KR20070062515A

KR20070062515A - 가스트린-특이적 간섭 ｒｎａ

Info

Publication number: KR20070062515A
Application number: KR1020077005675A
Authority: KR
Inventors: 수잔 에이 왓슨; 안나 그라보우스카
Original assignee: 리셉터 바이오로직스 인크
Priority date: 2004-08-11
Filing date: 2005-08-10
Publication date: 2007-06-15
Also published as: WO2006016275A3; EP1778841A2; AU2005270917A8; WO2006016275A2; AU2005270917A1; CA2576576A1

Abstract

본 발명은 가스트린 호르몬 유전자를 하향조절하는 가스트린-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자를 제공한다. 본 발명의 RNAi 분자는 변형된 염기 및 염기 사이의 비-포스페이트 연결을 포함할 수 있는 이본쇄 RNA 분자이다. 본 발명의 RNAi 분자의 상보적 쇄는 뉴클레오티드 쇄 또는 비-뉴클레오티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 본 발명의 RNAi 분자는, 가스트린-매개된 종양, GERD, 졸링거-엘리슨 증후군, 고가스트린혈증, 악성 빈혈, 위 웨양, 십이지장 궤양 및 에이취 피롤리 감염을 포함하는 가스트린-매개된 질환 또는 병리상태를 치료하는 방법에 유용한 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.

가스트린, 가스트린-특이적 간섭 RNA, 가스트린-매개된 종양, GERD, 졸링거-엘리슨 증후군, 고가스트린혈증

Description

가스트린-특이적 간섭 ＲＮＡ{Gastrin-specific interfering RNA}

본 발명은 가스트린 호르몬을 암호화하는 유전자의 발현을 억제하는 짧은 리보핵산 중합체에 관한 것이다. 특히, 본 발명은, 가스트린 메신저 RNA(mRNA)를 표적으로 하여 분해를 강화하고, 어떤 경우에는 해독을 차단하여 발현이 감소되거나 완전히 방해되도록 하는 짧은 리보핵산 중합체 분자에 의한 가스트린 유전자 발현의 억제에 관한 것이다.

작은 리보핵산 분자에 의한 정상적 발현 과정의 전사후 유전자-특이적 간섭(interference)이 많은 계에서 보고되어졌다. 구조 및 활성에 있어서의 차이를 토대로 하여, 이들 간섭 RNA (interfering RNA)(RNAi) 분자는 두 개의 주요 부류로 분류될 수 있다: 소형 간섭 RNA 및 마이크로RNA.

소형 간섭 RNA (siRNA)는 일반적으로, 약 22개 뉴클레오티드 길이의 리보뉴클레오티드 쇄가 쌍을 형성하여 이루어진 이본쇄 RNA이다 [참조: Ruvkin, G. (2001) Glimpses of a Tiny RNA World. Science 294: 797-799]. 최근에, 27-량체가 어떤 표적에 대해 효과적인 것으로 밝혀졌다 [참조: Kim et al (2005) Nature Biotechnology 2: 222]. siRNA는 현재는 전사후 유전자 침묵(gene silencing)의 표시로 알려진 공동-억제 현상에 관여하는 분자로서 식물에서 최초로 동정되었다. 또한, 진균인, Neurospora에서 발견된 siRNA는 초파리인 Drosophila에서 유전자 "억압(quelling)" 및 RNA 간섭의 현상에 관여하는 것이 밝혀졌다. 검토하고자 하는 경우, 문헌[Calpen & Mousses (2003) N. Y. Acad . Sci . 1002: 56-62]을 참조하라.

소위 "디서(Dicer)" 활성을 가진 신규한 RNAse III-유사 효소의 존재가 siRNA에 의한 유전자 침묵의 이들 예에서 각각 확인되었다. 디서(Dicer)는 효소작용으로 이본쇄 RNA를 절단하여, 30개 미만 염기쌍의 구성원 RNA 쇄를 가진 siRNA를 생성시킨다.

또한, siRNA는 표적 서열을 보유하는 mRNA의 특이적 표적화를 매개하는 RNA-유도된 침묵 복합체 또는 RISC로 불리는 리보핵산-단백질 복합체에서 작용한다는 것이 밝혀졌다. 표적화는 RISC 중의 siRNA의 안티센스 쇄 성분과 mRNA와의 정렬(alignment)에 의해 이루어진다. 후속적으로, 표적 mRNA는 표적 서열 내의 부위에서 절단되어, 다른 세포내 리보뉴클리아제에 의해 급속하게 분해되기 쉬워진다 [참조: Denli and Harmon (2003) RNAi: An ever growing puzzle. Trends Biochem . Sci. 28: 196].

헤어핀 siRNA의 유도성 발현을 제공하는 벡터가 표적 유전자 발현의 녹-다운(knock-down)을 위해 작제되었다 [참조: Matsukura et al. (2003) Establishment of Conditional Vectors for Hairpin siRNA Knockdowns, Nucl . Acids Res. 31(15): e77].

마이크로RNA (miRNA)는 siRNA와는 구분되는 제2 부류의 RNAi 분자이고, 수 백개의 마이크로RNA가 초파리로부터 연충 및 식물로부터 사람에 이르는 다양한 그룹의 생물체에서 동정되었다 [참조: Ambros, V. (2003) MicroRNA pathways in flies and worms. Cell 113: 673-676]. 마이크로RNA는 21-23개 뉴클레오티드의 일본쇄 RNA 분자로서, 이는 통상적으로 줄기-고리(stem-loop) 구조 형태의 보다 큰 이본쇄 분자로부터 프로세싱된 것이다. 이본쇄 miRNA 전구체는, "디서(Dicer)" 효소에 의해 프로세싱된 자기-상보적 접힘 구조를 형성하는 비-단백질-암호화 유전자로부터 전사된다.

마이크로RNA는 정상적 세포 분화 및 다세포 구조의 발달에 있어 중요하다 [참조: Carrington and Ambros (2003) Role of microRNAs in Plant and Animal Development. Science 301: 336-338]. miRNA는 불완전하게 일치(match)하는 서열에서 하이브리화함으로써 표적 mRNA에 결합하여, 이의 해독을 방지하는 내인성 조절 분자이다. 단백질/펩티드 합성의 이러한 유전자-특이적 차단은, siRNA 분자에 의해 유발되는 표적화된 mRNA의 분해와는 상이하다. 이러한 후자의 기능은 siRNA의 안티센스 쇄의 서열과 mRNA의 표적 서열의 완전한 또는 거의 완전한 하이브리드화 일치에 의존적인 것으로 보인다. 이와 달리, 마이크로RNA는 표적 mRNA에 불완전하게 일치하여, 표적 mRNA 서열과 짧은 길이에서 하이브리드화하고, RISC에 의한 RNA 분해를 위한 충분한 길이의 이본쇄 서열을 제공하지 않는다.

ICAM-1 mRNA 내의 상이한 부위에 표적화되는 siRNA의 효능은 광범위한 농도 에서 입증되었으며, siRNA는 안티센스 RNA에 의한 억제에 필요한 최소 농도보다도 천 배 낮은 나노몰 농도에서 효과적인 것으로 밝혀졌다 [참조: Kretschmer-Kazemi & Sczakiel (2003) The Activity of siRNA in Mammalian Cells is Related to Structural Target Accessibility: A Comparison with Antisense Nucleotides, Nucl. Acids Res. 3l(15): 4417-4424].

신(de novo) 유전자 발현의 완전한 제거 후일지라도, 장기간의 단백질 반감기 및 기능의 지속이 종양-특이적 마커인, NPM-ALK 키나제 단백질에서 나타났다. 이러한 단백질은, 악성 형질전환을 촉발하는 역형성 거대 세포 림프종 (ALCL: Anaplastic Large Cell Lymphoma)에서 구성적으로 활성화된다 [참조: Ritter et al. (2003) Design and Evaluation of Chemically Synthesized siRNA Targeting the NPM-ALK Fusion Site in ALCL, Oligonucleotides 13: 365-373].

소형 간섭 RNA 분자가 암 관련 단백질인, 클러스테린(clusterin), IGFBP-2, IGBFBP-5, Mitf 및 B-raf (참조: WO 2004/018676); VEGF와 같은 성장 인자의 유전자의 발현, 및 발현시 종양 성장을 자극하는 기타 유전자의 발현을 녹-다운(knock-down)하는 것으로 밝혀졌다 [참조: Yin et al. SiRNA agents inhibit oncogene expression and attenuate human tumor cell growth (2003) J. Exp . Therapeut . Oncol. 3: 194-204]. 헬라(HeLa) 세포, 폐 선암종 세포 및 흑색종 세포가 siRNA-적재된 양이온성 지질 복합체로 성공적으로 형질감염되었다. 그러나, 성장 인자 유전자 특이적 siRNA가 이들의 동족 표적의 녹-다운을 나타낼지라도, 암 세포 증식의 억제에서의 효능은 상이하였다. 다중유전자 녹-다운에 의한 암 세포의 성장 및 증식의 현저한 억제를 달성하는데 5종의 siRNA의 칵테일 조합이 필요하였다.

소형 간섭 RNA는 치료적 개입을 위해 표적화된 매우 다양한 세포 기능의 연구, 예를 들어, 세포 주기 조절 및 아폽토시스(apoptosis)에서의 p53, TNF-알파, bcl-2 및 카스파제(caspase), 성장 인자 및 이의 조절, 단백질 키나제 및 시그날전달 요소, RNA 안정성, DNA 복구 및 종양 복귀의 연구에 사용되었다 [참조: Lu et al. (2003) siRNA-mediated anti-tumorigenesis for drug target validation and therapeutics, Curr . Opin . Mol . Therapeutics 5(3): 225-234; and Zender & Kubicka (2004) SiRNA based strategies for inhibition of apoptotic pathways in vivo-analytical and therapeutic implications, Apoptosis 9: 5 l-54].

siRNA가 생체내 특정 기관으로 전달되는 모델 시스템에서 연구한 결과, 표적화된 내인성 유전자 또는 도입된 유전자의 효과적인 녹-다운 발현이 나타났다. 예를 들면, 마우스 뇌의 선조 영역으로 주입된 재조합 벡터로부터 증강된 녹색 형광성 단백질 (eGFP)의 발현은 eGFP-표적화된 siRNA에 의해 감소되는 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 마우스 간에서 베타-글루쿠로니다제에 표적화된 siRNA가 표적화된 유전자의 발현을 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이들은 siRNA에 의한 유전자 침묵의 생체내 효능을 입증하는 현재 이용가능한 다수의 예 중 단지 2개일 뿐이다 [참조; Xia et al. (2002) siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo, Nature Biotechnol . 20: 1006-1010].

