gene is boldly marked, and the protrusion formed in the distal region is shaded.
  • Example 4 we tried to confirm the knockdown effect of the double-stranded RNA according to Example 4 on the target gene. Specifically, the knockdown effect on the Luciferase gene of 19, 38, 50, or 60 bp double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 5 according to Example 4 was analyzed by Luciferase plasmid (E1741, Promega-treated HeLa (CCL-2, ATCC) cell lines were evaluated in the same manner as in Example 2.
  • Luciferase plasmid E1741, Promega-treated HeLa (CCL-2, ATCC
  • the double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 5 induced high expression of cytokines related to the innate immune response.
  • this effect was more excellent when the terminal structure of the double-stranded RNA was blunt-ended, and the double-stranded RNA of Example 3-1 having the same structure as above but not introducing the motif at the end of the double-stranded RNA Compared to the effect of , it was very remarkable.
  • the double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 7 also induced high expression of cytokines related to the innate immune response.
  • a group treated with 40 bp double-stranded RNA (Lamin A-G-GAPDH, Lamin A/C-Luciferase, GAPDH-Luciferase) having the same structure as above, but without introducing the motif at the end of the double-stranded RNA, All of the groups treated with a mixture of the short guide sequence and the motif sequence did not induce an effective level of innate immune response. indicating that it can be exerted on double-stranded RNA.
  • Example 3 As a factor mediating the innate immune response dependent on the sequence/length, we tried to confirm the relationship with RIG-I. 19, 38, 50, or 60 bp double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 5 according to Example 4 and 20 or 40 bp double-stranded RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 7
  • IRF activity was measured for the RAW-Lucia ISG cell line (WT) and the RAW-Lucia ISG-KO-RIG-I cell line (RIG-I KO).
  • the positive control group was a group administered with Poly I:C and/or LPS, and the control group was a group to which only the transfection reagent was added (mock) and a group not treated with double-stranded RNA (NT).
  • the innate immune response in the RAW-Lucia ISG cell line showed a tendency similar to that of Example 5-2, but ISG-KO lacking RIG-I.
  • this innate immune response was lost or significantly reduced.
  • in the double-stranded RNA not only when both ends form blunt ends, but also when blunt ends are formed at either end region adjacent to the innate immune activation motif, a similar effect can be obtained.
  • RIG-I the innate immune response derived from the motif sequence located in the terminal region of double-stranded RNA is mediated by RIG-I.
  • the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 (10nt) or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (15nt) is located at the end of the double-stranded RNA was prepared , the specific structure is as shown in FIG.
  • double-stranded RNA in which the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 was introduced into a non-terminal region was additionally prepared.
  • the double-stranded RNA is Bioneer Co.
  • RNA containing the innate immune activation motif of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 is shown in Table 7.
  • innate immune activation motif sequences are underlined, and guide sequences for target genes are bolded.
  • the positive control group was a group administered with Poly I:C and/or LPS, and the control group was a group to which only the transfection reagent was added (mock) and a group not treated with double-stranded RNA (NT).
  • the double-stranded RNA containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 at the end also exhibits RIG-I-mediated innate immune response, as in Example 5-3 above. could promote However, double-stranded RNA (Motif-20-Shifted) in which the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 was moved to the center of the entire sequence significantly reduced this effect.
  • the motif of SEQ ID NO: 1 consisting of 10 nt can be applied as a unit or core sequence for inducing innate immune response, and effective efficacy can be exhibited when the sequence is introduced or located in the terminal region in double-stranded RNA And it was found.
  • the double-stranded RNA is Bioneer Co. Ltd (Republic of Korea), and Dharmacon, Inc (UK), and the aforementioned double-stranded RNA is shown in Table 8.
  • Table 8 innate immune activation motif sequences are underlined, and guide sequences for target genes are bolded.
  • 5'-triphosphate is one of the existing methods of inducing an innate immune response, and in this example, whether the functionality of the innate immune activation motif can be effectively exerted even in double-stranded RNA into which such a conventional technique has been introduced wanted to check.
  • 40 bp double-stranded RNA containing the motif of SEQ ID NO: 7 was used as a basic structure, and 5'-triphosphate was introduced into the terminal region to prepare double-stranded RNA.
  • Double-stranded RNA containing phosphate was shown in Table 9.
  • innate immune activation motif sequences are underlined, guide sequences for target genes are bolded, and PPP represents 5'-triphosphate.
  • the positive control group was a group administered with Poly I:C and/or LPS, and the control group was a group to which only the transfection reagent was added (mock) and a group not treated with double-stranded RNA (NT).
  • the double-stranded RNA in which 5'-triphosphate is introduced into the terminal region of the double-stranded RNA can also enhance the RIG-I-mediated innate immune response, as in Example 5-3. there was.

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Abstract

본 발명은 선천성 면역 반응 유도 효과를 갖는 이중가닥 RNA 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 30 내지 60개 염기쌍의 듀플렉스 길이를 갖는 이중가닥의 이중가닥 RNA, 및 상기 이중가닥 RNA를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

선천성 면역 반응 유도 효과를 갖는 이중가닥 RNA 및 이의 용도
본 발명은 선천성 면역 반응 유도 효과를 갖는 이중가닥 RNA 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 30 내지 60개 염기쌍의 듀플렉스 길이를 갖는 이중가닥 RNA를 제공한다.
본 출원은 2021년 9월 15일 출원된 대한민국 특허출원 제10-2021-0123167호를 우선권으로 주장하고, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
RNA 간섭(RNA interference) 현상을 이용한 질병의 치료는 mRNA를 타겟으로 하여, 유전자의 발현을 번역(translational) 수준에서 조절하는 siRNA를 이용하기 때문에 보다 안전하게 질병을 치료할 수 있다. 이 중에서도 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)는 표적 mRNA와 같은 시퀀스를 가진 sense strand와 그와 상보적인 시퀀스를 가진 antisense strand로 구성된다. 종래의 siRNA는 19-21bp의 짧은 듀플렉스를 가지며 양쪽 strand 3'에 2개의 뉴클레오타이드가 돌출된 구조(overhang)를 포함한다. 이러한 구조를 갖는 siRNA는 세포 내로 들어가 표적 mRNA에 붙어 표적 mRNA를 분해시키며 표적 유전자의 발현을 억제하며, 관련 올리고뉴클레오티드의 서열를 바꿈으로써 모든 mRNA를 표적으로 하는 것이 가능하기 때문에 구조가 복잡한 단백질의 발현도 억제할 수 있다. 따라서 현재 치료가 어려운 암, 바이러스 감염, 유전병과 같은 질병의 치료를 가능하게 할 수 있다. 그러나 기존의 siRNA을 이용한 치료적 접근은 일부 충분한 수준의 치료 효능을 보여주지 못하는 경우도 있는 바, 보다 향상된 RNAi 제제에 대한 개발이 요구되고 있다.
