CN108486225A

CN108486225A - 一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂、试剂盒及其方法

Info

Publication number: CN108486225A
Application number: CN201810573817.6A
Authority: CN
Inventors: 方雪恩; 王丽娟; 孔继烈
Original assignee: SHANGHAI SUXIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI SUXIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Shanghai Quick Diagnosis Products Co Ltd
Priority date: 2018-06-06
Filing date: 2018-06-06
Publication date: 2018-09-04

Abstract

本发明提供一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂，其包括树脂材料、反应缓冲液、Mg²⁺水溶液；本发明还提供一种用于检测沙眼衣原体的试剂盒，其包括上述核酸提取试剂、SEQ ID NO：1～9所示序列的检测引物组、微流控芯片等；本发明还涉及一种用于检测沙眼衣原体的方法。本发明将沙眼衣原体的特异核酸序列与微流控芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的沙眼衣原体核酸提取及其检测；本发明提供的沙眼衣原体引物组与其他病原微生物无交叉反应，且该引物组的最低检测限为10拷贝/μl。对于临床而言，能够在1h内获得检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。

Description

一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂、试剂盒及其方法

技术领域

本发明涉及病原体检测和诊断技术领域，尤其涉及一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂、试剂盒及其方法。

背景技术

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)是一类在细胞内寄生的微生物，是引起泌尿生殖道感染的主要病原体，性生活是其主要的传播方式。CT感染可引起附睾炎、前列腺炎、宫颈炎、子宫内膜炎、输卵管炎、盆腔炎、不孕等严重并发症；在围产期感染可引起新生儿结膜炎和肺炎。由于CT感染临床表现无特异性，常易漏诊，因此，快速、灵敏、特异的诊断方法是预防CT感染的关键。

长期以来，CT感染的常规检测方法是细胞培养法，一直被视为确诊CT感染的金标准，但存在对样本采集和培养条件要求高、耗时、易污染等不足之处；血清抗原/抗体检测，虽简便、快速，但无法提供现症感染资料，且特异性和灵敏度不够。实时荧光定量PCR是近几年兴起来的一种融会了PCR高敏感性、探针杂交高特异性和光谱检测高精确性等技术优点的检测技术，具有快速、高特异、高敏感、可定量等优点，可作为临床检测实用方法，尤其实用于CT感染的早期诊断和无症状携带者的检测。但目前国内此类试剂提取核酸费时、费力，在操作过程中容易导致污染，而且大部分试剂没有预防假阴性的内标控制和防污染体系，影响检测结果的重复性和稳定性。

Bst酶介导的等温扩增具有快速、灵敏、特异性强等优点。另外，微流控芯片作为一种病原体分子检测技术具有高通量、快速、准确、可靠的特点，能够实现对组群样品、多目标同时检测，极大的提高了检测效率。

但目前尚未有基于Bst酶介导的采用多功能微流控芯片进行等温扩增检测沙眼衣原体的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是将基于Bst酶介导的等温扩增的微流控芯片技术应用于沙眼衣原体的核酸检测，且在微流控芯片中完成沙眼衣原体的核酸提取，利用微流控芯片高通量、快速、灵敏、特异性好的特点，提高沙眼衣原体的检测速度、通量和灵敏度，大大降低成本，缩短检测时间。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：

本发明的第一个目的是提供一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂，其包括如下组分：树脂材料、反应缓冲液、Mg²⁺水溶液。

进一步地，所述树脂材料为由聚乙烯乙二烯苯组成的螯合树脂。

进一步地，所述核酸提取试剂中各组分的浓度如下：5wt％树脂材料、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液。

本发明的第一个目的是提供一种用于检测沙眼衣原体的试剂盒，其包括如上述所述的核酸提取试剂。

为了进一步优化上述试剂盒，本发明采用的技术措施还包括：

进一步地，所述试剂盒还包括如SEQ ID NO：1～5所示序列的等温扩增检测引物组和如SEQ ID NO：6～9所示序列的内标片段扩增引物组。

上述引物组的具体序列如下所示：

用于检测沙眼衣原体的等温扩增引物组，包括外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP以及环引物LB，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物F3：GGGTTAATGTTGCATGATGC(SEQ ID NO:1)