가스트린의 수준이 크게 증가하여 상태가 악화된 환자에게서 가스트린 유전자 발현을 감소시키거나 또는 심지어 완전히 침묵시킬 수 있는, 가스트린-촉진된 질환 및 병리상태에 대한 신규한 치료법이 필요하다. 이들 조직에서 가스트린 유전자 발현을 가역적으로 조절하는 방법이 현재 이용가능한 치료법에 보조적으로 유용할 것이다.

발명의 개요

본 발명은, 가스트린 mRNA(mRNA)에 결합하기에 충분히 가스트린 유전자의 암호 서열의 부분에 대해 상보적인 약 19 내지 21개 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 24개, 또는 약 19 내지 27개, 또는 약 19 내지 29개 뉴클레오티드의 표적 서열을 포함하는 약 90개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는, 가스트린-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은, RNA 간섭에 의해 가스트린 호르몬 유전자의 발현을 억제하는 이본쇄 소형 간섭 RNA (siRNA) 분자를 제공한다. 본 발명의 siRNA는, 가스트린 유전자의 약 19 내지 약 21개 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 약 24개 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 약 27개 뉴클레오티드의 짧은 길이에 상보적인 안티센스 쇄 서열에 상응하는 서열을 표적화함으로써, 가스트린 유전자 발현을 특이적으로 간섭하고, 가스트린 mRNA를 표적화한다.

또한, 본 발명은, 가스트린 유전자의 암호 서열의 부분에 부분적으로 상보적이고 가스트린 mRNA(mRNA)에 결합하는 약 19 내지 약 21개 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 약 24개 뉴클레오티드, 최대 약 27개 뉴클레오티드일 수 있는 표적화 서열을 포함하는 약 90개 이하의 뉴클레오티드 길이의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는 가스트린 유전자-특이적 마이크로-리보핵산 (miRNA) 분자를 제공한다.

본 발명은 또한, 가스트린 mRNA (mRNA)에 결합하기에 충분히 가스트린 유전자의 암호 서열의 부분에 대해 상보적인 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-24개 뉴클레오티드, 또는 약 19-27개 뉴클레오티드, 또는 약 19-29개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 약 90개 이하의 뉴클레오티드 길이의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자, 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명은, 가스트린 mRNA (mRNA)에 결합하기에 충분히 가스트린 유전자의 암호 서열 부분에 대해 상보적인 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-24개 뉴클레오티드, 또는 약 19-27개 뉴클레오티드, 또는 약 19-29개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 약 90개 이하의 뉴클레오티드 길이의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 가스트니-촉진된 질환 또는 병리상태를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은, 가스트린 mRNA(mRNA)에 결합하기에 충분히 가스트린 유전자의 암호 서열의 부분에 대해 상보적인 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-24개 뉴클레오티드, 또는 약 19-27개 뉴클레오티드, 또는 약 19-29개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 약 90개 이하의 뉴클레오티드 길이의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는 가스트린-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자를 세포에 접촉시킴을 포함하여, 세포 내에서 가스트린 유전자 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.

또한, 가스트린 mRNA(mRNA)에 결합하는, 가스트린 유전자의 암호 서열의 부분에 충분히 상보적인 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-24개 뉴클레오티드, 또는 약 19-27개 뉴클레오티드, 또는 약 19-29개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 약 90개 이하의 뉴클레오티드 길이의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는 가스트린-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자를 발현하는 핵산 벡터가 제공된다.

추가로, 본 발명은, 가스트린 mRNA(mRNA)에 결합하는, 가스트린 유전자의 암호 서열의 부분에 충분히 상보적인 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-27개 뉴클레오티드, 또는 약 19-29개 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 약 90개 이하의 뉴클레오티드 길이의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는 가스트린-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자를 발현하는 핵산 벡터를 보유하는 숙주 세포를 제공한다.

도 1: 형질감염 1회당 1, 2 또는 4㎕ 형질감염 시약을 사용하여 tg5 또는 scrtg5 siRNA로 Pan1 세포를 형질감염시킨 후 1일째의 가스트린 유전자 발현 (2^-ΔΔCt).

도 2: 형질감염 1회당 1, 2 또는 4㎕ 형질감염 시약을 사용하여 tg8 또는 scrtg8 siRNA로 HCT116 세포를 형질감염시킨 후 1일째의 가스트린 유전자 발현 (2^{- ΔΔCt}).

도 3: 일정 범위의 농도 (비희석 (20nM), 1:3 (6nM) 및 1:10 (2nM))의 시험관내 합성된 전 범위의 가스트린 siRNA로 Pan1 세포를 형질감염시킨 후 1일째의 가스트린 유전자 발현 (2^-ΔΔCt).

도 4: 시험관내 합성된 전 범위의 가스트린 siRNA (20nM)로 Pan1 세포를 형질감염시킨 후 1일 및 4일째의 가스트린 유전자 발현 (2^-ΔΔCt).

도 5: 40nM (비희석) 또는 4nM (1:10 희석)의 상업적으로 합성된 tg8 또는 scrtg8 siRNA로 Pan1, HCT116, MGLVAl 또는 OE19 세포를 형질감염시킨 후 1일째의 가스트린 유전자 발현. a)의 데이터는 2^-ΔΔCt에 의한 것이고, b)의 데이터는 2^-ΔCt에 의한 것이다.

도 6: 상업적으로 합성된 tg8 또는 scrtg8 siRNA의 40nM의 농도에서 출발하여 일련의 1:4 희석물로 HCT116 세포를 형질감염시킨 후 1일째의 가스트린 유전자 발현 (2^-ΔΔCt).

도 7: 40nM (비희석) 또는 4nM (1:10 희석)의 상업적으로 합성된 tg8 또는 scrtg8 siRNA로 Pan1 세포를 형질감염시킨 후 1일, 4일 7일 및 11일째의 가스트린 유전자 발현(2^-ΔΔCt).

도 8: 40nM (비희석) 또는 4nM (1:10 희석)의 상업적으로 합성된 tg8 또는 scrtg8 siRNA로 HCT116 세포를 형질감염시킨 후 1일, 3일 6 및 9일째의 가스트린 유전자 발현(2^-ΔΔCt).

도 9: EGF의 존재하에서 가스트린 siRNA에 의한 가스트린 유전자 발현의 하향조절. 10㎍/ml EGF의 존재 또는 부재하에서 24 시간 동안 가스트린 (tg8) 또는 대조군 (scrtg8)로 형질감염시킨 후 2일째의 PAN-1 세포에서 유전자 발현. 데이터는 하우스키핑 유전자인 HPRT에 대해 상대적으로 표현된 것이다. 오차 막대는 95% 신뢰 구간을 나타낸다. 유의적 차이 (p<0.001)는 ^*로 표시된다.

도 10: 가스트린 siRNA에 의한 GFP-태그된 가스트린 단백질의 억제. HCT116 세포를, 대조군 scrtg8 siRNA (a) 또는 가스트린 tg8 siRNA (b)와 함께, GFP-태그된 가스트린을 발현하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 양성 세포의 %가 표시된다. 두 개의 처리 사이에는 유의적 차이 (p<0.0001)가 있었다.

도 11: 가스트린 siRNA에 의한 성장의 억제. 가스트린 (tg8) 또는 대조군 (scrtg8) siRNA로 형질감염시킨 후 10㎍/ml EGF를 첨가한 (a) 또는 첨가하지 않은 (b)의 무혈청 배지에서 PAN-l, C170HM2, HCT116 및 MGLVAl의 성장. tg8-형질감염된 세포의 성장은 scrtg8-처리된 세포의 %로서 제시된다. 유의적 차이( p<0.05)는 ^*로 표시된다.

도 12: 가스트린 siRNA-형질감염된 암세포에서의 아폽토시스. 10㎍/ml EGF의 존재 (a) 또는 부재 (b) 하에서 가스트린 (tg8) 또는 대조군 (scrtg8) siRNA로 처리한 후 4일째의 아폽토시스성 세포의 비율. 아폽토시스는 scrtg8-처리된 세포 에 대해 상대적으로 제시된다. 유의적 차이 (p<0.05)는 ^*로 표시된다.

도 13: 항-가스트린 (Tg8) siRNA를 사용한 OE19 자가분비 가스트린 경로의 간섭. A. 항-가스트린 siRNA로 처리한 후 OE19 세포에서 전체 PKB/Akt 및 포스포-PKB/Akt의 수준을 보여주는 웨스턴 블롯. 이중 형질검염을 각 처리 조건에 대해 수행하였다: 레인 1 & 2 = OE19 +500 ng/㎕ (1x) Tg8, 3 & 4 = OE19 + 50ng/㎕ (1/10x) Tg8, 5 & 6 = 500ng/㎕ (1x) SNC, 7 & 8 = OE19 50ng/㎕ (1/10x) SNC. B. 밀도측정(densitometry)를 통해 측정된 각종 처리 그룹에서 포스포-PKB/Akt 대 전체 PKB/Akt의 비를 보여주는 간략 그래프. (500ng/㎕ SNC에 비교된 500ng/㎕ Tg8, p=0.003).

도 14: 가스트린 siRNA (표적 8) 또는 대조군 siRNA (스크램블(scramble)된 표적 8)로 처리된 ST16, AGS 또는 MGLVA1 세포에서 HB-EGF 유전자 발현.

도 15: 대조군 siRNA 단독 (스크램블된 표적 8); 대조군 siRNA (스크램블된 표적) 및 에이취 피롤리(H. pylori) 균주 60190; 또는 가스트린 siRNA (표적 8) 및 에이취 피롤리 균주 60190로 처리된 ST16, AGS 또는 MGLVA1 세포에서 HB-EGF 유전자 발현.

도 16: 가스트린 siRNA (표적 8) 또는 대조군 siRNA (스크램블된 표적 8)의 존재 또는 부재하에서 에이취 피롤리 균주 60190에 반응한 HB-EGF 엑토도메인 쉐딩(ectodomain shedding).