따라서, 상기와 같은 한계점들을 극복하기 위한 방안으로서, 핵산에 의해 유도되는 선천성 면역 반응 기작이 연구 개발되어 왔으며, 이 중에서도 선천성 면역 반응 수용체인 RIG-Ⅰ(retinoic acid-inducible gene I) 매개 반응이 제안되어 왔다. RIG-Ⅰ은 외래 유래 RNA를 탐지하는 선천면역계 최초의 분자로 인체의 모든 세포의 세포질에 존재한다. RIG-I은 세포질 내 패턴 인식 수용체 단백질(PRR: pattern recognition receptor)로 단백질 수용체 기반 인식 시스템(protein receptor-based recognition system)을 통해 외래분자 특이적 모티프(motif) 및 서열의 검출로 인간과 외래 유래의 짧은 dsRNA를 구별하는 것으로 알려져 있다. 일반적으로 RIG-I는 외래 RNA를 인식하나 때때로 “자체” RNA도 인식할 수 있어 급성 골수성 백혈병 및 간세포 암과 같은 암에서 종양 억제인자로 작용할 수도 있다고 보고된 바 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 표적 유전자의 발현 저해와 함께, 선천성 면역을 특이적으로 활성화하여 치료 효능을 향상시킬 수 있는 새로운 RNAi 제제를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 구조 및 특이적인 서열로부터 비롯된 선천성 면역 반응 증진 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 표적 유전자의 발현 저해와 함께, 선천성 면역 반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있는 이중가닥 RNA를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이중가닥 RNA를 포함하는 약학적 조성물, 또는 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료하는 방법 또는 병리적 상태를 개선하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 가이드 서열을 포함하는 안티센스 가닥; 및 상기 안티센스 가닥과 상보적으로 결합하는 센스 가닥으로 이루어지는 30 내지 60개 염기쌍의 듀플렉스 길이를 갖는 이중가닥 RNA로서, 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 및 상기 센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하고, 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 상기 센스 가닥의 5' 말단에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 선천성 면역 활성화 모티프가 위치하는 것인, 이중가닥 RNA를 제공한다.
다른 양상은 상기 이중가닥 RNA를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 이중가닥 RNA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병의 치료방법을 제공한다.
또 다른 양상은 질병 또는 병리적 상태에 대한 치료 또는 개선을 위한 의약의 제조를 위한 상기 이중가닥 RNA의 용도를 제공한다.
일 양상에 따른 이중가닥 RNA는 30 내지 60개 염기쌍의 듀플렉스 길이를 갖는 이중가닥 RNA로서, 고유의 구조 및 특정 서열을 포함하는 모티프를 포함함으로써, 표적 유전자의 발현 저해와 함께 선천성 면역 반응을 특이적으로 활성화시킬 수 있다.
또한, 일 양상에 따른 이중가닥 RNA는 질병 또는 병리적 상태와 연관된 유전자의 발현을 저해함과 동시에 선천성 면역 반응을 증진시킴으로써, 표적 치료제의 치료 효능을 향상시킬 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 Survivin 유전자를 표적하는, 다양한 길이 및 구조를 갖는 이중가닥 RNA를 HAP1 WT 또는 HAP1 Dicer KO 세포주에 형질감염시킨 후, Survivin의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 2는 일 양상에 따른 Lamin A/C와 GAPDH 유전자를 동시에 표적하는, 다양한 길이 및 구조를 갖는 이중가닥 RNA를 HAP1 WT 또는 HAP1 Dicer KO 세포주에 형질감염시킨 후, 표적 유전자의 발현 수준을 확인한 것으로서, 도 2의 A는 Lamin A/C 유전자의 발현 수준, 및 도 2의 B는 GAPDH 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 일 양상에 다양한 길이 및 구조를 갖는 이중가닥 RNA를 T98G 세포주에 형질감염시킨 후, IFIT1, ISG15, 및 CXCL10 mRNA 수준을 확인한 것으로서, 도 3의 A는 Survivin 유전자를 표적하는 이중가닥 RNA를 처리한 결과, 및 도 3의 B는 Lamin A/C와 GAPDH 유전자를 동시에 표적하는 이중가닥 RNA를 처리한 결과이다.
도 4는 일 양상에 Survivin 유전자를 표적하는, 다양한 길이 및 구조를 갖는 이중가닥 RNA를 야생형 세포주 또는 RIG-Ⅰ가 결여된 세포주에 형질감염시킨 후, 인터페론 조절 인자(IRF)의 활성 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 일 양상에 따른 Lamin A/C와 GAPDH 유전자를 동시에 표적하는, 다양한 길이 및 구조를 갖는 이중가닥 RNA를 야생형 세포주 또는 RIG-Ⅰ가 결여된 세포주에 형질감염시킨 후, IRF의 활성 수준을 확인한 결과이다.
도 6은 일 양상에 따른 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA의 구조를 개략적으로 나타낸 도이다.
도 7은 일 양상에 따른 서열번호 5의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA를 T98G 세포주에 형질감염시킨 후, IFIT1, ISG15, 및 CXCL10 mRNA 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 일 양상에 따른 서열번호 5의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA를 T98G 세포주에 형질감염시킨 후, TNF-α 및 IL-1b mRNA 수준을 확인한 결과이다
도 9는 일 양상에 따른 서열번호 7의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA를 T98G 세포주에 형질감염시킨 후, IFIT1, ISG15, 및 CXCL10 mRNA 수준을 확인한 결과이다.
도 10은 일 양상에 따른 서열번호 5의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA를 야생형 세포주 또는 RIG-Ⅰ가 결여된 세포주에 형질감염시킨 후, IRF의 활성 수준을 확인한 결과이다.
도 11은 일 양상에 따른 서열번호 7의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA를 야생형 세포주 또는 RIG-Ⅰ가 결여된 세포주에 형질감염시킨 후, 인터페론 조절 인자(IRF)의 활성 수준을 확인한 결과이다.
도 12는 일 양상에 따른 변형된 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA를 야생형 세포주 또는 RIG-Ⅰ가 결여된 세포주에 형질감염시킨 후, IRF의 활성 수준을 확인한 결과이다.
도 13은 일 양상에 따른 서열번호 1의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 30bp의 이중가닥 RNA를 Huh7 세포주에 형질감염시킨 후, Lamin A/C 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 14는 일 양상에 따른 서열번호 1의 선천성 면역 활성화 모티프의 위치가 변형된 30bp의 이중가닥 RNA를 야생형 세포주 또는 RIG-Ⅰ가 결여된 세포주에 형질감염시킨 후, 인터페론 조절 인자(IRF)의 활성 수준을 확인한 결과이다.
도 15는 일 양상에 따른 선천성 면역 활성화 모티프 및 5'-트리포스페이트를 포함하는 이중가닥 RNA를 야생형 세포주 또는 RIG-Ⅰ가 결여된 세포주에 형질감염시킨 후, IRF의 활성 수준을 확인한 결과이다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 가이드 서열을 포함하는 안티센스 가닥; 및 상기 안티센스 가닥과 상보적으로 결합하는 센스 가닥으로 이루어지는 30 내지 60개 염기쌍(bp)의 듀플렉스(duplex) 길이를 갖는 이중가닥 RNA로서, 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 및 상기 센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하고, 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 상기 센스 가닥의 5' 말단에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 선천성 면역 활성화 모티프가 위치하는 것인, 이중가닥 RNA를 제공한다.