外引物B3：CTTTGCTATAGCACTGTCAAG(SEQ ID NO:2)

内引物FIP：TCTTCAGCGCTACACACGCTGCTTAGATCCGTTTCTCATA CG(SEQ ID NO:3)

内引物BIP：TCCGCTCGTTTAATGAGTACAATGACCTTCCCTTTATACGCT CAAG(SEQ ID NO:4)

环引物LB:GCGTAGATCTCCGTTTCT(SEQ ID NO:5)

用于检测沙眼衣原体的内标片段扩增引物组包括外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，其核苷酸序列分别如下所示：

外引物F3：CCAGCTACCATTCTGCTT(SEQ ID NO:6)

外引物B3：TTAGTGATACTTGTGGGCC(SEQ ID NO:7)

内引物FIP：TGGGAGGAAGATAAGAGGTATGAACGGATAAGGCTGGAT TATTCTGAG(SEQ IDNO:8)

内引物BIP：GCCCATCACTTTGGCAAAGACCACCACTTTCTGATAGGC(SEQ ID NO:9)

进一步地，在本发明提供的成套引物中，各4引物组中各条引物的摩尔比如下：6～8μM名称中带“F3”的引物；6～8μM名称中带“B3”的引物；55～57μM名称中带“FIP”的引物；55～57μM名称中带“BIP”的引物；27～29μM名称中带“LB”的引物。更进一步地，本发明提供的成套引物中，各4引物组中各条引物的摩尔比具体可为如下：7μM名称中带“F3”的引物；7μM名称中带“B3”的引物；56μM名称中带“FIP”的引物；56μM名称中带“BIP”的引物；28μM名称中带“LB”的引物。上述所述摩尔比是总摩尔数之比，所述总摩尔数是各引物中各种单链DNA摩尔数之和。

进一步地，所述试剂盒还包括等温扩增试剂，所述等温扩增试剂盒包括Bst酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、荧光染料、MgSO₄。

进一步地，所述等温扩增试剂还包括防污染体系；其中，所述防污染体系为在反应体系里添加UDG酶以及dUTP。

上述的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP统称为d NTPs。

进一步地，所述试剂盒还包括微流控芯片，所述等温扩增检测引物组和内标片段扩增引物组固定至所述微流控芯片的反应池中。

进一步地，所述微流控芯片设置至少1个加样孔，每个加样孔分别对应4个反应池；更进一步地，所述微流控芯片设置8个加样孔，每个加样孔分别对应4个反应池；

进一步地，所述微流控芯片可同时检测8个临床样本，每个样本加样孔对应4个反应池，分别为1个阳性对照(内标)反应池、2个阴性对照反应池、1个临床样本扩增反应池，通过离心将加样孔中的核酸分散到各个反应池，进而扩增，所述微流控芯片为等温扩增的微流控芯片。

可理解的是，本申请也可采用其他合适的微流控芯片，例如4个加样孔，每一加样孔对应6个反应池，或者6个加样孔，每一加样孔对应3个反应池等等。

本发明的第三个目的是提供一种基于非诊断和非治疗目的的用于检测沙眼衣原体的方法，其采用上述试剂盒进行检测，该检测方法包括如下步骤：

步骤1)将等温扩增检测引物组、内标片段扩增引物组与荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶混合，配制成混合溶液，分别固定在微流控芯片的相应的反应池中，将该微流控芯片抽真空干燥2小时后，背面封膜备用；

步骤2)将待测样本与核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片的加样孔，用膜封住加样孔；

步骤3)将微流控芯片放入全自动核酸恒温分析仪，进行等温扩增反应；

步骤4)根据所述全自动核酸恒温分析仪的检测结果判断待测样本中是否含有沙眼衣原体。

进一步地，所述待测样本可来自于人泌尿生殖道。

进一步地，所述等温扩增反应的程序如下：95℃加热5min，启动离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min。