도 17: 가스트린 siRNA (표적 8) 또는 대조군 siRNA (스크램블된 표적 8)로 처리된 AGS 세포에서 XIAP 유전자 발현.

도 18: 가스트린 siRNA (표적 8) 또는 대조군 siRNA (스크램블된 표적 8)로 처리한 다음에 에이취 피롤리 균주 60190에 24 시간 동안 노출한 AGS 세포에서 XIAP 유전자 발현.

도 19: 가스트린 siRNA (표적 8) 또는 대조군 siRNA (스크램블된 표적 8)의 존재 또는 부재하에서 에이취 피롤리 균주 60190으로 처리한 AGS 세포에서 XIAP 단백질 발현.

도 20: 40 내지 0.1nM의 농도의 상업적으로 합성된 Gas-27 또는 scrtg8 siRNA로 C170HM2 세포를 형질감염시킨 후 1일째의 가스트린 유전자 발현(2^-ΔΔCt).

도 21: 소형 헤어핀 RNA로서 가스트린 및 대조군 siRNA를 발현하는데 사용되는 벡터 (pSilencer 2.1-U6 hygro, Ambion). 삽입 구조 및 생성된 소형 헤어핀 RNA가 또한 제시된다.

본 발명은 약 90개 이하의 뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는 간섭 RNA (RNAi)를 제공하며, 이때 약 19 내지 21개 뉴클레오티드, 또는 19 내지 약 24개 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 27개 뉴클레오티드, 또는 약 19-29개 뉴클레오티드 부분은, 상기 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-24개 뉴클레오티드, 또는 약 19-27개 뉴클레오티드, 또는 약 19-29개 뉴클레오티드가 가스트린 mRNA에 결합되도록 가스트린 유전자의 센스-쇄 내의 서열에 충분히 상보적이다. 이러한 약 19 내지 21개 뉴클레오티드, 또는 19 내지 약 24개 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 27개 뉴클레오티드, 또는 약 19-29개 뉴클레오티드 부분은, RNAi 분자가 가스트린 mRNA에 결합하도록 지시하는 가스트린 유전자 표적화 서열이다. 상기 가스트린 유전자 표적화 서열은 가스트린 유전자로부터 전사된 서열 내의 약 19 내지 21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-24개 뉴클레오티드, 또는 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드의 모든 서열에 상보적일 수 있다. 바람직하게는, 가스트린 유전자 표적화 서열은 약 20 내지 21개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 보다 바람직하게는, 가스트린 유전자 표적화 서열은 21 또는 22개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 보다 바람직하게는, 가스트린 유전자 표적화 서열은 29개 이하의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

본 발명의 가스트린 유전자-특이적 간섭 RNA 표적화 서열은 바람직하게는, 임의의 다른 유전자, 특히 임의의 다른 사람 유전자와 약 80% 이하의 상보성을 갖는다. 즉, 염기대 염기를 정렬했을 때, 예를 들어 20개 뉴클레오티드 길이의 가스트린 표적화 서열의 경우에, 약 16개 이하의 뉴클레오티드가 임의의 다른 유전자, 특히 임의의 다른 사람 유전자에 상보적이다. 보다 바람직하게는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 RNA 표적화 서열의 뉴클레오티드의 70% 이하가 임의의 다른 유전자, 특히 임의의 다른 사람 유전자에 상보적이다.

표적화 서열은 바람직하게는 약 30 내지 약 60%의 GC 함량을 가지며, 약 4개 이하의 연속 아데노신 염기를 가진다.

본 발명의 가스트린-특이적 간섭 RNA (RNAi) 분자는 3'-5' 포스포디에스테르-연결된 펜토스 당-포스페이트 골격을 가지며, 바람직하게는 각각의 당이 1-위치에서 뉴클레오티드 염기로 치환된 리보뉴클레오티드의 쇄를 포함한다. 리보뉴클레오티드 쇄는, 생체내 뉴클리아제 절단 및 분해를 방지하기 위하여, 예를 들어 황 원자, 질소 원자 또는 탄소 원자를 함유하는 연결체와 같은 포스페이트 디에스테르 연결체가 아닌 하나 이상의 연결체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 염기는 아데닌, 구아닌, 시티딘 또는 우라실이다. 당은 임의의 펜토스 당일 수 있으나, 바람직하게는 D-리보스이다. 본 발명의 RNAi 분자의 리보뉴클레오티드 쇄는 하나 이상의 변형된 염기, 바람직하게는 변형된 퓨린 염기 또는 변형된 피리미딘 염기를 포함할 수 있다. 변형된 퓨린 염기는 임의의 변형된 퓨린 염기, 예를 들면 히포크산틴 (리보뉴클레오티드 쇄 중의 이노신), 또는 변형된 퓨린 염기, 예를 들면 메틸화된 아데닌, 치환된 염기 등일 수 있다. 변형된 피리미딘 염기는 임의의 피리미딘 염기, 예를 들면 변형된 시티딘 또는 우라실, 예를 들어 5-메틸 시토신 등일 수 있다.

일 태양에서, 본 발명의 RNAi 분자는, 가스트린 유전자의 센스-쇄 내의 서열에 완전히 상보적인 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드 이하의 가스트린 유전자 표적화 서열을 포함한다. 가스트린 mRNA에 결합된 경우에, 가스트린-특이적 RNAi의 상기 태양의 가스트린 유전자 표적화 서열의 리보뉴클레오티드 염기들은 모두 각각 가스트린 mRNA 내의 상보적인 염기와 GC 또는 CG 쌍으로 쌍을 형성하거나 또는 AU 또는 UA 염기 쌍을 형성한다.

본 발명의 RNAi 분자의 또 다른 태양에서, 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 약 19-24개 뉴클레오티드, 또는 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드의 가스트린 유전자 표적화 서열 내의 하나 이상의 불일치(mismatch)는, 가스트린 유전자의 센스-쇄에 완전히 상보적인 가스트린 유전자 표적화 서열 내의 서열이 가스트린 mRNA와 안정한 이본쇄 RNA를 형성하기에 충분한 경우에는 허용될 수 있다. 안정한 이본쇄 형성에 요구되는 이러한 상보성의 제한 (즉, 융점 프로파일)에 관한 판단은 통상적이며 당업계의 통상의 기술에 당연히 속한다 [참조: Sambrook & Russell (2000) Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3d edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Chapter 10: Working with Synthetic Oligonucleotide Probes]. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 RNAi의 가스트린 유전자 표적화 서열은 1, 2, 3 또는 4개의 불일치 염기를 포함할 수 있으며, 나머지 약 18 내지 약 21개, 약 17 내지 약 24개, 또는 약 15 내지 약 27개 뉴클레오티드, 또는 약 16 내지 약 29개 뉴클레오티드는 센스-쇄 서열과 완전히 일치한다.

본 발명의 RNAi 분자는 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 19-24개 뉴클레오티드, 또는 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드의 가스트린 유전자 표적화 서열 중 가스트린 유전자 내의 표적화 서열과 불일치하는 4개 이하의 염기를 포함할 수 있다. 본 발명의 RNAi의 가스트린 유전자-특이적 표적화 서열과 가스트린 유전자 사이의, 하이브리드화를 그래도 허용할 수 있는 불일치의 최대 허용가능한 수는 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 결정될 수 있다 [참조: Urakawa et al. (2003) Optimization of Single-Base-Pair Mismatch Discrimination in Oligonucleotide Microarrays. J. Appl . Envir . Microbiol . 69(5): 2848-2856].

일 태양에서, 본 발명의 가스트린 유전자-특이적 RNAi 분자의 약 90개 이하의 뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드 쇄는 약 19 내지 약 21개 뉴클레오티드, 또는 19-24개 뉴클레오티드, 또는 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드의 가스트린 유전자 표적화 서열에 결합하기에 충분한 상보성을 갖는 약 19 내지 약 21개 뉴클레오티드, 또는 약 19 내지 약 24개 뉴클레오티드, 또는 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드의 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 상보성은 약 19 내지 약 21개 뉴클레오티드, 또는 19-24개 뉴클레오티드, 또는 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드의 가스트린 유전자 표적화 서열의 모든 염기가 제2 뉴클레오티드 서열과 GC 또는 AU 염기쌍을 형성하도록 완전한 서열 상보성이다. 달리, 제2 뉴클레오티드 서열은, 이본쇄의 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 분자 중에서 가스트린 유전자 표적화 서열 내의 반대편 염기와 불일치된 1, 2, 3 또는 그 이상의 염기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제2 뉴클레오티드 서열은 가스트린 유전자 표적화 서열 내에 약 9개 이하의 불일치된 염기를 포함한다. 보다 바람직하게는, 약 6개 이하의 불일치된 염기, 가장 바람직하게는 약 3개 이하의 불일치된 염기가 가스트린 유전자 표적화 서열 내에 포함된다.

본 발명의 가스트린-특이적 간섭 RNA (siRNA 또는 miRNA)의 이본쇄 태양의 각각의 쇄는 시험관내에서 화학적으로 합성되거나, 또는 재조합 클론으로부터 발현되고, 어닐링되어 이본쇄 RNAi 분자를 형성할 수 있다. 달리, 본 발명의 가스트린-특이적 간섭 RNA는 루프 서열에 의해 연결된 상보적 서열을 가진 일본쇄로서 합성되거나 발현될 수 있다. 이어서, 상보적 서열은 적당한 조건하에서 접히고 어닐링되어, 이본쇄 "헤어핀 siRNA 분자"로서 알려진 단일 분자 siRNA 종을 형성할 수 있다. 소형 간섭 RNA의 두 개의 상보적 쇄는 올리고뉴클레오티드 링커에 의해, 또는 비-뉴클레오티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 적당한 비-뉴클레오티드 링커, 예를 들어 짧은 무기 중합체 링커, 펩티드 링커, 예컨대 폴리글리신 또는 폴리리신 등이 당업계에 익히 공지되어 있고, 화학적 및/또는 효소적 방법에 의한 시험관내 RNAi 합성에 쉽게 적용될 수 있다.