이중가닥 RNA
본 명세서에서 용어, "이중가닥 RNA (double-stranded RNA)"는 서로 상보적으로 결합을 한 두 가닥의 RNA를 의미한다.
본 명세서에서 용어, “RNAi 유도용 핵산 분자 (nucleic acid molecules inducing RNAi)"는 서열-특이적 방식으로 상기 RNA 간섭을 매개함으로써 유전자 발현 또는 바이러스 복제를 억제 또는 하향 조절할 수 있는 임의의 제제 또는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 개별 핵산 분자, 복수의 상기 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자의 풀 (pool) 모두를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유전자"란 최광의의 의미로 간주되어야 하며, 구조 단백질 또는 조절 단백질을 암호화할 수 있다. 이때, 조절 단백질은 전사인자, 열 충격 단백질 또는 DNA/RNA 복제, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 포함한다. 본 발명에 있어서, 발현 억제의 대상이 되는 목적 유전자는 바이러스 게놈에 내재된 것으로, 동물 유전자로 통합되거나 염색체 외 구성요소로서 존재할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "안티센스 가닥(antisense strand)"은 관심 있는 목적 핵산(target nucleic acid)에 실질적으로 또는 100% 상보적인 폴리뉴클레오티드로서, 예를 들어 mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 상보적일 수 있다. 또한, 상기 안티센스 가닥은 표적 mRNA에 상보적인 8nt 이상의 가이드 서열을 포함하며, 상기 가이드 서열과 결합하는 표적 mRNA는 적어도 1 이상일 수 있으며, 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "가이드 서열"은 표적 mRNA 또는 표적 유전자와의 상보적인 결합을 형성하여 해당 유전자의 발현을 억제 또는 저해시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열로서, 15개 내지 25개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 것일 수 있으며, 예를 들어, 15개 내지 23개, 15개 내지 21개, 15개 내지 19개, 15개 내지 17개, 17 내지 25개, 17개 내지 23개, 17개 내지 21개, 17개 내지 19개, 19개 내지 25개, 19개 내지 23개, 또는 19개 내지 21개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 것일 수 있고, 선택적으로 1개 이상의 표적 mRNA와 상보적으로 결합되도록 제작될 수 있다. 또한, 상기 가이드 서열은 5'말단 영역에 위치하며, 예를 들어, 효소, 전사 인자, 분비 시그널링 단백질, 신호 전달 단백질, 키나아제, 포스파타아제, 세포 수용체, 이온 채널, 또는 이의 조합을 표적으로 할 수 있으며, 질병 상태와 연관된 세포, 예를 들어, 암 세포의 성장 및 생존과 연관된 단백질을 표적으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, "센스 가닥(sense strand)"은 목적 핵산과 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, mRNA(messenger RNA), mRNA가 아닌 RNA 서열(e.g., microRNA, piwiRNA, tRNA, rRNA 및 hnRNA) 또는 코딩 또는 비코딩 DNA 서열과 전체로서 또는 일부로서 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.
본 명세서에서 용어, "상보성(complementarity)" 또는 "상보적인 (complementary)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 상기 용어는 일반적으로 전통적인 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 또는 본 명세서에 기술된 다른 비-전통적 유형의 결합에 의해, 하나의 핵산 서열과 다른 핵산 서열 사이에서의 수소 결합 (들)의 형성 또는 존재를 지칭할 수 있다. 완벽한 상보성은 핵산 서열의 모든 인접 잔기가 제 2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접 잔기와 수소 결합한다는 것을 의미할 수 있다. 부분 상보성은 핵산 분자 내에서, 다양한 미스매치 (mismatch) 또는 비-염기쌍 뉴클레오티드 (non-based paired nucleotides) (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개 이상의 미스매치, 예를 들어, 1 내지 3개의 미스매치, 비-뉴클레오티드 링커 (non-nucleotide linker), 또는 비-염기쌍 뉴클레오티드)를 포함할 수 있다. 상기 부분 상보성은, 핵산 분자의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에서, 또는 핵산 분자의 안티센스 가닥과 이와 상응하는 표적 핵산 분자 사이에서, 벌지 (bulges), 루프 (loops), 돌출 (overhang), 또는 블런트 말단(blunt end)을 초래할 수 있다.
선천성 면역 활성화 모티프
RNAi 제제에 의한 선천성 면역 반응은 이중가닥의 길이 또는 이중가닥의 말단 영역 구조에 의존하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 선천성 면역 반응을 증진시키기 위한 기술적 수단으로서, 5'-트리포스페이트를 도입하거나, 변형된 말단의 구조를 도입하는 접근법이 보고된 바 있다. 한편, 본 발명자들은 이중가닥 RNA에 의한 선천성 면역 반응이 특정 서열, 구체적으로, 본원의 선천성 면역 활성화 모티프의 도입에 의해 증진될 수 있음을 새롭게 규명하였다.
본 명세서에서 용어, "선천성 면역 반응"은 이중가닥 RNA로부터 유래되는 생체 내 선천적 방어 면역 시스템으로서, 치료학적 관점에서 개체의 면역력을 향상시켜 치료의 효능을 향상시키는데 기여할 수 있는 생체 내 반응을 지칭할 수 있다. 상기 선천성 면역 반응은 예를 들어, 인터페론에 유도되거나, RIG-Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene Ⅰ)의 의해 매개되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "선천성 면역 활성화 모티프"는 이중가닥 RNA가 투여된 개체의 선천성 면역 반응을 유도 또는 증진시키기 위한 기능적 구조물을 지칭하며, 구체적으로, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 이중가닥의 말단 영역에 위치 또는 삽입/도입되어 있을 수 있으며, 예를 들어, 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 상기 센스 가닥의 5' 말단에 위치하는 것일 수 있다. 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 10개 내지 20개의 뉴클레오티드일 수 있고, 상기 뉴클레오티드의 길이는 예를 들어, 10개 내지 18개, 10개 내지 16개, 10개 내지 14개, 10개 내지 12개, 12개 내지 20개, 12개 내지 18개, 12개 내지 16개, 12개 내지 14개, 14개 내지 20개, 14개 내지 18개, 또는 14개 내지 16개일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 기능적 구조물로서, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 뉴클레오티드 서열의 변이체를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서, "변이체 (variants)"는 참조 엔터티(entity)(예컨대, 야생형 서열)와 상당한 구조적 동일성을 나타내지만 하나 이상에서 참조 엔터티와 구조적으로 상이한 엔터티를 지칭한다. 특정 엔터티가 참조 엔터티의 "변이체"로 적절하게 여겨지는지 여부는 참조 엔티티와의 구조적 또는 기능적 동일성의 정도를 기초로 한다. 임의의 생물학적 또는 화학적 참조 엔터티는 특정한 고유의 구조적 요소를 갖으며, 상기 변이체는, 정의상, 하나 이상의 그러한 고유의 구조적 요소를 공유하는 별개의 화학적 엔터티를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 3-차원 공간에서 서로에 대해 지정된 위치를 갖는 복수의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 고유의 서열 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 차이 및/또는 폴리뉴클레오티드 백본에 공유 결합된 화학적 모이어티(예를 들어, 탄수화물, 지질 등)의 하나 이상의 차이로 인해 참조 폴리뉴클레오티드와 상이할 수 있다. 상기 변이체는 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의, 참조 폴리뉴클레오티드와의 전체 서열 동일성을 나타낸다.