进一步地，所述步骤4)中，是否含有沙眼衣原体的判断依据如下：如果检测结果呈现“S”型扩增曲线，则待测样本中含有沙眼衣原体病原体；如果检测结果呈现直线扩增曲线，则待测样本中不含有沙眼衣原体病原体

进一步地，在该方法中，所述等温扩增检测引物组的最低检测限为10拷贝/μl。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本范明采用的核酸提取试剂是一种化学螯合树脂，可以螯合多价金属离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力，能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质，提取过程在微流控芯片中5min即可完成，进而通过Bst酶介导的等温基因扩增技术在微流控芯片中实现沙眼衣原体的核酸扩增；

本发明将沙眼衣原体的特异核酸序列与微流控芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的沙眼衣原体核酸提取以及检测；本发明提供的沙眼衣原体引物组与其他病原微生物无交叉反应，如淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫，且该引物组的最低检测限为10拷贝/μl。

本发明提供的检测沙眼衣原体的试剂盒，可快速、准确地检测沙眼衣原体，以弥补针对沙眼衣原体检测技术存在的费时耗力的缺陷，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。本发明的检测试剂盒还加入了防污染体系，能有效的防止扩增产物的污染。对于临床而言，能够在1h内获得检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一实施例中应用的微流控芯片的示意图；其中，该微流控芯片具有8个加样孔，每一加样孔分别对应反应池A1-A4、A5-A8、B1-B4、B5-B8、C1-C4、C5-C8、D1-D4、D5-D8。

图2A-图2C为本发明一实施例中利用图1所示的微流控芯片检测3个沙眼衣原体分泌物拭子样本检测结果图；其中图2A为待测样本1的检测结果，图2B为待测样本2的检测结果，图2C为待测样本3的检测结果；其中固定有内参的引物组的反应池A1、A5、B1均呈现“S”型扩增曲线，说明阳性对照扩增正常；没有固定引物的反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；固定有沙眼衣原体的引物组的反应池A4呈现直线扩增曲线，反应池A8和B4呈现“S”型扩增曲线，说明待测样本1中不含有沙眼衣原体，待测样本2和3含有沙眼衣原体病原体。

图3A-图3H为本发明一实施例中利用图1所述的微流控芯片检测沙眼衣原体的特异性扩增曲线图；其中图3A为淋球菌样本扩增结果；图3B为解脲脲原体样本扩增结果；图3C为人型支原体样本扩增结果；图3D为生殖支原体样本扩增结果；图3E为单纯疱疹病毒2型样本扩增结果；图3F为白念珠菌样本扩增结果；图3G为阴道毛滴虫样本扩增结果；图3H为沙眼衣原体样本扩增结果。

图4A-图4G为本发明一实施例中利用图1所述的微流控芯片检测沙眼衣原体的灵敏度的扩增曲线图；其中图4A为阴性对照扩增结果；图4B为10¹copies/μl质粒扩增结果；图4C为10²copies/μl质粒扩增结果；图4D为10³copies/μl质粒扩增结果；图4E为10⁴copies/μl质粒扩增结果；图4F为10⁵copies/μl质粒扩增结果；图4G为10⁶copies/μl质粒扩增结果。

具体实施方式

本发明一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂，其包括如下组分：树脂材料、反应缓冲液、Mg²⁺水溶液；本发明还提供一种用于检测沙眼衣原体的试剂盒，其包括上述核酸提取试剂、SEQ ID NO：1～5所示序列的等温扩增检测引物组和如SEQ ID NO：6～9所示序列的内标片段扩增引物组、微流控芯片等；本发明还涉及一种基于非诊断和非治疗目的的用于检测沙眼衣原体的方法。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

下列实施例中的沙眼衣原体、淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫的临床样本来源于上海市东方医院。