특정 태양에서, 본 발명의 가스트린-특이적 간섭 RNA는 이본쇄 RNAi 분자를 형성하는 2개의 별개의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함한다. 하나의 리보뉴클레오티드 쇄는 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 19-24개 뉴클레오티드, 또는 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드 길이의 가스트린 안티센스 표적화 서열을 포함하고, 제2 리보뉴클레오티드 쇄는 가스트린 안티센스 표적화 서열에 대해 상보적이거나 또는 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 가진다. siRNA 태양에서, 리보뉴클레오티드 쇄는 가스트린 안티센스 표적화 서열을 포함하고, 제2 리보뉴클레오티드 쇄는 약 19-21개 뉴클레오티드, 또는 19-24개 뉴클레오티드, 또는 19-27개 뉴클레오티드, 또는 19-29개 뉴클레오티드의 가스트린 유전자-특이적 표적화 서열의 전체 길이에 걸쳐 완전히 상보적이다. 또한, 이본쇄 RNAi 분자는 4개의 리보뉴클레오티드 쇄 말단 중의 하나 이상에서 쌍을 형성하지 않고 "돌출된" 리보뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 리보뉴클레오티드 쇄의 임의의 특정 말단에 있는 돌출부(overhang)는 당해 분자 내의 리보뉴클레오티드의 총수가 모두 약 90을 넘지 않는 한, 임의의 길이일 수 있다.

바람직한 태양에서, 본 발명의 가스트린-특이적 이본쇄 RNAi 분자는 리보뉴클레오티드 쇄의 한 개 또는 둘 모두의 3' 말단에 리보뉴클레오티드의 돌출부 서열을 포함하거나, 또는 평활 말단(blunt-end) 서열을 포함한다. 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 가스트린-특이적 이본쇄 RNAi 분자는 리보뉴클레오티드 쇄의 한 개 또는 둘 모두의 3' 말단에 1, 2 또는 3개의 리보뉴클레오티드 돌출부를 포함한다. 특히 바람직한 태양에서, 본 발명의 가스트린-특이적 이본쇄 RNAi 분자는 리보뉴클레오티드 쇄의 둘 모두의 3' 말단에 2개 염기의 돌출부를 포함하고, 당해 쇄의 5'말단에는 돌출부를 포함하지 않는다. 두 개의 쇄의 4개의 말단 모두에 쌍을 형성하지 않은 리보뉴클레오티드 돌출부를 포함하는 본 발명의 이본쇄 RNAi 분자의 태양도 또한 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다. 이러한 쌍을 형성하지 않는 리보뉴클레오티드 돌출부는 RNAi 분자의 "둘쭉날쭉한(ragged) 말단"을 형성하며, 이는 생체내에서 리보뉴클리아제에 의해 절단되어 활성형 RNAi 종을 형성할 수 있다. 본 발명의 가스트린-특이적 RNAi는 유도성 재조합 유전자로부터 일본쇄 리보뉴클레오티드 구조로서 또는 헤어핀 리보뉴클레오티드 구조로서 발현될 수 있다. 상기 재조합 유전자는 DNA 플라스미드와 같은 DNA 벡터 또는 DNA 바이러스 벡터로부터 발현되거나, 또는 재조합 유전자는 레트로바이러스 벡터와 같은 RNA 바이러스 벡터 등으로부터 발현될 수 있다. 이어서, 표적 유전자 발현의 녹-다운이 재조합 RNAi 유전자의 발현을 유도하는 1 단계에 의해 달성될 수 있다. 이러한 표적화된 녹-다운은 RNAi의 발현을 억제하여 가스트린 유전자가 정상적으로 발현되도록 함으로써 반전될 수 있다.

유전자 발현의 RNA 간섭은 단백질 합성 단계에서 표적 유전자의 단백질 또는 펩티드 산물의 발현의 감소로서 나타난다. RNAi 분자에 의한 표적 유전자의 유전자 발현의 이러한 하향-조절은 엄격한 서열 특이성을 나타내므로, 안티센스 RNA 분자에 의해 매개되는 "하향-조절" 및 표적 유전자의 결실 후 보이는 "녹-아웃(knock-out)"과는 달리, 표적 유전자 발현의 "녹-다운"으로 불린다. 가스트린 유전자 발현의 녹-다운은 가스트린 유전자 산물 발현의 부분적 억제이거나, 또는 가스트린 유전자 산물 발현의 완전한 제거 (이는 가스트린 유전자의 "침묵(silencing)"이라고도 함)일 수 있다.

가스트린-특이적 유전자 산물은 모든 가스트린-특이적 펩티드 해독 생성물, 예를 들어 가스트린 mRNA 전사체 및 가스트린 mRNA 해독의 펩티드 생성물을 포함한다. 가스트린 mRNA 해독의 펩티드 생성물은 예를 들어, 프리프로가스트린(preprogastrin) (펩티드의 막관통(transmembrane) 수송을 위한 리더(leader) 서열을 포함하는 1차 해독 생성물); 프로가스트린(progastrin) (리더 서열의 절단에 의해 프리프로가스트린으로부터 형성되어, 특이적 단백질분해적 절단에 의해 하나 이상의 가스트린 호르몬 형태로 성숙되어지는 가스트린 전구체 프로-펩티드); 가스트린 호르몬 형태(펩티드 쇄의 아미노산의 수에 따라 명명된 가스트린 17 및 가스트린 34); 및 가스트린 17 및 가스트린 34의 C-말단에 각각 글리신 잔기가 연장된 글리신-연장된 가스트린 17 및 글리신-연장된 가스트린 34; 상기 가스트린 호르몬 형 각각의 황산 형과 같은 변형된 형태; 및 C-말단 플랭킹 펩티드를 포함한다. 이들 가스트린 호르몬 형은 상이한 생물학적 활성을 나타낸다. 예를 들어, G17-Gly 및 G34-Gly는, 이들 가스트린 호르몬 형의 글리신-연장된 C-말단 서열에 특이적으로 결합하는 수용체를 활성화시킴을 통한 가스트린-촉진된 신생물(neoplasm)의 성장 및 증식의 자극에 관여한다.

가스트린 유전자 발현의 완전한 녹-다운은, 가스트린 호르몬 합성을 완전히 차단시킬 수 있으며 후술되는 바와 같이 가스트린 mRNA의 표적화된 분해를 동반할 수 있는 능력 때문에 선택한 본 발명의 가스트린-특이적 간섭 RNA의 유효량을 투여함으로써 성취될 수 있다. 본 발명의 siRNA는 가스트린-촉진된 종양 성장 및 증식의 억제를 위한 치료제로서 유용하다. 가스트린 유전자 발현의 완전한 녹-다운은 가스트린-촉진된 종양, 및 자가분비 기전에 이해 자극된 기타 병리상태 (이 경우는, 병든 조직 자체가 가스트린을 생성하여, 그 자신의 성장 및 증식을 촉진한다)에 필요할 수 있다. 달리, 가스트린-특이적 RNAi에 의한 가스트린 유전자 발현의 완전한 녹-다운은 주변분비(paracrine) 기전으로 가스트린을 생성하는 상이한 조직에 표적화될 수 있다.

달리, 가스트린 mRNA의 부분적 녹-다운은, 가스트린 mRNA의 적정에 못 미치는 용량의 본 발명의 RNAi를 투여함으로 인해 가스트린 유전자 발현을 남기거나, 또는 가스트린 유전자 발현을 완전히 차단하기에 비효과적인 서열에 표적화되는 본 발명의 가스트린-특이적 간섭 RNA의 유효량을 투여함으로써 달성될 수 있다. 가스트린 유전자 발현의 부분적 녹-다운은 가스트린-촉진된 질환 및 병리상태, 예를 들어 가스트린의 과생산으로 인한 졸링거-엘리슨(Zollinger-Ellison) 증후군의 치료에 유익할 수 있다. 이러한 질환 및 병리상태에서 가스트린 생산 수준을 정상 수준으로 감소시키는 것은, 후술되는 바와 같이 본 발명의 방법에 따라 가스트린-특이적 간섭 RNA의 유효량을 투여하여, 가스트린 발현을 녹-다운시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 가스트린-특이적 RNAi 분자의 유효량은, 가스트린-촉진된 질환 또는 병리상태를 가진 환자에게 투여했을 때 가스트린 유전자 발현의 녹-다운을 일으키는 양이다. 가스트린 유전자 발현의 녹-다운은 해독 단계(즉, 가스트린 펩티드 생성물 합성의 차단 또는 감소)에서만 일어날 수 있다. 달리, 가스트린 유전자 발현의 녹-다운은 가스트린 mRNA 해독의 차단 또는 감소 뿐만아니라, 가스트린 mRNA의 표적화된 분해를 포함할 수 있다. 일 태양에서, 가스트린 유전자 발현의 녹-다운은, 모든 또는 거의 모든 가스트린 유전자 발현이 방지되는 완전한 녹-다운일 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명에 따른 가스트린-특이적 RNAi 분자를 투여함으로써 유발되는 가스트린 유전자 발현의 녹-다운은, 가스트린 유전자 발현이 감소되기는 하나, 완전히 방지되지는 않는 부분적 녹-다운일 수 있다. 예를 들면, 가스트린 유전자 발현의 부분적 녹-다운은 가스트린 유전자의 가스트린 펩티드 생성물 량의 약 25% 감소일 수 있다. 바람직하게는, 가스트린 유전자 발현의 부분적 녹-다운은 가스트린 유전자의 가스트린 펩티드 생성물 량의 약 50% 감소이다. 보다 바람직하게는, 가스트린 유전자 발현의 부분적 녹-다운은 가스트린 유전자의 가스트린 펩티드 생성물 량의 약 75% 감소이다. 더욱 보다 바람직하게는, 가스트린 유전자 발현의 부분적 녹-다운은 가스트린 유전자의 가스트린 펩티드 생성물 량의 약 약 85% 감소이다.

추가로, 가스트린 mRNA의 량은 본 발명의 가스트린-특이적 RNAi 분자를 투여함으로써 감소될 수 있다. 예를 들면, 가스트린 mRNA의 량은, 본 발명의 가스트린-특이적 간섭 RNA의 투여시, 약 25%, 바람직하게는 약 50%, 보다 바람직하게는 약 75%, 가장 바람직하게는 약 85% 감소될 수 있다. 최상으로, 본 발명의 가스트린-특이적 간섭 RNA의 투여가 가스트린 mRNA의 완전한 또는 거의 완전한 (즉, 약 90 내지 100%) 분해를 일으킨다.

