CN110396551A - 一种人类肺部滴虫感染检测的引物及试剂和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明为一种人类肺部滴虫感染检测试剂及检测方法和用途；其中，该检测试剂包括PCR反应液I和PCR反应液II；PCR反应液I包含扩增上下游引物1，PCR反应液II包含扩增上下游引物2。其中，该检测方法包括：引物设计，用引物配置PCR反应液I和PCR反应液II，病患样本采集和DNA提取，巢式PCR和电泳检测；巢式PCR产物还可以进行测序和系统发育进化树分析鉴定，从而实现引起人类肺部感染的多种滴虫的高灵敏度和特异性的一次性检测并鉴定。

Description

一种人类肺部滴虫感染检测的引物及试剂和方法
技术领域
本发明涉及人类肺部滴虫感染检测技术领域，具体涉及利用巢式PCR法，测序技术以及 数据分析实现引起人类肺部感染的多种滴虫一次性检测并鉴定的高灵敏度和特异性的检测 方法。
背景技术
滴虫是一种极微小有鞭毛的原虫生物，其可以感染人和动物的消化系统和生殖系统，其 用肉眼无法看到，需要在显微镜下观察。滴虫一般都是经由性行为而感染，患滴虫性阴道炎 的女性很多，女性患滴虫病并不新鲜。能够感染人体滴虫有阴道毛滴虫、口腔滴虫、人五毛 滴虫等；这些滴虫都有感染人体肺部的报道，并逐渐开始为医师所知。
显微镜镜检法，该方法简便、省时、费用低，目前仍是临床常用的方法。但是，其敏感 度低，检测引导分泌物标本的敏感度仅为35％-80％；影响因素多，首先是滴虫在镜检固定过 程中由于温度较低或者长时间的体外环境减少了检测的灵敏度。其次，肺泡的许多上皮细胞 的移动方式与滴虫类似，这可能阻碍滴虫的检测。第三，滴虫可以发育变成一种变形虫形式， 使它们变得无法辨认。因此，迫切需要建立一种敏感的分子方法来诊断肺毛滴虫病。但是， 由于许多滴虫物种可以感染人肺，因此这样做更加复杂。现有的基于基因的检测方法已被用 于检测单一类型的滴虫，缺少针对可能引起肺部感染的几种滴虫都能够检测的核酸分析方 法。
发明内容
技术问题如下：
第一方面，本发明提供一种人类肺部滴虫感染检测的引物，以该引物为基础的巢式PCR 法，可以一次性检测人类肺部感染的多种滴虫，同时具有高灵敏度和特异性。
第二方面，本发明提供了一种检测试剂，该检测试剂以巢式PCR法为基础，该检测试剂 可以一次性检测人类肺部感染的多种滴虫。
第三方面，本发明提供了一种基于上述检测试剂的人类肺部滴虫感染检测方法，该检测 方法可以实现引起人类肺部感染的多种滴虫一次性检测并鉴定的高灵敏度和特异性的检测。
技术方案如下：
一种人类肺部滴虫感染检测的引物，所述的引物包含：
扩增上下游引物1及其变体；
扩增上下游引物2及其变体；
其中，所述的扩增上下游引物1和引物2均是以不同种类滴虫的保守序列为模板设计， 所述引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列具有PCR退火条件 下低互补结合能力；所述的扩增上下游引物2与扩增上下游引物1的关系为：扩增上下游引 物2结合在扩增上下游引物1的PCR产物内部。
所述的保守序列截取自不同种类滴虫的18S rRNA基因序列。
所述的变体为参照引物的变体，所述的参照引物为扩增上下游引物1和扩增上下游引物 2，所述的变体与所述的参照引物保持相同的扩增功能，所述相同的扩增功能为可以扩增出 不同种类滴虫的基因，且无法扩增出人类支气管肺泡灌洗液中存在的本底基因。
所述的变体的引物序列长度为18bp-27bp，GC含量为40-60％，自身不易形成严重的发 卡结构和二聚体结构。
所述的人类支气管肺泡灌洗液包括：正常人类的支气管肺泡灌洗液、患有或不患有肺部 滴虫感染的人类支气管肺泡灌洗液、患病或不患病的人类的支气管肺泡灌洗液；所述的人类 包括各个年龄段的人类。