实施例1

本实施例为LAMP引物的设计和合成，其步骤如下：

(1)序列获得：

通过对GeneBank中沙眼衣原体隐蔽性质粒基因序列查询，用Vector NTI软件对各种来源的基因序列进行比对后发现，其序列高度保守并具有很好的同源性。

(2)引物设计；

1)将沙眼衣原体和内标HBB基因的保守区段导入http://primerexplorer.jp/e/v3_manual/index.html软件中，选取F1c和B1c的Tm值相近、F3/B3/F2/B2的Tm值相近，且F1c和B1c的Tm值比F3/B3/F2/B2的Tm值大5℃，5’dG和3’dG的绝对值小于4的DNA序列作为候选引物。

2)引物合成：将下表1中的引物序列委托英潍捷基公司合成，备用。

3)引物筛选：将合成好的引物溶解后进行引物筛选，最终得到用于制备本发明微流控芯片所需要的特异、灵敏的引物，将筛选好的引物连同反应液一起冷冻干燥在微流控芯片的反应池中。

在本发明的一优选实施例中，筛选好的9条引物如表1所示。其中，SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5的引物序列选自沙眼衣原体隐蔽性质粒基因；SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:9的引物序列选自HBB基因的mRNA序列，作为内参用。

表1：本发明微流控芯片上选用的引物序列

实施例2

本实施例为制备用于检测沙眼衣原体的试剂盒。本实施例所述的试剂盒包括：包括核酸提取试剂、SEQ ID NO：1～5所示序列的等温扩增检测引物组和如SEQ ID NO：6～9所示序列的内标片段扩增引物组、等温扩增试剂(Bst酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、荧光染料、MgSO₄、防污染体系(UDG酶以及dUTP))、微流控芯片；其中，所述等温扩增检测引物组和内标片段扩增引物组固定至所述微流控芯片的反应池中。

在一实际操作过程中，本发明所述的试剂盒包括：

(1)真空干燥预混液；

真空干燥预混液包含12mM dNTPs、0.5μM荧光染料、1U/μl Bst酶、0.2U/μl UDG酶、SEQ ID NO：1～5所示序列的沙眼衣原体引物组、SEQ ID NO：6～9所示序列的内标引物组；其中各引物浓度为7μM名称中带“F3”的引物；7μM名称中带“B3”的引物；56μM名称中带“FIP”的引物；56μM名称中带“BIP”的引物；28μM名称中带“LB”的引物。

(2)核酸提取试剂；

核酸提取试剂包含5wt％树脂材料、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液；其中，所述树脂材料为由聚乙烯乙二烯苯组成的螯合树脂。

(3)装载有引物对的32反应池多功能微流控芯片；

所述32反应池多功能微流控芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其型号为8×4，示意图如图1所示。

所述8×4反应池多功能微流控芯片的1#至32#反应池分别存放上述真空干燥预混液。其中，所述沙眼衣原体引物对用于扩增沙眼衣原体，由序列表中序列SEQ ID NO：1～5所示的五条单链DNA分子组成，包埋于反应池A4、A8、B4、B8、C4、C8、D4、D8；所述内标引物对用于扩增人基因组中管家基因HBB mRNA，由序列表中序列NO：SEQ ID NO：6～9所示的四条单链DNA分子组成，包埋于反应池A1、A5、B1、B5、C1、C5、D1、D5；所述阴性对照的反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3、B6、B7、C2、C3、C6、C7、D2、D3、D6、D7，不包埋任何引物。其中，将引物包埋入多功能微流控芯片的方法为：将引物(阴性对照反应池不添加任何引物)、荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶混合，配制成混合溶液；取2μl所述混合液点入相应的多功能微流控芯片反应池中，抽真空干燥2小时后，将微流控芯片的背面封膜备用。所述8×4反应池多功能微流控芯片可以同时检测8个临床样本。

实施例3

本实施例为利用多功能微流控芯片检测沙眼衣原体分泌物拭子样本。其具体步骤如下：

(1)采用实施例2中的方法，将实施例1中用于检测沙眼衣原体的引物组与荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶混合，配制成混合溶液，分别固定在反应池A4、A8、B4；将实施例1中用于监控整个反应的内标引物组与荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶混合，配制成混合溶液，分别固定在反应池A1、A5、B1；将荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶配制成混合溶液，分别固定在反应池；