본 명세서에서 용어, "동일성"은 폴리머 분자들 간의, 예를 들어, 핵산(예를 들어, DNA 분자들 및/또는 RNA 분자들) 간의 전체 관련성을 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 이들의 서열이 적어도, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일하다면 서로 "실질적으로 동일한" 것으로 간주된다. 두 폴리뉴클레오티드 서열의 동일성 퍼센트의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 두 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비-동일 서열이 무시될 수 있다). 예를 들어, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 이어서, 상응하는 위치에서의 폴리뉴클레오티드 서열이 비교된다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정 및 서열의 비교는 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열의 경우 BLASTN와 같이 상업적 컴퓨터 프로그램에서 입수 가능한 것들을 포함하는 임의의 다양한 알고리즘을 이용하여 비교될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 전술한 가이드 서열과 독립적으로 작동될 수 있으며, 30개 이상의 염기쌍을 포함하는 긴 이중가닥 RNA의 말단 영역에 도입되어, RIG-Ⅰ매개 선천성 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
선천성 면역 반응 유도 효과를 갖는 긴 이중가닥 RNA
본 명세서의 이중가닥 RNA는 표적 유전자의 발현 저해와 함께, 선천성 면역 반응을 증진시키는 것일 수 있다. 이를 위하여, 상기 이중가닥 RNA는 다음과 같은 조건을 만족하는 것일 수 있다: 1) 30 내지 60개 염기쌍의 듀플렉스 길이를 갖을 것, 2) 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 및 상기 센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성할 것, 및 3) 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 상기 센스 가닥의 5' 말단에 선천성 면역 활성화 모티프가 위치할 것.
본 명세서에서 용어, "발현(expression)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 상기 용어는 일반적으로, 유전자가 궁극적으로 단백질을 생성하는 과정을 의미할 수 있다. 상기 발현은 전사, 스플라이싱, 전사 후 변형, 또는 번역을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 발현 수준은 mRNA 수준 또는 단백질 수준의 검출에 의해 결정되거나 모니터링될 수 있다. 본원의 이중가닥 RNA에서, 표적 유전자의 발현 저해는 안티센스 가닥의 5' 말단 영역에 위치하는 가이드 서열 및 상기 가이드 서열과 상보적인 센스 가닥 3' 말단의 서열에 의해 달성될 수 있다.
개체에서의 표적 유전자 발현과 관련하여 사용된 용어, "억제", 저해"또는 "감소"는 비처리군 또는 정상 대조군 대비 통계적으로 유의미한 감소를 지칭한다. 상기 감소는 예를 들어, 최소 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 60%, 65%, 70%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상일 수 있으나, 이는 검출 또는 측정 방법에 따라, 검출 수준 이하일 수도 있다.
일 구체예에서, 상기 이중가닥 RNA는 30 내지 60개 염기쌍의 듀플렉스 길이를 갖는 것일 수 있다. 상기 30개 내지 60개 염기쌍의 듀플렉스 길이는 가이드 서열을 포함하는 안티센스 가닥과, 상기 안티센스 가닥과 상보적으로 결합하는 센스 가닥간 결합에 의해 형성되는 것일 수 있다. 상기 듀플렉스는 38개 내지 60개 염기쌍의 길이를 갖는 것일 수 있고, 예를 들어, 30개 내지 55개, 30개 내지 50개, 30개 내지 45개, 30개 내지 40개, 30개 내지 35개, 35개 내지 60개, 35개 내지 55개, 35개 내지 50개, 35개 내지 45개, 35개 내지 40개, 40개 내지 60개, 40개 내지 55개, 40개 내지 50개, 40개 내지 45개, 45개 내지 60개, 45개 내지 55개, 45개 내지 50개, 50개 내지 60개, 또는 55개 내지 60개 염기쌍의 길이를 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 이중가닥 RNA는 상기 안티센스 가닥의 3'말단 및 상기 센스 가닥의 5'말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것일 수 있다. 상기 "블런트 말단(blunt end)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭하며, 평활 말단과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본 명세서의 이중가닥 RNA 또는 핵산 분자와 관련하여, 상기 용어는 적어도 어느 하나의 말단에 돌출 뉴클레오티드가 없는, 이중가닥 RNA의 말단을 지칭할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 블런트 말단은 상기 선천성 면역 활성화 모티프가 위치하는 말단 영역에 형성되거나, 이중 가닥 RNA의 양 말단에 형성될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 이중가닥 RNA는 상기 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 상기 센스 가닥의 5' 말단에 선천성 면역 활성화 모티프가 위치하는 것일 수 있다. 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 10개 내지 20개의 뉴클레오티드일 수 있고, 예를 들어, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 중 어느 하나의 서열로 이루어지는 뉴클레오티드 또는 상기 뉴클레오티드의 변이체를 지칭할 수 있다. 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 전술한 이중가닥 RNA의 구조와 더불어, 서열 의존적인 방식으로 개채의 선천성 면역 반응, 구체적으로, RIG-Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene Ⅰ) 매개 선천성 면역 반응을 증진시키는데 기여할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 종래의 짧은 길이를 갖는 이중가닥 RNA 뿐만 아니라, 긴 길이 및 변형된 말단 영역을 갖는 이중가닥 RNA 역시 하나 이상의 표적 유전자에 대한 발현 조절에 적용될 수 있으며, 이중가닥 RNA의 말단 구조와 서열을 변형함으로써, 선천성 면역 반응, 예를 들어, RIG-I 매개 선천성 면역 반응을 증진시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선천성 면역 활성화 모티프는 가이드 서열과 독립적으로 작동하며, 30bp 이상의 긴 이중가닥 RNA에서, 이중가닥 RNA의 말단 영역에 위치하는 경우, 유효한 수준의 선천성 면역 반응을 유도할 수 있었다.
화학적인 변형이 도입된 이중가닥 RNA
본 명세서의 이중가닥 RNA에서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 이중가닥 RNA에 도입된 화학적 변형은 선천성 면역 반응을 증진시키기 위한 것일 수 있다. 상기 화학적 변형은 이중가닥 RNA 말단 영역에 5'-트리포스페이트를 도입하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 안티센스 가닥의 5' 말단 및 또는 센스 가닥의 5'말단 중 적어도 어느 하나의 영역에 5'-트리포스페이트를 도입하는 것일 수 있으나, 선천성 면역 반응을 증진시키기 위한 당업계의 공지의 기술이 비제한적으로 적용될 수 있다.