상이한 가스트린 센스-쇄 서열에 표적화되는 가스트린-특이적 간섭 RNAi 분자들의 배합물을 가스트린-촉진된 질환 또는 병리상태를 가진 환자에게 투여하여, 각각의 RNAi 분자 단독에 의해 달성되는 가스트린 유전자 발현의 녹-다운을 증대시켜 치료 효능을 향상시킬 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명은, 화학요법과 병행하여, 가스트린-촉진된 위장관 종양의 치료를 위해 가스트린의 발현을 녹-다운시키기 위하여 화학요법제와 함께 가스트린-특이적 RNAi 분자를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 가스트린-특이적 RNAi와 함께 사용하기에 적합한 화학요법제는 임의의 화학요법제, 예를 들어 겜시타빈(gemcitabine), 캄토테신(camptothecin), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실 (5FU), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 빈블라스틴(vinblastine), 엑토시드(etoposide) (VP-16), 옥살롭라틴(oxaloplatin), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin) (CDDP), 키나제 억제제 (예: 에르로티니브(erlotinib), Iressa^R), 혈관형성 억제제 (예: 베박시주마브(Bevacizumab)), 및 EGF 수용체 억제제 (예: 세툭시마브(cetuximab))일 수 있다.

화학요법제는, 본 발명의 방법에 따라, 예를 들어 가스트린-특이적 RNAi 치료 기간 동안 계속적으로 또는 간헐적으로, 가스트린-특이적 RNAi 치료 단계의 모든 단계에서 투여될 수 있다.

본 발명의 가스트린-촉진된 종양의 치료 방법은, 가스트린-특이적 RNAi 분자를 종양 부위에 직접 투여하는 방법을 포함한다. 달리, 가스트린-특이적 RNAi 분자는 원거리 부위에 투여될 수 있다. 이러한 치료는 화학요법과 병행될 수 있다.

본 발명의 가스트린-특이적 RNAi로 치료할 수 있는 가스트린-촉진된 질환 또는 병리상태에는 모든 가스트린-촉진된 종양 (모든 GI 및 비-GI), 위-식도 역류 질환 (GERD), 전암 상태, 예를 들어 배렛(Barrett) 식도, 위축 위염, 위 궤양, 십이지장 궤양, 졸링거-엘리슨 증후군과 같은 고가스트린혈증, 악성 빈혈 및 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori) 감염이 포함된다. 본 발명의 가스트린-특이적 RNAi로 치료할 수 있는 가스트린-촉진된 종양에는 결장 선암, 전(全)-상피내 신생물, 식도 종양, 위 신생물, 장 종양, 췌장 종양, 소(小) 세포 폐암, 갑상선 수질 암종, 간 종양, 폐 종양, 난소 종양, 아교모세포종, 성상세포종, 뇌 기원의 종양, 예를 들면 아교모세포종 또는 성상세포종, 및 신경내분비 기원의 종양이 포함된다.

본 발명에 따른 가스트린-특이적 RNAi 분자는 바람직하게는 약제학적 조성물로서 환자에게 투여된다. 가스트린-특이적 RNAi 분자는 가스트린에 반응하는 조직의 부위에 국소적으로 또는 전신적으로, 일시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 환자는 가스트린-촉진된 질환 또는 병리상태를 가진 동물 또는 사람이다. 상기 질환은 가스트린 유전자가 성장 인자. 환경 자극 또는 전사 인자에 의해 상향조절된 모든 질환일 수 있다.

본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 약제학적 조성물은 가스트린-특이적 RNAi 분자 및 생리학적으로 적합한 담체 또는 부형제를 포함한다. 적합한 담체 또는 부형제는 모든 생리학적으로 적합한 완충제, 예를 들어 포스페이트 완충된 염수 (PBS)를 포함한다.

유용한 약제학적 조성물은 추가로 RNAi 분자에 공유결합된 펩티드를 함유할 수 있다. 예를 들면, 이들은 세포 내로의 섭취를 가능케 하는 TAT와 같은 펩티드일 수 있다 [참조: Cell. 1988 Dec 23; 55(6): 1189-93]. 이들 펩티드는 세포, 예를 들어 리포좀으로의 수송을 증가시키는데 사용된다 [참조: PNAS 2001 98: 8786-8781]. 예로서, 페네트라틴(penetratin) 및 트랜스포탄(transportan)이 또한 siRNA에 대해 시험되었다[참조: have also been tried for siRNAs (Muratovska 2004 FEBS Letters 558: 63-68]. 달리, 특정 세포 유형으로 표적화할 수 있는 펩티드, 예를 들어 siRNA를 가스트린 수용체-발현 세포로 유도하는 가스트린 펩티드가 사용될 수 있다. 상기 펩티드는 siRNA에 직접 연결되거나 또는 운반체 (중합체/리포좀 등)에 부착될 수 있다.

또 다른 태양에서, 본 발명의 방법을 수행하는데 유용한 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 가스트린-특이적 RNAi 분자를 발현하는 핵산 벡터 및 생리학적으로 적합한 담체 또는 부형제를 포함한다.

또 다른 태양에서, 본 발명의 약제학적 조성물은, 본 발명의 가스트린-특이적 RNAi 분자를 유도성 재조합 유전자로부터 일본쇄 리보뉴클레오티드 구조로서 또는 헤어핀 리보뉴클레오티드 구조로서 발현하는 재조합 벡터 및 생리학적으로 적합한 담체 또는 부형제를 포함한다.

참조 인용: 본원 명세서에서 인용된 특허 문헌 및 기타 문헌의 각각의 본문은 본원에 이의 전문이 참조로써 구체적으로 인용된다.

실시예 1. siRNA 합성

siRNA 합성을 위한 시험관내 시스템 (판매원: Ambion Ltd., Huntingdon, Cambridgeshire, UK)을 사용하였는데, 이러한 시스템에서는 siRNA의 2개의 쇄를 T7 폴리머라제를 사용하여 합성하고, 함께 어닐링하여 이본쇄 구조를 형성하고, 유리 섬유 필터 결합 및 용출에 의해 정제한다. 이본쇄 뉴클레오티드의 농도는 260nm에서의 흡광도를 측정하여 계산하였다.

일본쇄 합성 동안 플루오레스세인-12-우리딘-5'-트리포스페이트를 첨가함을 비롯하여 상기 방법을 변형시켜 형광성 siRNA를 합성하였다. 이는 형광 뉴클레오티드 대 비-형광 뉴클레오티드의 비의 최적화 및 전체 농도가 증가된 리보뉴클레오티드 트리포스페이트 (rNTP)의 사용을 요구하였다. rNTP의 농도가 높을수록, siRNA 합성의 효율이 높아지는데, 이는 비-형광성 siRNA의 합성에도 적용될 수 있다.

달리, siRNA가 상업적으로 합성되었다 [제조원: Dharmacon, Lafayette, CO, USA]. 표준 RNA 올리고뉴클레오티드 화학약품을 사용하여 두 개의 쇄를 별도로 합성하고, 2'-하이드록실 형태로 전환시키고, 어닐링하였다. 이중체(duplex)를 PAGE -정제하고, 당업계에 익히 공지된 표준 방법에 의해 탈염시켰다.

실시예 2: 세포주

아래의 세포주를 사용하였다:

a) Pan1: - 사람 췌장 선암종 세포주.

b) HCT116 - 불충분하게 분화된 사람 결장 선암종 세포주 (ECACC, ref. no. 91091005)

c) MGLVAl - 위 선암종 세포주, 위 세포주 MKN45G의 복수 변이체 (Watson et al., 1990. Int. J. Cancer, 45, 90-4).

d) OE19 - 식도 선암종 세포주.

e) C170HM2 - 간으로의 전이 능력을 가진 불충분하게 분화된 종양으로부터 최초로 유래된 사람 결장직장 선암종 세포주 (Watson et al., 1993, Eur. J. Cancer, 29A, 1740-5).

f) AGS - 사람 위 선암종 세포주 (ECACC, Wiltshire UK)

g) ST16 - 사람 위 선암종 세포주 (Academic Unit of Cancer Studies, University of Nottingham).

모든 세포주를 10% (v/v) 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS, Sigma, Poole, UK)을 함유하는 RPMI 1640 배양 배지 (Gibco, Paisley, UK) 내에서, 37℃ , 5% CO₂ 및 가습 상태하에서 통상적으로 배양하였다.

실시예 3: siRNA 형질감염

형질감염 시약은 암비온(Ambion) 제품 (판매원: Ambion Ltd., Huntingdon, Cambridgeshire, UK)이었다. Pan1 세포를 사용한 실험에서, siPort 아민 (Ambion Ltd.)은 우수한 형질감염 효율 및 비교적 낮은 세포 독성을 제공하였지만, siPort 지질 (Ambion Ltd.)은 명백히 세포에 극히 독성이었다.

형광성 siRNA를 사용하여 형질감염의 효율을 확인하였다. 형질감염한지 24 시간 후 형광 현미경을 통해 관찰했을 때 거의 100%의 세포가 형광성이었다. 형광표지된 siRNA인 tg5로 형질감염된 세포 내의 형광성 분포를 공초점 현미경을 사용하여 검사하였다. 형광성은 세포질 내의 소낭 형 구조와 관련이 있었다.

실시예 4: 가스트린 유전자 발현

세포주의 일련의 가스트린 siRNA 형질감염을 실행하였다. 수차례의 이들 실험 동안, 가스트린 유전자 발현을 실시간 PCR로 측정하였다. 가스트린 siRNA로 처리한 세포 내에서 가스트린 유전자 발현을, "2^-ΔΔCt" 방법 및 "2^-ΔCt" 방법을 각각 사용하여, 스크램블된 tg8 siRNA (scrtg8) 및 하우스키핑 유전자인, 히포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT)로 처리된 세포와 비교하거나 또는 상기 하 우스키핑 유전자 단독과 비교하여 계산하였다.

소위 "2^-ΔΔCt" 방법은 샘플 중의 표적의 양을 계산하고 표준화시키는데 일반적 사용되었다 [참조: Perkin Elmer Applied BioSystems User Bulletin #2 ABI Prism 770 Sequence Detection System: Relative Quantitation of Gene Expression. Issue of December 1, 1997]. 상기 문헌은, 임의의 수많은 하우스키핑 유전자, 예를 들어 베타-액틴, 글리서알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (GAPDH), 리보좀 RNA (rRNA), 또는 기타 RNA의 발현 수준을 내인성 기준 대조군으로서 사용하여, siRNA에 의한 형질감염 후 유전자 발현을 모니터하고 표준화하는 방법을 기재한다.