所述的低互补结合能力为PCR反应退火温度至多为45℃时，引物1和引物2的序列与 人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列不会发生动态过程中的相对互补结合或可以发生 部分互补结合但是无法到达延伸反应所需的结合自由能。
所述的扩增上下游引物1为：
TRC1-F 5′-GGTAATTCCAGCTCTGCG-3′；
TRC1-R 5′-TGGTAAGTTTCCCCGTGT-3′。
所述的扩增上下游引物2为：
TRC2-F 5′-GTTAAAACGCCCGTAGTC-3′；
TRC2-R 5′-CCAGAGCCCAAGAACTAT-3′。
所述的不同种类的滴虫在进化树分支上属于不同物种或相同物种的亚种。
所述的滴虫包括：阴道毛滴虫、口腔滴虫、人五毛滴虫和四毛滴虫。
一种人类肺部滴虫感染的检测试剂，包含阳性对照、阴性对照、质控品以及巢式PCR 通用试剂，该检测试剂还包括：
PCR反应液I；所述的PCR反应液I包含扩增上下游引物1及其变体；
PCR反应液II；所述的PCR反应液II包含扩增上下游引物2及其变体。
该方法可以对人类肺部感染的多种滴虫一次性检测并鉴定，方法包括：以不同种类的滴 虫的保守序列为模板设计引物，PCR反应液I和PCR反应液II制备，标本采集，巢式PCR 一次性检测。
该方法包括以下步骤：
1)引物设计：针对进化树分支的不同滴虫物种，选择18S rRNA基因序列进行分析，序列比对分析得到保守序列，以该保守序列为模板，设计引物1和引物2，引物2结合在引 物1的PCR产物内部；
2)PCR反应液I和PCR反应液II制备：将获得的引物用水或缓冲液稀释得到；
3)样本采集：生理盐水肺泡灌洗得灌洗液，离心，弃去上清液，收集沉淀作为样本；
4)DNA提取：取支气管肺泡灌洗液沉淀物，进行DNA提取，获得DNA样本；
5)巢式PCR：第一轮PCR：向反应管中加入PCR反应液I，DNA样本，配制PCR反应体系；PCR仪设置PCR反应条件，进行PCR获得PCR产物1；第二轮PCR：向反应管中加入PCR 反应液II，PCR产物1，配制PCR反应体系；PCR仪设置PCR反应条件，进行PCR获得PCR 产物2；
6)PCR产物2电泳检测。
步骤3)中，每位患者用20至120ml的生理盐水灌洗。
所述的步骤4)中DNA提取方法可以选自DNA提取试剂盒、酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备中的任意一种。
所述的DNA提取方法为DNA提取试剂盒。
所述的步骤6)中PCR产物2电泳检测可以为琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳。
其中，还包括巢式PCR最终PCR产物的测序和系统发育进化树分析鉴定。
所述的系统发育进化树分析鉴定包括用基因组数据库BLAST分析鉴定和滴虫专业数据 库18S rRNA进行序列比对分析鉴定。
所述的基因组数据库为GenBank数据库,所述的滴虫专业数据库为国家生物技术信息 中心数据库。
有益效果如下：
我们设计的人类肺部滴虫感染检测试剂及检测方法能够灵敏，特异地检测支气管肺泡灌 洗液(BALF)标本中的滴虫。115个BALF样品中，10个样品在巢式PCR中呈阳性(10/115)， 而在湿式显微镜检测中没有样品呈阳性(0/115)(P<0.01)，巢式PCR的阳性率显着高于显 微镜。不仅如此，我们设计的巢式PCR具有高特异性，序列导入GenBank数据库中进行BLAST 分析后，所有序列显示与毛滴虫序列的同源性(≈380bps)不低于99％。