일 구체예에서 상기 이중가닥 RNA에 도입된 화학적 변형은 in vivo 조건 하에서 치료 효능을 항상시키고자, 세포 표적 전달능을 향상시키기 위한 것일 수 있다. 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥에서 화학적 변형은 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다: N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine; GalNAc) 유도체와의 결합; 뉴클레오티드 결합이 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 보라노포페이트(boranophosphate), 또는 메틸포스포네이트(methyl phosphonate)로 변형; 뉴클레오티드 내 당 구조의 2' 탄소 위치에서 -OH기가 -CH3(methyl), -OCH3(methoxy), -NH2, -F, -O-2-메톡시에틸-O-프로필, -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, 또는 -O-3-디메틸아미노프로필로 치환; 인산기(phosphate group), E-비닐포스포네이트 (E-Vinylphosphonate), 또는 세포 침투 펩타이드의 결합.
일 실시예에 따르면, 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 화학적 변형이 도입되지 않은 이중가닥 RNA 뿐만 아니라, 전술한 공지의 기술이 적용된 이중가닥 RNA에서도 마찬가지로 RIG-Ⅰ매개 선천성 면역 반응을 증진시킬 수 있었는 바, 이중가닥 RNA 또는 RNAi 제제에 대한 공지의 화학적 변형 기술과 접목하여 응용될 수 있다.
약학적 조성물
본 명세서에서 용어, "유효성분 (effective ingredient)"은 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 유효량의 성분을 의미한다. 구체적으로는, 유효량의 제제, 활성제, 또는 이중가닥 RNA를 의미할 수 있다.
상기 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있고, 질병을 예방하거나, 질병 상태를 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 또는 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로)을 위한 적절한 양일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "예방 (prevention)"은 질환의 발생을 미리 차단하거나, 질환을 억제하거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 예를 들어, 상기 질환 또는 이의 특징적인 특성의 발생을 막거나, 발생을 방해하거나, 상기 질환 또는 이의 특징적인 특성의 발생으로부터 방어 또는 보호하는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 용어, "치료 (treatment)"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 의미한다. 또한, 질환의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 예를 들어, 상기 간질환 또는 이의 특징적인 특성을 예방, 감소 또는 개선하거나, 또는 개체에서 상기 질환 또는 이의 특징적인 특성의 진행을 지연 (약화)시키는 것이다.
본 명세서에서 용어, "유효량 (effective amount)"은 당업계에서 일반적으로 허용되는 의미를 지칭한다. 상기 용어는 일반적으로 연구자, 수의사, 의사, 또는 기타 임상의사 등이 추구하는 세포, 조직, 시스템, 동물, 또는 인간의 의도된 생물학적 반응 (예: 유익한 반응)을 이끌어낼 분자, 화합물, 또는 구성물의 양을 의미할 수 있다. 구체적으로, "치료학적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 예컨대, 질병이나 장애와 관련된 측정 가능한 파라미터에 있어서 치료적으로 관련된 변화가 있어 특정 임상적 치료가 효과적이라고 간주될 수 있는 정도의 바람직한 의학적 반응을 이끌어낼 수 있는 분자, 화합물, 또는 구성물의 양을 의미할 수 있다. 상기 질병 또는 장애의 치료를 위한 약물의 치료학적 유효량은 상기 파라미터에서 치료적으로 관련된 변화를 초래하는데 필요한 양일 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 이중가닥 RNA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 하나 이상의 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 이중가닥 RNA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료하는 방법 또는 병리적 상태를 개선하는 방법을 제공한다.
상기 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는 방법 또는 질병을 치료하는 방법 등은 전술한 이중가닥 RNA 또는 약학적 조성물을 그대로 포함하거나 이를 이용하기 때문에, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서에서 용어, "개체"는 질병, 구체적으로 간질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양 등의 포유류를 모두 포함할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 이중가닥 RNA의 제작
본 실시예에서는 다양한 길이의 듀플렉스를 갖는 이중가닥 RNA를 제작하였다. 상기 이중가닥 RNA는 19개, 40개, 50개, 또는 60개 염기쌍의 듀플렉스를 갖는 이중가닥으로서, Survivin, 또는 LaminA/C 및/또는 GAPDH를 표적 유전자로 삼는 가이드 서열을 각각 포함하도록 제작하였다. 또한, 상기 이중가닥 RNA에서, 짧은 이중가닥(19bp)의 이중가닥 RNA는 블런트 말단을 형성하거나, 2개의 돌출부(overhang)를 형성하도록 제작하였고, 긴 이중가닥(40bp, 50bp, 60bp) RNA는 블런트 말단을 형성하거나, 1개 또는 2개의 돌출부를 형성하도록 제작하였다. 구체적으로, 상기 이중가닥 RNA는 Bioneer Co. Ltd(Republic of Korea), 및 Dharmacon, Inc (UK)로부터 수득하였고, Survivin에 대한 가이드 서열을 포함하는 이중가닥 RNA는 표 1에 나타낸 바와 같으며, LaminA/C 및/또는 GAPDH 에 대한 가이드 서열을 포함하는 이중가닥 RNA는 표 2에 나타낸 바와 같다. 표 1 및 표 2에서, 표적 유전자에 대한 가이드 서열은 진하게 표기하였으며, 말단 영역에 형성된 돌출부는 음영으로 표기하였다.
[표 1]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000001
[표 2]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000002
실시예 2. 표적 유전자에 대한 넉다운 효과 확인
본 실시예에서는 상기 실시예 1에 따른 이중가닥 RNA의 표적 유전자에 대한 넉다운 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조한 Survivin 유전자를 표적하는 19, 40, 50, 또는 60bp의 이중가닥 RNA 및 Lamin A/C와 GAPDH를 동시에 표적하는 19, 40, 50, 또는 60bp의 이중가닥 RNA의 표적 유전자에 대한 넉다운 효과를 평가하였다. 이를 위하여, 상기 HeLa (CCL-2, ATCC) 세포주를 항생제가 없는 완전 배지에서 30% 컨플루언시(confluency)로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 이후, 상기 세포주에 Survivin을 표적하는 19, 40, 50 또는 60bp의 이중가닥 RNA 또는 Lamin A/C-GAPDH를 표적하는 19, 40, 50 또는 60bp의 이중가닥 RNA를 Lipofectamine RNAiMAX(13778150; Invitrogen)를 사용하여 형질감염시켰다. 형질감염 시점으로부터 24시간 후, Tri-RNA Reagent (Favorgen)를 사용하여 총 RNA를 추출하고, 0.5㎍의 총 RNA를 cDNA 합성에 사용하였다. 표적 유전자에 대한 프라이머를 SYBR Green PCR Master Mix와 혼합하고 상대 표준 곡선 정량 방법(relative standard curve quantitation method)을 사용하여 표적 유전자 mRNA 수준을 측정하였다. 이후, GraphPad Prism 8을 사용하여, 용량-반응 곡선에 기초한 IC50 값을 산출하였다.
또한, HAP1 세포주(WT) 또는 HAP1 Dicer KO 세포주(Dicer knock-out)를 항생제가 없는 완전 배지에서 30% 컨플루언시(confluency)로 24웰 플레이트에 플레이팅하고, 상기와 동일한 방식으로, 이후, 상기 세포주에 Survivin을 표적하는 0.3nM의 19, 40, 50 또는 60bp의 이중가닥 RNA 또는 Lamin A/C-GAPDH를 표적하는 1nM의 19, 40, 50 또는 60bp의 이중가닥 RNA를 Lipofectamine RNAiMAX(13778150; Invitrogen)를 사용하여 형질감염시키고, 표적 유전자 mRNA 수준을 측정하였다. 한편, 본 실시예에서 대조군은 형질 감염 시약만을 첨가한 군(mock) 및 이중가닥 RNA를 처리하지 않은 군(NT)을 사용하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 모든 이중가닥 RNA는 길이 또는 말단 구조에 관계없이 표적 유전자에 대해 0.5nM 미만의 IC50 값을 나타내었다.