A2、A3、A6、A7、B2、B3，作为阴性对照，将该微流控芯片抽真空干燥2小时后，背面封膜备用。

(2)将50μl待测样本1与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔1；将50μl待测样本2与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔2；将50μl待测样本3与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔3，用膜封住3个加样孔后，放入微流控芯片的全自动核酸恒温分析仪中95℃加热5min后，启动全自动核酸恒温分析仪离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min；

结果见图2A-图2C，固定有内参的引物组的反应池A1、A5、B1均呈现“S”型扩增曲线，说明阳性对照扩增正常；没有固定引物的反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；固定有沙眼衣原体的引物组的反应池A4呈现直线扩增曲线，说明待测样本1中不含有沙眼衣原体，反应池A8和B4呈现“S”型扩增曲线，待测样本2和3含有沙眼衣原体病原体。

实施例4

本实施例为采用多功能微流控芯片检测沙眼衣原体的特异性。其利用实施例2中制备的多功能微流控芯片进行特异性实验，具体如下：

(1)将实施例1中用于检测沙眼衣原体的引物组与荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶混合，配制成混合溶液，分别固定在反应池A4、A8、B4、B8、C4、C8、D4、D8；将实施例1中用于监控整个反应的内标引物组与荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶混合，配制成混合溶液，分别固定在反应池A1、A5、B1、B5、C1、C5、D1、D5；将荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶配制成混合溶液，分别固定在反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3、B6、B7、C2、C3、C6、C7、D2、D3、D6、D7。将该微流控芯片抽真空干燥2小时后，背面封膜备用。

(2)将50μl淋球菌样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔1；将50μl解脲脲原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔2；将50μl人型支原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔3，将50μl生殖支原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔4；将50μl单纯疱疹病毒2型样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔5；将50μl白念珠菌样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔6，将50μl阴道毛滴虫样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔7；将50μl沙眼衣原体样本与50μl核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔8，用膜封住8个加样孔后，放入微流控芯片的全自动核酸恒温分析仪中95℃加热5min后，启动全自动核酸恒温分析仪离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min；

结果见图3，固定有内参的引物组的反应池A1、A5、B1、B5、C1、C5、D1、D5均呈现“S”型扩增曲线，说明阳性对照扩增正常；没有固定引物的反应池A2、A3、A6、A7、B2、B3、B6、B7、C2、C3、C6、C7、D2、D3、D6、D7均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；固定有沙眼衣原体的引物组的反应池A1、A5、B1、B5、C1、C5、D1呈现直线扩增曲线，说明沙眼衣原体引物组对淋球菌样本、解脲脲原体样本、人型支原体样本、生殖支原体样本、单纯疱疹病毒2样本、白念珠菌样本、阴道毛滴虫样本无交叉反应；反应池D8呈现“S”型扩增曲线，说明可以扩增沙眼衣原体样本。

实施例5

本实施例为采用多功能微流控芯片检测沙眼衣原体的灵敏度，其利用实施例2中制备的多功能微流控芯片进行灵敏度实验，具体如下：

(1)将实施例1中用于检测沙眼衣原体的引物组与荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶混合，配制成混合溶液，分别固定在反应池A1-A8、B1-B8、C1-C8、D1-D8 32个反应池中，并将该微流控芯片抽真空干燥2小时，背面封膜备用。

(2)将10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液、ddH₂O配制的混合液加入微流控芯片的加样孔1和加样孔2；将10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液、10¹copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔3；将10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液、10²copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔4；将10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液、10³copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔5；将10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液、10⁴copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔6；将10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mMMg²⁺水溶液、10⁵copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔7；将10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液、10⁶copies/μl的质粒配制的混合液加入微流控芯片的加样孔8，用膜封住8个加样孔后，放入微流控芯片的全自动核酸恒温分析仪中启动全自动核酸恒温分析仪离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min；