상기 용어 Ct는, 상대적 카피 수가 증폭의 검출가능한 지수 단계로 급등하는 것으로 보이는 "역치 사이클"이다.

2^-ΔΔCt 방법에 따르면, 내인성 기준에 대해 정규화되고 교정기 (cb)에 상대적인 샘플 (q)에 대한 표적의 양은 2^-ΔΔCt로 정해지며, 이때, ΔΔCt = ΔC_t,q - ΔCt_t,cb 이고, ΔC_t,q는 표적 T와 q에 대한 역치 사이클에서의 차이이며; ΔC_t,cb는 표적과 교정기, cb에 대한 역치 사이클에서의 차이이다.

상기 후자의 방법은, 정확한 세포 수 및 RNA 및 cDNA 합성의 효율과 같은 인자에 대해 참조 대조군 샘플과 시험 샘플 사이의 차이(ΔC_t,q)를 상쇄한다. 상기 방법은 또한 대조군-처리된 샘플에 대한 시험 샘플에서의 유전자 발현의 측정치(Δ C_t,cb)를 제공한다.

"2^-ΔCt" 방법에서, ΔCt = C_t,X - Ct_t _,cb (즉, 표적 및 하우스키핑 유전자에 대한 역치 사이클에서의 차이)이다. 이 방법은, 예를 들면 상이한 세포주 사이의 절대 발현량의 차이를 설명하는데 사용된다.

실시예 5: 형질감염 시약의 적정

상이한 양의 siPort 아민 (Ambion, UK) 형질감염 시약을 사용하여 Pan1 세포를 형질감염시켰으며, 도면에서는 형질감염 1회당 1 ㎕, 2 ㎕ 및 4 ㎕의 siRNA 시약에 해당하는 A1, A2 및 A3로서 지칭된다. 2^-ΔΔCt 방법을 사용하여 PCR에 의해 모니터된 가스트린 유전자 발현은 도 1에 도시되어있다.

시판 siRNA 및 HCT 116 세포를 사용하여 실험을 반복하였다. 결과는 도 2에 제시되어있다. 따라서, 가스트린 유전자 발현의 최고 녹-다운은 일반적으로, 형질감염된 siRNA (siPort 아민에 의함)의 최대량, 즉 이들 실험에서 형질감염 1회당 4㎕를 사용하였을 때 관찰되었다.

실시예 6: 가스트린 유전자 내의 표적의 선택

가스트린 내의 6개의 상이한 표적, 및 2개의 가스트린 siRNA의 스크램블된 (scr) 형을 표적화하는 2개의 대조군 siRNA를 포함하는 8종의 siRNA를 시험하였다. 상기 표적들은 아래의 특성에 따라 선택하였다:

a) 유전자 서열 내에 디뉴클레오티드 AA가 선행함;

b) 유전자의 맨 끝의 5' 또는 3' 말단의 회피;

c) 낮은 GC 함량 (약 30-60%)

d) 장쇄의 A의 부재; 및

e) 다른 유전자와의 상당한 상동성의 부재.

각 siRNA의 유전자 내의 서열, GC 함량 및 위치는 아래의 표 1에 제시된다. BLAST 분석에 의해 측정한 바에 따르면, 어떠한 서열도 임의의 다른 공지된 서열과 상당한 상동성을 보이지 않았다.

표적 7은 유전자의 3' 말단 내의 표적의 GC 함량이 최저이었으며, 표적 5는 표적 7과 비교하여 유전자의 독립적 영역을 표적화했으나, 유전자의 맨 끝의 5' 말단을 회피했기 때문에, 표적 tg5 및 tg7이 최고의 잠재적 표적으로서 최초로 검토되었다. 유전자 발현의 약 85% 녹-다운이 tg5를 사용했을 때 달성되었으나, tg7은 보다 다양하고 일반적으로 더 낮은 녹-다운을 제공했다. 이어서, 나머지 표적들을 가스트린 유전자 발현의 녹-다운에 대해 평가하였다. 표적 tg1은 유전자의 5' 말단 쪽에 위치하며, 이는 일반적으로 다른 siRNA 유전자 침묵 시스템에서는 덜 성공적인 것으로 밝혀졌다. 표적 8, 9 및 10은 각 표적 서열 간에 단지 3개씩 뉴클레오티드가 이동되며 tg7과 바로 인접해 있다.

가스트린 siRNA tg1, tg5, tg7, tg8, tg9 및 tgl0, 및 scrtg5 대조군 siRNA를 상기한 시험관내 방법을 사용하여 합성하고, Pan-l 세포 상에서, 일정 범위의 농도 (각각 약 20nM, 6nM 및 2nM의 최종 농도에 상응하는 비희석물, 1:3 및 1:10 희석물)로 시험하였다. 형질감염을 siPort 아민 (Ambion)을 사용하여 수행하였다. RNA를 RNABee (Ambion)를 사용하여 추출하고, Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, California) 및 프라이머인 무작위 6량체를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 가스트린 및 히포크산틴-구아닌 포스포트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자 발현을 실시간 PCR로 각 세트의 세포에서 측정하였다. 세포의 하우스키핑 유전자 기능의 HPRT가, 가스트린 유전자에 표적화된 RNA 간섭에 의해 특이적으로 영향받아서는 안되는 대조군 유전자로서 선택되었다. 결과는 도 3에 제시되었으며, 이는 2^-ΔΔCt 방법을 사용하여, 스크램블된 siRNA 대조군과 비교하여 표시된 것이고, 오차 막대는 평균에 대한 95% 신뢰 구간을 나타낸다.

가장 효과적인 표적은 가스트린 유전자 발현의 95% 녹-다운을 제공하는 tg8 및 tg9이었다. siRNA인 tg1은 가스트린 유전자 발현의 최소 녹-다운을 제공하였다. 스크램블된 tg5 siRNA에 의한 녹-다운은 보다 낮았다 (약 30%). 각각의 siRNA의 경우에, 녹-다운 효과는 형질감염된 siRNA의 농도가 감소함에 따라 감소하였다.

상기 형질감염을 2회 반복하여, 형질감염 후 1일 및 4일째에 세포를 수거하였다. 결과는 도 4에 제시되어있다. 상이한 siRNA의 효과에 대한 순위는, 이전 실험 (상기 참조)에서 관찰된 것과 이번 실험에서 1일째에 동일하였다. 가스트린 유전자 발현은 녹-다운되었고, siRNA tg8 및 tg9을 사용하였을 때는 시간이 지나도 낮게 유지되었으나, 가스트린 유전자 발현의 실질적 회복이 siRNA인 tg7 및 tgl0을 사용하였을 때 관찰되었다. 이들 데이터는 tg8가 가장 효과적인 항-가스트린 siRNA이고, tg9가 그 다음으로 가장 효과적이라는 것을 확인한다.

상이한 표적의 활성에 있어서의 차이에 대한 이유를 연구하기 위하여, 가스트린 mRNA의 RNA 구조를 인터넷 사이트 (http://www.genebee.msu.su/services /rna2_reduced.html)에서 이용가능한 RNA2 소프트웨어를 사용하여 예측하였다.

siRNA인, tg7, tg8, tg9 및 tgl0은 가스트린 mRNA 내의 동일한 루프 구조를 표적화하는 것으로 보인다. 그러나, tg5 표적은, tg7, tg8, tg9 및 tgl0에 의해 표적화되는 것과는 전구체 RNA에서 상이한 구조를 표적화한다. 그럼에도 불구하고, tg7, tg8, tg9 또는 tgl0의 안티센스 쇄의 하이브리드화는 당해 RNA 내의 유사한 구조의 개방을 일으켜서, 유전자 침묵의 매개에 관여하는 복합체로서 믿어지는 RISC에 의한 표적화를 가능케 한다.

실시예 7: 일군의 세포주에 대한 가스트린 siRNA 의 효과

이 시점까지 기재된 모든 실험은 췌장 종양 세포주인 Pan-1 세포에 대하여 수행되었다. 4종의 추가 세포주에 대한 시판 siRNA를 시험하기 위하여 실험이 준비되었다: HCT116 (결장), MGLVAl (위), OE19 (식도) 및 C170HM2 (결장의 간 전이). 상기한 바와 같이 가스트린 mRNA를 모니터한 PCR 데이터는 아래에 제시되어있다. 도 5a에서, 데이터는, 대조군 siRNA로 인한 효과 및 대조군 HPRT 유전자에 대한 효과를 고려하여 2^-ΔΔCt 계산법을 사용하여 제시한 것이며; 도 5b에서 절대 가스트린 수준은 2^-ΔCt 방법을 사용하여 제시한 것이다.

Pan1 세포를 사용하였을 때와 마찬가지로, HCTl16, MGLVAl 및 C170HM2 세포주에서, 가스트린 유전자 발현의 약 95% 녹-다운이 성취되었다. OE19 세포를 사용하였을 때 60% 녹-다운이 성취되었다. 도 5b는 OE19 세포에 의해 발현된 가스트린 mRNA의 절대량이 Pan-l, HCT116 및 MGLVAl 세포의 것에 비해 훨씬 더 높다 (약 150배 이상)는 것을 보여준다. 더 높은 농도의 siRNA를 사용하면, 식도 세포주에서 더욱 완전한 가스트린 녹-다운을 성취하는 것이 가능할 수 있다. 그러나, 이전의 데이터는, OE19 세포가 식도 종양에 대한 상위 범위 이상의 가스트린 수준을 갖는다는 것을 보여준다. 따라서, siRNA는 고 수준의 가스트린 mRNA를 발현하는 세포에서도 가스트린 발현을 효과적으로 녹-다운할 수 있다.

실시예 8: siRNA 의 적정

siRNA의 효과 범위를 시험하기 위하여, 시판 tg8 siRNA (및 스크램블된 대조군)를 일정 범위의 농도에서 HCT116 세포에 대하여 시험하였다. 데이터는 도 6에 제시되어있다. 최대 녹-다운은 HT116에 대해 최고 농도의 siRNA (~40nM)를 사용하였을 때 달성되었으며, 용량-의존적 반응이 관찰되었다. 상기되고 도 3에 제시된 실험에서, 전(全) 범위의 시험관내 합성된 siRNA를 또한 일정 범위의 농도에서 Pan-1 세포에 대하여 시험하였다.