[표 3]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000003
또한, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 이중가닥 RNA에 의한 각각의 표적 유전자에 대한 넉다운 효과는 Dicer가 결여된 조건 하에서도 발휘되었다. 상기 결과는 종래의 짧은 길이를 갖는 이중가닥 RNA뿐만 아니라, 긴 길이 및 변형된 말단 영역을 갖는 이중가닥 RNA 역시 하나 이상의 표적 유전자에 대한 발현 조절에 적용될 수 있음을 나타내는 것이다.
실시예 3. 선천성 면역 반응 유도 효과 확인
3-1. 구조 의존적 선천성 면역 반응 유도 효과
본 실시예에서는 이중가닥 RNA의 말단 구조가 선천성 면역 반응에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 이중가닥 RNA를 T98G 세포주에 형질감염시키고 선천성 면역 반응과 관련된 사이토카인 발현을 분석하였다. 구체적으로, T98G (CRL-1690, ATCC) 세포주를 항생제가 없는 완전 배지에서 30% 컨플루언시로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 이후 상기 세포주에 Survivin을 표적하는 10nM의 19, 40, 50 또는 60bp의 이중가닥 RNA, 또는 Lamin A/C-GAPDH를 표적하는 10nM의 19, 40, 50 또는 60bp의 이중가닥 RNA를 Lipofectamine RNAiMAX(13778150; Invitrogen)를 사용하여 형질감염시키고, 상기 형질전환된 세포를 각각 12시간 또는 24시간 후에 수득하였다. 이후, IFIT1, ISG15, CXCL10 수준을 상기 실시예 2의 방법에 따라 qRT-PCR을 사용하여 분석하였다. 한편, 본 실시예에서 양성 대조군은 Poly I:C를 투여한 군, 대조군은 형질 감염 시약만을 첨가한 군(mock) 및 이중가닥 RNA를 처리하지 않은 군(NT)을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 40 bp 이상의 길이를 갖는 이중가닥 RNA는 선천성 면역 반응과 관련된 사이토카인의 높은 발현을 유도하였으며, 이러한 발현 유도 효과는 이중가닥 RNA의 말단 구조가 블런트 말단인 경우에 보다 현저하였다. 상기 결과로부터 선천성 면역 반응은 이중가닥 RNA의 말단 구조에 영향을 받음을 알 수 있었다. 다만, 이중가닥 RNA의 길이 변화에 따른 발현 유도 효과는 Survivin을 표적하는 이중가닥 RNA와 Lamin A/C-GAPDH를 표적하는 이중가닥 RNA간 상반되는 경향성을 보여주었는 바, 전술한 이중가닥 RNA의 말단 구조이외, 다른 기능적 요소에 의해 조절될 수 있음을 알 수 있었다.
3-2. RIG-I 매개 선천성 면역 반응 유도 효과
본 실시예에서는 상기 선천성 면역 반응을 매개하는 인자로서, RIG-Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene Ⅰ)와의 관련성을 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 이중가닥 RNA를 RAW-Lucia ISG 세포주(WT) 및 RAW-Lucia ISG-KO-RIG-I 세포주(RIG-I KO)에 형질감염시킨 후, 이를 통해 유도되는 선천성 면역 반응의 수준을 IRF의 활성도로 평가하였다. 구체적으로, RAW-Lucia ISG 세포주 및 RAW-Lucia ISG-KO-RIG-I 세포주를 96웰 플레이트에 웰당 1 × 105개씩 플레이팅하였다. 이후, 상기 세포주에 상기 이중가닥 RNA를 Lipofectamine RNAiMAX(13778150; Invitrogen)를 사용하여 형질감염시키고, 상기 형질전환된 세포를 각각 24시간 배양한 후에 상득액 수득하였다. 이후, 상등액을 대상으로, 플레이트 판독기(VICTORX2; PerkinElmer)를 사용하여, 인터페론 조절 인자(IRF) 활성 수준을 검출하였다. 한편, 본 실시예에서 양성 대조군은 Poly I:C 및/또는 LPS를 투여한 군, 대조군은 형질 감염 시약만을 첨가한 군(mock) 및 이중가닥 RNA를 처리하지 않은 군(NT)을 사용하였다.
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 3-1의 결과와 마찬가지로, 이중가닥 RNA의 말단 구조가 블런트 말단인 경우, 구체적으로, 적어도 어느 하나의 말단에서 블런트 말단을 형성하는 경우, 선천성 면역 반응의 유도가 증진되었고, RIG-Ⅰ가 결여된 ISG-KO-RIG-I 세포주에서는 이러한 선천성 면역 반응이 소실되거나 현격하게 감소되었다. 상기 결과는 이중가닥 RNA의 말단 구조로부터 비롯된 선천성 면역 반응은 RIG-Ⅰ가 매개하는 것임을 나타내는 것이다.
실시예 4. 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 긴 이중가닥 RNA의 제작
본 실시예에서는 표적 유전자에 대한 발현 억제와 함께, 선천성 면역을 활성화시킬 수 있는 다양한 길이의 듀플렉스(duplex)를 갖는 이중가닥 RNA를 제작하였다. 도 6에 도시한 바와 같이, 상기 이중가닥 RNA는 38 내지 60개 염기쌍의 듀플렉스를 갖는 이중가닥으로서, 1) 안티센스 가닥의 5'말단 영역에 표적 유전자에 대한 가이드 서열, 2) 상기 안티센스 가닥과 상보적인 결합을 형성하는 센스 가닥의 5' 말단 영역에 서열번호 5(19nt) 또는 서열번호 7(20nt)의 선천성 면역 활성화 모티프가 위치하도록 제작되었다. 또한, 이중가닥 RNA의 구조에 따른 효능을 비교하기 위하여, 전술한 기본 구조를 바탕으로 이중가닥의 말단 부분을 변형하여, 블런트 말단, 1개의 돌출부, 또는 2개의 돌출부를 갖는 이중가닥 RNA를 제작하였다. 구체적으로, 상기 이중가닥 RNA는 Bioneer Co. Ltd(Republic of Korea), 및 Dharmacon, Inc (UK)로부터 수득하였고, 서열번호 5의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA는 표 4에 나타낸 바와 같으며, 서열번호 7의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA는 표 5에 나타낸 바와 같다. 표 4 및 표 5에서, 선천성 면역 활성화 모티프 서열은 밑줄로 표기하였고, 표적 유전자에 대한 가이드 서열은 진하게 표기하였으며, 말단 영역에 형성된 돌출부는 음영으로 표기하였다.