结果见图4，加样孔1和2对应的反应池A1-A8均呈现直线扩增曲线，说明阴性对照扩增正常；加样孔3对应的反应池B1-B4、加样孔4对应的反应池B5-B8、加样孔5对应的反应池C1-C4、加样孔6对应的反应池C5-C8、加样孔7对应的反应池D1-D4、加样孔8对应的反应池D5-D8均呈现“S”型扩增曲线，说明沙眼衣原体引物组的最低检测限为10¹copies/μl。

本发明将沙眼衣原体的特异核酸序列与微流控芯片技术相结合，建立了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的沙眼衣原体核酸提取以及检测；本发明提供的沙眼衣原体引物组与其他病原微生物无交叉反应，如淋球菌、解脲脲原体、人型支原体、生殖支原体、单纯疱疹病毒2型、白念珠菌、阴道毛滴虫，且该引物组的最低检测限为10拷贝/μl。对于临床而言，能够在1h内获得检测结果不仅快于目前较为普遍采用的实时荧光定量PCR方法，而且对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海速创诊断产品有限公司

上海速芯生物科技有限公司

<120> 一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂、试剂盒及其方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 沙眼衣原体扩增引物F3(Artificial Sequence)

<400> 1

gggttaatgt tgcatgatgc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 沙眼衣原体扩增引物B3(Artificial Sequence)

<400> 2

ctttgctata gcactgtcaa g 21

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 沙眼衣原体扩增引物FIP(Artificial Sequence)

<400> 3

tcttcagcgc tacacacgct gcttagatcc gtttctcata cg 42

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 沙眼衣原体扩增引物BIP(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgctcgtt taatgagtac aatgaccttc cctttatacg ctcaag 46

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 沙眼衣原体扩增引物LB(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgtagatct ccgtttct 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 内标扩增引物F3(Artificial Sequence)

<400> 6

ccagctacca ttctgctt 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 内标扩增引物B3(Artificial Sequence)

<400> 7

ttagtgatac ttgtgggcc 19

<210> 8

<211> 48

<212> DNA

<213> 内标扩增引物FIP(Artificial Sequence)

<400> 8

tgggaggaag ataagaggta tgaacggata aggctggatt attctgag 48

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 内标扩增引物BIP(Artificial Sequence)

<400> 9

gcccatcact ttggcaaaga ccaccacttt ctgataggc 39

Claims

1.一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂，其特征在于，包括如下组分：树脂材料、反应缓冲液、Mg²⁺水溶液。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测沙眼衣原体的核酸提取试剂，其特征在于，所述树脂材料为由聚乙烯乙二烯苯组成的螯合树脂，所述核酸提取试剂中各组分的浓度如下：5wt％树脂材料(质量百分比)、10×Isothermal Amplification反应缓冲液、150mM Mg²⁺水溶液。

3.一种用于检测沙眼衣原体的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的核酸提取试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括如SEQ ID NO：1～5所示序列的等温扩增检测引物组和如SEQ ID NO：6～9所示序列的内标片段扩增引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括等温扩增试剂，所述等温扩增试剂盒包括Bst酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、荧光染料、M_gSO₄；所述等温扩增试剂还包括防污染体系，所述防污染体系为在反应体系里添加UDG酶以及dUTP。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括微流控芯片，所述等温扩增检测引物组和内标片段扩增引物组分别固定至所述微流控芯片的反应池中。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述微流控芯片设置至少1个加样孔，每个加样孔分别对应4个反应池。

8.一种用于检测沙眼衣原体的方法，其特征在于，采用权利要求3～7中任一项所述的试剂盒进行检测，该检测方法包括如下步骤：

步骤1)将等温扩增检测引物组、内标片段扩增引物组与荧光染料、dNTPs、Bst DNA聚合酶、UDG酶混合，配制成混合溶液，分别固定在微流控芯片的相应的反应池中，将该微流控芯片抽真空干燥，背面封膜备用；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述等温扩增反应的程序如下：95℃加热5min，启动离心扩增程序，50℃5min，64℃扩增60min。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在该方法中，所述等温扩增检测引物组的最低检测限为10拷贝/μl。