실시예 9: 유전자 발현의 시간 경과

Pan1 세포를 40nM (비희석) 또는 4nM (1:10) siRNA로 형질감염시켰다. 유전자 발현을 1, 4, 7 및 11일째에 모니터하였다. 데이터는 도 7에 제시되어있다. HCT116 세포를 사용하여 실험을 반복하고, 유전자 발현을 1, 3, 6 및 9일째에 측정하였다. 이들 데이터는 도 8에 제시되어있다.

상기 데이터는, siRNA의 효과가 형질감염 후 적어도 9일까지 연장되는 것을 보여준다. Pan-l 세포에서, 사용된 siRNA의 농도가 최고일 때, 형질감염 7일 후 가스트린 유전자의 90%가 여전히 녹-다운되었으며, 11일째에 80% 녹-다운되었다. (4일째에 외관상 상승한 수준은 알려지지 않은 이유로 인해 덜 효과적인 녹-다운을 보이는 형질감염 복제물 중의 하나로 인한 인공물이다). 더 낮은 농도의 siRNA에서, 발현의 85% 녹-다운이 최대 7일까지는 유지되었으나, 11일까지 53%로 저하되었다. 가스트린 유전자 발현의 녹-다운은 Pan-1 세포에서 보다는 HCT116 세포에서 더 빠르게 약해지는 것으로 보인다. 이는 HCT116 세포가 Pan-1 세포보다 더 빠르게 성장하거나, 또는 HCT116 세포가 Pan-1 세포 보다 가스트린 발현 수준이 더 높기 때문일 수 있다. HCT116 세포를 사용했을 때에도, 형질감염 후 9일까지는 여전히 가스트린 유전자 발현이 상당히 녹-다운되었다.

실시예 10: EGF -유도된 유전자 발현의 하향조절

EGF가 전사 단계에서 가스트린 유전자 발현을 상향조절하고 GI 암 세포의 성장에 관여하기 때문에, 본 발명자들은 EGF-매개된 가스트린 발현을 억제하는 가스트린 siRNA의 능력을 연구하였다. 도 9는 10㎍/ml EGF의 존재 또는 부재하에 siRNA-형질감염된 PAN-1 세포에서 실시간 PCR로 측정된 가스트린 유전자 발현을 보여준다. 가스트린 siRNA는 EGF에 의한 가스트린 유전자 발현의 유도를 억제하였다.

실시예 11: 가스트린 펩티드 발현

Pan-l 세포를, 40nM tg8 또는 scrtg8 siRNA로 형질감염 후 3일째에 티립신/EDTA를 사용하여 수거하였다. 형질감염은 각 siRNA에 대해 2회씩 수행하였다. 세척 후, 당해 세포를 4% 포르말린을 사용하여 고정시키고, 4℃에서 보관하였다. 당해 세포를 사용하여 사이토스핀(cytospin)을 만들고, Triton X100을 사용하여 삼투될 수 있도록 하고, 프로가스트린의 아미노산 6-14에 대해 발생된 폴리클로날 래빗 항체를 사용하여 염색하였다. 1차 항체의 결합을 형광성 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 염색은 형광 현미경을 사용하여 검출하였다.

가스트린 펩티드 발현의 감소 수준은 scrtg8-처리된 세포에 비해 tg8-처리된 세포에서 관찰되었다. 그러나, 무관한 대조군 항체를 사용한 염색에 비해서는, scrtg8 세포의 염색이 어느 정도 남아있었으므로, 이는 가스트린 펩티드 녹-다운이 가스트린 mRNA 녹-다운에 비해 떨어진다는 것을 암시한다. 이는 siRNA의 생물학적 효과와 일치한다 (실시예 13 및 14).

실시예 12: 가스트린 siRNA 에 의한 GFP - 태그된 가스트린 단백질 발현의 억제

또한, 가스트린 단백질 발현에 미치는 siRNA 형질감염의 효과를 GFP-태그된 가스트린 유전자로 형질감염된 HCT116 세포를 사용하여 분석하였다. 완전한 가스트린 암호 서열을 PCR로 증폭시키고, BamH1 및 XhoI 제한 부위를 사용하여 CMV 프로모터의 제어하의 플라스미드 pHRGFP-C (Stratagene) 내에 GFP 암호화 서열의 상류를 클로닝하였다. 완전한 Kozak 서열을, 프라이머 서열에 밑줄을 그어 표시한 바와 같이 가스트린 암호 서열의 4번째 뉴클레오티드가 C로부터 G로 변형된 정방향 프라이머 내로 도입하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:

정방향: CGCGGATCCGCCGCCGCCATGGAGCGACTGTGTGTG (서열번호 10)

역방향: CCGCCGCTCGAGGCCGAAGTCCATCCATC (서열번호 11)

변형되지 않은 pHRGFP-C 플라스미드를 대조군 벡터로서 사용하였다. 이는 Kozak 서열이 결여되었기 때문에, GFP 발현이 기대되지 않았다.

플라스미드 및 siRNA의 이중 형질감염을, 상기한 바와 같이, 그러나 양을 반으로 하여 siRNA 형질감염 혼합물을 제조하고, 25㎕ 무혈청 배지에서 1㎕ 리포펙타민(Lipofectamine) (InVitrogen)과 함께 500ng의 플라스미드를 예비항온배양함으로써 수행하였다. 이어서, 2개의 형질감염 시약을 상기 세포를 첨가한 직후에 혼합하였다. 형질감염한지 24 시간 후, GFP 발현을 유동 세포측정(flow cytometry)으로 측정하였다.

각각의 공동-형질감염을 4회 반복하여 수행하였다. 각 처리의 1회의 결과는 도 11에 제시되어있다. pGasGFP 및 대조군 siRNA로 형질감염 후 형광 세포의 평균%는 19.8이었고, pGasGFP 및 가스트린 siRNA로 공동-형질감염된 세포의 4.8%만이 양성이었다. 따라서, 가스트린 siRNA로 처리한 후 GFP-태그된 가스트린-발현 세포의 비는 유의적으로 감소되었다 (p<0.0001).

실시예 13: 세포 성장에 대한 가스트린 siRNA 의 효과

가스트린 siRNA에 의한 형질감염이 EGF의 존재 또는 부재하의 세포 성장에 미치는 효과를 측정하기 위하여, MTT 검정을 siRNA로 형질감염된 세포 상에서 수행하였다. 이러한 검정은, 대사가 활발한 세포의 미토콘드리아 내에서 진하게 착색된 적색 염료 생성물에 대한 무색의 테트라졸륨 염 3,[4,5-디메틸티아조-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)의 감소를 토대로 한다. 초기 실험 동안에, 성장 효과는 형질감염 직후에는 확실하지 않았으며, 본 검정의 최적 시점으로서 5일이 선택되었다.

Pan1, HCT116, MGLVA1 또는 C170HM2 세포를 0.5㎍의 tg8 또는 scrtg8 siRNA로 형질감염시키고, 형질감염 후 5일째에 MTT로 4 시간 동안 처리하였다. 각 siRNA에 대하여 6회 반복하였으며, MTT의 감소를 광도측정으로 판정하였다. 각 세포주에 대해 최소한 3개의 별개의 경우에 대하여 성장을 측정하였으며, 실험들 간에는 약간의 차이가 있었으나, 4개의 세포주 모두에서, scrtg8-처리된 세포에 비해 tg8에서 성장이 감소되었다. EGF의 부재하에, 이들이 시험된 3 경우 (성장% 63.1, 75.0 및 68.5) 모두에서 유의성에 도달한 C170HM2 세포에서 효과가 가장 현저하였으며, 나머지 3개의 세포주에서 EGF의 부재하에, 유의성이 하나의 경우에만 도달하였다. 그러나, EGF로 처리된 세포에서, 성장에서의 유의성 차이가 독립적 실험에서 모두 관찰되었으며, 성장의 감소%가 더 컸다. 각 세포주에 대한 단일 실험에 대한 대표적 데이터가 도 11에 제시되어있다. 성장에서 유사한 감소가 두 개의 다른 가스트린 siRNA인 tg5 및 tg7로 처리한 Pan1 및 C170HM2 세포에서 관찰되었으며 (데이터는 제시되지 않음), 이는 상기 효과가 가스트린 유전자의 하향조절과 특이적으로 관련됨을 제시한다.

추가로, 성장의 억제를, 유사한 시간-체계하에 Pan1 세포에서 티미딘 혼입 검정을 사용하여 관찰하였다.

실시예 14: 가스트린 siRNA -형질감염된 세포에서 아폽토시스

가스트린이 성장 인자로서 작용할 뿐만 아니라, 항-아폽토시스성으로서 알려졌기 때문에, 4종의 세포주에서 아폽토시스에 대한 siRNA의 효과를 또한 연구하였다. 가스트린 siRNA-처리된 세포에서 아폽토시스의 정도를, 세포를 형광성 카스파제 3-특이적 억제제(BioCarta)로 처리한 검정을 사용하여 조사하였다. 카스파제 3은 아폽토시스의 연쇄증폭과정(cascade)의 개시에서 주요 매개인자이다. 상기 검정의 이면의 논리적 근거는, 카스파제가 활성화된 세포가 형광성 억제제의 결합에 의해 표시되나, 아폽토시스 경로를 계속 진행하는 것이 방해된다는 것이다. Pan1, HCT116, MGLVA1 또는 C170HM2 세포를 0.5㎍의 tg8 또는 scrtg8 siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염 후 4일째에, 이들을 EDTA를 사용하여 수거하고, 특정 농도에서 FAM-DEVD-FMK 시약을 사용하여 처리하였다. 1 시간 후, 이들을 세척하고, 0.4% 포르말린으로 고정시킨 다음에, 유동 세포측정으로 분석하였다. 양성 세포의 %를 처리되지 않은 세포와 비교하여 계산하였다. 데이터는 도 12에 제시되어있다. 대조군 siRNA에 비해 가스트린 siRNA로 처리한 세포에서 아폽토시스가 증가하였다. EGF의 부재하에, Pan1 및 C170HM2 세포에서 차이가 유의적이었다. 이러한 효과는 EGF의 존재하에서 증가되었으며, HCT116 세포에서 추가로 유의적 차이가 관찰되었다. MGLVA1 세포에서는 어떠한 조건하에서도 유의성이 달성되지 않았다.