[표 4]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000004
[표 5]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000005
실시예 5. 선천성 면역 활성화 모티프 도입에 따른 효과 확인
5-1. 표적 유전자에 대한 넉다운 효과
본 실시예에서는 상기 실시예 4에 따른 이중가닥 RNA의 표적 유전자에 대한 넉다운 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, 상기 실시예 4에 따른 서열번호 5의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 19, 38, 50, 또는 60bp의 이중가닥 RNA의 Luciferase 유전자에 대한 넉다운 효과를 Luciferase plasmid(E1741, Promega가 처리된 HeLa (CCL-2, ATCC) 세포주를 대상으로, 실시예 2와 동일한 방식으로 평가하였다.
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, 모든 이중가닥 RNA는 길이 또는 말단 구조에 관계없이 표적 유전자에 대해 0.5nM 미만의 IC50 값을 나타내었다. 상기 결과는 상기 이중가닥 RNA 내 선천성 면역 활성화 모티프의 도입은 가이드 서열의 표적 유전자 넉다운 효과에 영향을 미치지 않으며, 이와는 독립적으로 작용할 수 있음을 나타내는 것이다.
[표 6]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000006
5-2. 서열 의존적 선천성 면역 반응 유도 효과
본 실시예에서는 이중가닥 RNA의 말단에 도입된 모티프가 선천성 면역 반응에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 상기 실시예 4에 따른 서열번호 5의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 19, 38, 50, 또는 60bp의 이중가닥 RNA 및 서열번호 7의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 20, 또는 40bp의 이중가닥 RNA에 대하여 상기 실시예 3-1과 동일한 방식으로, 선천성 면역 반응과 관련된 사이토카인 발현을 분석하였다. 한편, 본 실시예에서 양성 대조군은 Poly I:C를 투여한 군, 대조군은 형질 감염 시약만을 첨가한 군(mock) 및 이중가닥 RNA를 처리하지 않은 군(NT)을 사용하였다.
그 결과, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 서열번호 5의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA는 선천성 면역 반응과 관련된 사이토카인의 높은 발현을 유도하였다. 특히, 이러한 효과는 이중가닥 RNA의 말단 구조가 블런트 말단인 경우에 보다 우수하였으며, 상기와 동일한 구조를 지니되, 이중가닥 RNA의 말단에 상기 모티프가 도입되지 않은 실시예 3-1의 이중가닥 RNA의 효과에 비해, 매우 현저한 것이었다. 이러한 결과는 상기 선천성 면역 반응의 유도는 이중가닥 RNA의 말단 영역의 서열에 영향을 받음을 나타내는 것이다.
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 서열번호 7의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA 역시 선천성 면역 반응과 관련된 사이토카인의 높은 발현을 유도하였다. 특히, 상기와 동일한 구조를 지니되, 이중가닥 RNA의 말단에 상기 모티프가 도입되지 않은 40bp의 이중가닥 RNA(Lamin A-G-GAPDH, Lamin A/C-Luciferase, GAPDH-Luciferase)를 처리한 군과, 짧은 길이의 가이드 서열 및 모티프 서열 각각을 혼합하여 처리한 군에서는 모두 유효한 수준의 선천성 면역 반응을 유도하지 못하였는 바, 전술한 유도 효과는 상기 모티프의 선천성 면역 반응 유도 효과는 약 30bp 이상의 길이를 갖는 이중가닥 RNA에서 발휘될 수 있음을 나타낸다.
5-3. RIG-I 매개 선천성 면역 반응 유도 효과
본 실시예에서는 상기 서열/길이에 의존하는 선천성 면역 반응을 매개하는 인자로서, RIG-Ⅰ와의 관련성을 확인하고자 하였다. 상기 실시예 4에 따른 서열번호 5의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 19, 38, 50, 또는 60bp의 이중가닥 RNA 및 서열번호 7의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 20, 또는 40bp의 이중가닥 RNA에 대하여 상기 실시예 3-2과 동일한 방식으로, RAW-Lucia ISG 세포주(WT) 및 RAW-Lucia ISG-KO-RIG-I 세포주(RIG-I KO)에 대한 IRF의 활성도를 측정하였다. 한편, 본 실시예에서 양성 대조군은 Poly I:C 및/또는 LPS를 투여한 군, 대조군은 형질 감염 시약만을 첨가한 군(mock) 및 이중가닥 RNA를 처리하지 않은 군(NT)을 사용하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 RAW-Lucia ISG 세포주 세포주에서의 선천성 면역 반응은 실시예 5-2의 결과와 유사한 경향성을 보여주었으나, RIG-Ⅰ가 결여된 ISG-KO-RIG-I 세포주에서는 이러한 선천성 면역 반응이 소실되거나 현격하게 감소되었다. 특히, 도 10에 나타낸 바와 같이, 상기 이중가닥 RNA에서, 양 말단이 모두 블런트 말단을 형성하는 경우뿐만 아니라, 선천성 면역 활성화 모티프와 인접하는 어느 하나의 말단 영역에 블런트 말단이 형성된 경우에도 유사한 효과를 보여주었다. 상기 결과는 이중가닥 RNA의 말단 영역에 위치하는 모티프 서열로부터 비롯된 선천성 면역 반응은 RIG-Ⅰ가 매개하는 것임을 나타내는 것이다.
실시예 6. 변형된 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 긴 이중가닥 RNA의 선천성 면역 반응 유도 효과 확인
본 실시예에서는 선천성 면역 활성화 모티프의 기능성과 연관된 핵심 서열을 도출하기 위하여, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 (10nt), 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열 (15nt)가 말단에 위치하는 이중가닥 RNA를 제작하였으며, 구체적인 구조는 도 6에 도시한 바와 같다. 이와 더불어, 상기 모티프가 위치하는 영역에 따른 효과의 차이를 비교하고자, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열이 말단이 아닌 영역에 도입된 이중가닥 RNA를 추가로 제작하였다. 구체적으로, 상기 이중가닥 RNA는 Bioneer Co. Ltd(Republic of Korea), 및 Dharmacon, Inc (UK)로부터 수득하였고, 서열번호 1 또는 서열번호 3의 선천성 면역 활성화 모티프를 포함하는 이중가닥 RNA는 표 7에 나타낸 바와 같다. 표 7에서, 선천성 면역 활성화 모티프 서열은 밑줄로 표기하였고, 표적 유전자에 대한 가이드 서열은 진하게 표기하였다.
[표 7]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000007
이후, 실시예 3-2과 동일한 방식으로, RAW-Lucia ISG 세포주(WT) 및 RAW-Lucia ISG-KO-RIG-I 세포주(RIG-I KO)에 대한 IRF의 활성도를 측정하였다. 한편, 본 실시예에서 양성 대조군은 Poly I:C 및/또는 LPS를 투여한 군, 대조군은 형질 감염 시약만을 첨가한 군(mock) 및 이중가닥 RNA를 처리하지 않은 군(NT)을 사용하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열이 말단에 포함된 이중가닥 RNA 역시 상기 실시예 5-3과 동일하게, RIG-Ⅰ매개 선천성 면역 반응을 증진시킬 수 있었다. 다만, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열이 전체 서열의 중앙으로 이동된 이중가닥 RNA(Motif-20-Shifted)는 이러한 효과가 현격하게 감소되었다. 상기 결과로부터 10nt로 이루어진 서열번호 1의 모티프는 선천성 면역 반응 유도를 위한 단위체 또는 핵심 서열로 적용될 수 있고, 상기 서열은 이중가닥 RNA 내 말단 영역에 도입 또는 위치하는 경우에 유효한 효능이 발휘될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 7. 30bp의 길이를 갖는 긴 이중가닥 RNA의 효능 확인
본 실시예에서는 실시예 5 및 실시예 6의 실험 결과를 토대로, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 (10nt)이 이중가닥 RNA의 말단에 위치하며, 양 말단이 블런트 말단인, 30bp의 이중가닥 RNA를 제조하였다. 한편, 상기 선천성 면역 활성화 모티프의 위치가 선천성 면역 반응에 미치는 영향을 확인하고자, 센스 가닥의 5'말단에 선천성 면역 활성화 모티프가 위치하는 이중가닥 RNA(LaminA/C-Motif-10), 및 안티센스 가닥의 3'말단에 선천성 면역 활성화 모티프가 위치하는 이중가닥 RNA(LaminA/C-inv. Motif-10)를 각각 제조하였다. 구체적으로, 상기 이중가닥 RNA는 Bioneer Co. Ltd(Republic of Korea), 및 Dharmacon, Inc (UK)로부터 수득하였고, 전술한 이중가닥 RNA는 표 8에 나타낸 바와 같다. 표 8에서, 선천성 면역 활성화 모티프 서열은 밑줄로 표기하였고, 표적 유전자에 대한 가이드 서열은 진하게 표기하였다.
[표 8]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000008
이후, Huh7 세포주를 대상으로 상기 실시예 2와 동일한 방식으로 10nM의 이중가닥 RNA의 처리에 따른 표적 유전자인 Lamin A/C의 넉다운 효과를 확인한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 30bp의 길이를 갖는 이중가닥 RNA 역시 실시예 5-1과 유사한 넉다운 효과를 보여주었다.
또한, 실시예 5-3과 동일한 방식으로, 10nM의 이중가닥 RNA의 처리에 따른 RAW-Lucia ISG 세포주(WT) 및 RAW-Lucia ISG-KO-RIG-I 세포주(RIG-I KO)에 대한 IRF의 활성도를 측정한 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 선천성 면역 활성화 모티프가 센스 가닥의 5' 말단에 위치하는 경우뿐만 아니라, 안티센스 가닥의 3' 말단에 위치하는 경우에도, 선천성 면역 반응을 증진시킬 수 있으며, 이러한 선천성 면역 반응 역시 RIG-Ⅰ이 매개하는 것임을 알 수 있었다.
실시예 8. 5'-트리포스페이트가 도입된 긴 이중가닥 RNA의 선천성 면역 반응 유도 효과 확인
5'-트리포스페이트의 도입은 선천성 면역 반응 유도하는 기존의 방식 중 하나로서, 본 실시예에서는 이러한 종래의 기술이 도입된 이중가닥 RNA에서도 상기 선천성 면역 활성화 모티프의 기능성이 유효하게 발휘될 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 서열번호 7의 모티프를 포함하는 40bp의 이중가닥 RNA를 기본 구조로 하여, 말단 영역에 5'-트리포스페이트가 도입된 이중가닥 RNA를 제작하였다. 구체적으로, 상기 이중가닥 RNA는 Dharmacon, Inc (UK)로부터 수득하거나 HiScribeTM　T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (E2050S ; NEB)를 이용하여 합성하였으며, 서열번호 7의 선천성 면역 활성화 모티프 및 5'-트리포스페이트를 포함하는 이중가닥 RNA는 표 9에 나타낸 바와 같다. 표 9에서, 선천성 면역 활성화 모티프 서열은 밑줄로 표기하였고, 표적 유전자에 대한 가이드 서열은 진하게 표기하였며, PPP는 5'-트리포스페이트를 나타낸다.
[표 9]
Figure PCTKR2022013822-appb-img-000009
이후, 실시예 3-2과 동일한 방식으로, RAW-Lucia ISG 세포주(WT) 및 RAW-Lucia ISG-KO-RIG-I 세포주(RIG-I KO)에 대한 IRF의 활성도를 측정하였다. 한편, 본 실시예에서 양성 대조군은 Poly I:C 및/또는 LPS를 투여한 군, 대조군은 형질 감염 시약만을 첨가한 군(mock) 및 이중가닥 RNA를 처리하지 않은 군(NT)을 사용하였다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, 이중가닥 RNA의 말단 영역에 5'-트리포스페이트가 도입된 이중가닥 RNA 역시 상기 실시예 5-3과 동일하게, RIG-Ⅰ매개 선천성 면역 반응을 증진시킬 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 가이드 서열을 포함하는 안티센스 가닥; 및 상기 안티센스 가닥과 상보적으로 결합하는 센스 가닥으로 이루어지는 30개 내지 60개 염기쌍(bp)의 듀플렉스 (duplex) 길이를 갖는 이중가닥 RNA로서,
    상기 안티센스 가닥의 3' 말단 및 상기 센스 가닥의 5' 말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하고,
    상기 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 상기 센스 가닥의 5' 말단에 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 선천성 면역 활성화 모티프가 위치하는 것인, 이중가닥 RNA.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 서열은 15개 내지 25 개의 뉴클레오티드(nt) 길이를 갖는 것인, 이중가닥 RNA.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 서열은 효소, 전사 인자, 분비 시그널링 단백질, 신호 전달 단백질, 키나아제, 포스파타아제, 세포 수용체, 이온 채널, 또는 이의 조합을 표적으로 하는 서열을 포함하는 것인, 이중가닥 RNA.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 서열은 암 세포의 성장 및 생존과 연관된 단백질을 표적으로 하는 서열을 포함하는 것인, 이중가닥 RNA.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 가이드 서열은 상기 안티센스 가닥의 5'말단에 위치하는 것인, 이중가닥 RNA.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 10개 내지 20개의 뉴클레오티드(nt) 길이를 갖는 것인, 이중가닥 RNA.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 선천성 면역 활성화 모티프는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 7 중 어느 하나의 서열로 이루어진 것인, 이 중가닥 RNA.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 듀플렉스는 38개 내지 60개 염기쌍(bp)의 길이를 갖는 것인, 이중가닥 RNA.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5'말단 및 상기 센스 가닥의 3'말단은 블런트 말단(blunt end)을 형성하는 것인, 이중가닥 RNA.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 이중가닥 RNA는 RIG-Ⅰ(Retinoic acid-inducible gene Ⅰ) 매개 선천성 면역 반응을 증진시키는 것인, 이중가닥 RNA.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥은 하나 이상의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는 것인, 이중가닥 RNA.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥의 5' 말단은 트리포스페이트(Triphosphate)가 결합된 것인, 이중가닥 RNA.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 따른 이중가닥 RNA를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 청구항 13에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 하나 이상의 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 방법은 상기 약학적 조성물이 투여된 개체의 선천성 면역 반응을 증진시키는 것인, 방법.
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