실시예 15: 가스트린 siRNA 로 형질감염된 세포에서 감소된 PKB 인산화

PKB/Akt의 인산화에 대한 가스트린 siRNA의 효과를, 500ng/㎕ 및 50ng/㎕의 농도의 tg8 또는 ascrtg8 siRNA로 일시적으로 형질감염된 OE19 세포에서 평가하였다. 형질감염 (72 시간) 후, 세포를 웨스턴 블롯팅에 의해 PKB/Akt 및 인산화된 PKB 단백질 발현에 대해 평가하였다. 웨스턴 블롯의 밀도측정 분석을 통해 측정한 바에 따르면, 총 PKB/Akt에 비해 포스포-PKB/Akt의 양의 유의적인 감소가 고 농도의 tg8에서 관찰되었다 (p=0.003) (도 13a 및 b). 포스포-PKB가 GI 암 세포의 성장 및 항-아폽토시스 경로의 활성화인자이기 때문에 [참조 문헌: Lawlor and Alessi (2001) PKB/Akt: a key mediator of cell proliferation, survival and insulin responses? J. Cell Science 114: 2903-2910], 세포 내 포스포-Akt의 양의 감소가 가스트린 siRNA-처리된 세포에서 관찰된 성장의 감소 및 아폽토시스의 증가에 기여할 수 있다.

실시예 16: HB - EGF 발현에 대한 가스트린 siRNA 의 효과

에이취. 피롤리(H.pylori) 감염은, 현저한 고가스트린혈증 및 이러한 감염과 관련된 신생물의 진행에 기여할 수 있는 다른 사람 성장 인자, 예를 들면 HB-EGF의 상향조절을 초래한다 [참조: Parsonnet et al (1991) Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma N. Engl . J Med . 325: 1127 -1131]. HB-EGF 발현이 가스트린에 의해 상향조절되기 때문에, HB-EGF 발현에 대한 가스트린 siRNA의 효과를 3종의 위 암 세포주 MGLVA1, ST16 및 AGS에서 연구하였다. 가스트린 siRNA 또는 대조군 siRNA로 형질감염시킨 후, HB-EGF 발현을 실시간 PCR로 측정하였다. 결과는 도 14에 제시되어있다. HB-EGF 유전자 발현의 유의적 감소가 대조군 siRNA로 처리된 세포에 비해 가스트린 siRNA-처리된 세포에서 3종의 세포 모두에서 관찰되었다.

siRNA로 형질감염한지 24 시간 후, 세포를 24 시간 동안 cag⁺ vacA s1/m1 독소원 에이취. 피롤리(H.pylori) 균주 60190 (ATCC no. 49503)에 노출시켰다. 결과는 도 15에 제시되어있다. ST16 및 AGS 세포의 경우, 대조군 siRNA 처리된 세포에서 에이취 피롤리에 반응하여 HB-EGF 발현이 증가되었다. 3종의 세포 모두에서, 대조군 siRNA로 처리된 것에 비하여 가스트린 siRNA로 처리된, 에이취 피롤리-노출된 세포에서 HB-EGF 발현이 유의적으로 감소하였다. 이러한 효과는 또한 단백질 양에서 명백하였다 (도 16 참조). 세포를 에이취 피롤리 (60190)에 노출시키면, 가스트린 siRNA (표적 8)로 처리된 세포에서 억제된 HB-EGF 쉐딩(shedding)이 상향조절되었다.

실시예 17: XIAP 발현에 대한 가스트린 siRNA 의 효과

아폽토시스 단백질의 X-연결된 억제제 (XIAP)는 아폽토시스 단백질의 억제제 (IAP) 계열의 일원으로서, 카스파제-3, -6, -7 및 9의 강력한 억제제이다. XIAP 발현이 수많은 암에서 발생하고 포스포-Akt에 의해 상향조절되기 때문에, 위 암 세포주인 AGS에서 XIAP 발현에 대한 가스트린 siRNA의 효과를 연구하였다. 가스트린 (표적 8) 및 대조군 siRNA (스크램블된 tg8)로 형질감염시킨 후, XIAP 발현을 실시간 PCR로 측정하였다. 데이터는 도 17에 제시되어있다. 대조군 siRNA (스크램블된 표적 8)-처리된 세포에 비해, 가스트린 (표적 8) siRNA-처리된 세포에서 발현이 유의적으로 감소하였다 (p<0.004). siRNA로 형질감염시킨 후, AGS 세포를 24 시간 동안 에이취 피롤리 (60910)에 노출시키고, XIAP를 다시 실시간 PCR로 측정하였다 (도 18 참조). 대조군 siRNA (스크램블된 표적 8) 처리되고 60190에 노출된 세포에서 XIAP 발현이 증가되었고, 이는 가스트린 siRNA-처리되고 에이취 피롤리에 노출된 세포에서 유의적으로 감소되었다 (p<0.005). 가스트린 siRNA에 의한 에이취 피롤리-유도된 XIAP 발현은 또한 단백질 수준에서 관찰되었다 (도 19 참조).

실시예 18: 27- 량체 가스트린 siRNA

27-량체 가스트린 siRNA, tg8 가스트린 siRNA 및 대조군 siRNA (scrtg8)를 사용하여, 0.1nM 내지 40nM의 농도에서 C170HM2 세포를 형질감염시켰다. 유전자 발현을 실시간 PCR로 1일째에 모니터하였다. 데이터는 도 20에 제시되어있다. 27-량체의 가스트린 siRNA는 tg8 siRNA와 같이 가스트린 유전자 발현을 녹-다운시키는데 효과적이었다.

실시예 19: pSilencer 클로닝

tg5, tg7, tg8 및 scrtg8 헤어핀 RNA을 암호화하면서, pSilencer 2.1-U6 벡터 (Ambion Inc., Huntingdon, Cambridgeshire, UK)로의 삽입을 가능케 하는 BamH1 및 HindIII 제한 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 이들의 서열은 표 2에 제시된다.

표적 서열 및 스크램블된 표적 서열은 다음과 같이 서열번호로서 지정되었다: Tg5U는 서열번호 12이고; Tg5L은 서열번호 13이고; Tg7U는 서열번호 14이고; Tg7L은 서열번호 15이고; Tg8U는 서열번호 16이고; Tg8L은 서열번호 17이고; Scrtg8U는 서열번호 18이고, ScrtgL은 서열번호 19이다.

각각의 헤어핀 루프를, 암비온(Ambion) (Huntingdon, Cambridgeshire, UK)으로부터 구입한 벡터 pSilencer 2.1 U6 내에 클로닝하였다. EcoRI/HindIII 분해물을 사용하여 삽입체를 가시화하였다. 가스트린 siRNA 줄기-루프 구조는 재조합 pSilencer 2.1 U6 벡터 클론 (구입원: Ambion)으로부터 발현될 수 있다.

당업자는 상기 실시예에 의해 예시되었으나 이에 의해 전혀 제한되지 않는 본 발명에 포함되는 전체 범위를 바로 인식할 것이다.

Claims

가스트린 메신저 RNA (mRNA)에 결합하기에 충분히 가스트린 유전자 서열에 대해 상보적인 약 19 내지 약 29개 뉴클레오티드의 표적화 서열을 포함하는 약 90개 이하의 뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드 쇄를 포함하는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항에 있어서, 표적화 서열이 약 19 내지 약 27개인 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항에 있어서, 표적화 서열이 약 19 내지 약 24개인 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항에 있어서, 표적화 서열이 약 19 내지 약 21인 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 가스트린 유전자 발현을 억제하는 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 발현의 억제가 가스트린 유전 자의 해독의 억제를 포함하는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 발현의 억제가 가스트린 mRNA의 분해를 포함하는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 표적화 뉴클레오티드 서열에 결합하기에 충분한 상보성을 갖는 약 19 내지 약 29개 뉴클레오티드의 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 약 19 내지 약 27개인, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 약 19 내지 약 24개인, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 약 19 내지 약 21개인, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 변형된 뉴클레오티드를 포함 하는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 3'-5' 포스페이트 연결이 아닌 뉴클레오티드 사이의 연결을 포함하는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 뉴클레오티드 서열이 링커 분자를 통하여 당해 리보뉴클레오티드 쇄에 공유결합되는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 가스트린 암호화 서열에 상보적인 서열이 AAGCTTCTTGGAAGCCCCGCT (서열번호 1); AAGAAGCAGGGACCATGGCTG (서열번호 2); AAGAAGAAGAAGCCTATGGAT (서열번호 3); AAGAAGAAGCCTATGGATGGA (서열번호 4); AAGAAGCCTATGGATGGATGG (서열번호 5); AAGCCTATGGATGGATGGACT (서열번호 6); AAGAGATGTAAGGCCAGGCCG (서열번호 7); AAGCGAAGAAACGAGGTGTAT (서열번호 8); 및 AAGAAGAAGCCTATGGATGGATGGACT (서열번호 9)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열의 17개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 표 2에 기재된 서열 (서열번 호 12 내지 19)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자.
제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 따른 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자 및 이에 공유결합된 펩티드를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 따른 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 가스트린-촉진된 질환 또는 병리상태를 가진 환자를 치료하는 방법.
제19항에 있어서, 가스트린-매개된 질환 또는 병리상태가 가스트린-촉진된 종양, 위-식도 역류 질환 (GERD), 배렛(Barrett) 식도, 위축 위염, 위 궤양, 십이지장 궤양, 졸링거-엘리슨(Zollinger-Ellison) 증후군, 고가스트린혈증, 악성 빈혈, 배렛 식도와 같은 전암 상태 및 에이취 피롤리(Helicobacter pylori) 감염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제19항 또는 제20항에 있어서, 가스트린--촉진된 종양이 결장 선암, 전(全)- 상피내 신생물, 위 신생물, 장 종양, 췌장 종양, 갑상선 수질 암종, 간 종양, 폐 종양, 난소 종양, 뇌 기원의 종양 및 신경내분비 기원의 종양으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 종양인 방법.
세포를 제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자와 접촉시킴을 포함하여, 세포 내에서 가스트린 유전자 발현을 감소시키는 방법.
제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자를 발현하는 핵산 벡터.
제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자를 발현하는 핵산 벡터를 보유하는 숙주 세포.
제1항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따른 가스트린 유전자-특이적 간섭 리보핵산 (RNAi) 분자를 발현하는 핵산 벡터 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.