附图说明
附图1为不同种滴虫的检测结果。
附图2为巢式PCR法与显微镜镜检法的检测敏感性比较图。
附图3为10例阳性标本PCR产物的电泳图。
附图4为基于18S RNA序列的毛滴虫家族系统发育进化树。
说明：附图1中，M：100-bp DNA molecular size markers；+：阳性质控(阴道毛滴虫)； –：阴性对照(人基因组)；1：弓形虫；2：蓝氏贾弟鞭毛虫；3：人五毛滴虫；4：阴道 毛滴虫；5：口腔毛滴虫。
附图2中，A:巢式PCR检测敏感性分析的凝胶电泳图；B:显微镜镜检法的敏感性分析图；M：100-bp DNA分子标志；+：阳性对照(阴道毛滴虫)；–：阴性对照(人基因 组)；1–4：梯度稀释的含阴道毛滴虫的肺泡灌洗液标本(105 104,103,102个滴虫/毫升)； 黑色方格表示镜检阳性；灰色方格表示镜检阴性。
附图3中，M：100bp DNA Marker；+：阳性对照(阴道毛滴虫)；H：阴性对照(人血基因组)；T：阴性对照(弓形虫基因组)；1-10：阳性标本。
附图4中，其中相关的分类群在引导测试中聚集在一起；将10个阳性样本的序列(图 中的圆点所示)与国家生物技术信息中心数据库中可获得的80个滴虫序列进行比较。阴 道毛滴虫，如图中的菱形所示，被用作阳性对照并被分组在适当的种类分支中。
具体实施方式
参考附图对本发明一种人类肺部滴虫感染检测的引物及试剂和方法，进行详细描述。
本发明为一种人类肺部滴虫感染检测的引物及试剂和方法，该检测的引物及试剂和方法 主要用于引起人类肺部感染的多种滴虫的检测和鉴定；其检测样本优选为支气管肺泡灌洗液 (BALF)。其检测样本的处理为用支气管镜检查进行肺泡灌洗时，尽可能避免口腔接触；根 据情况给每位患者进行20至120ml的生理盐水冲洗。然后，在400g离心5分钟后，弃去上 清液，收集沉淀物400μl。
本发明为一种人类肺部滴虫感染检测的引物，引物包含：扩增上下游引物1及其变体；扩增 上下游引物2及其变体；其中，所述的扩增上下游引物1和引物2均是以不同种类滴虫的保 守序列为模板设计，所述引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列 具有PCR退火条件下低互补结合能力；所述的扩增上下游引物2与扩增上下游引物1的关 系为：扩增上下游引物2结合在扩增上下游引物1的PCR产物内部。
由于感染肺部滴虫的物种较多，不排除还未发现的一些新物种。因此，本发明人，针对 进化树分支的不同滴虫物种，选择18S rRNA基因序列进行分析；优选为，保守序列截取自 不同种类滴虫的18S rRNA基因序列。
由于18S rRNA基因序列本身具有相当的保守序列，以及引物本身设计的自由性较大； 因此，该引物还包括其变体。优选为，所述的变体为参照引物的变体，所述的参照引物为扩 增上下游引物1和扩增上下游引物2，所述的变体与所述的参照引物保持相同的扩增功能， 所述相同的扩增功能为可以扩增出不同种类滴虫的基因，且无法扩增出人类支气管肺泡灌洗 液中存在的基因。
优选为，所述的变体的引物序列长度为18bp-27bp，GC含量为40-60％，自身不易形成 严重的发卡结构和二聚体结构。
考虑到病人情况复杂，因此人类支气管肺泡灌洗液的成分也同样复杂，因此样本的选取 应包含各个年龄阶段的不同人群，随机，检测前进行编盲。优选为，所述的人类支气管肺泡 灌洗液包括：正常人类的支气管肺泡灌洗液、患有或不患有肺部滴虫感染的人类支气管肺泡 灌洗液、患病或不患病的人类的支气管肺泡灌洗液；所述的人类包括各个年龄段的人类。
本发明所设计的引物特异性较高，重要的一个方面是，所设计的引物无法扩增出BALF 样本中的本地核酸序列，扩增条带较为单一。优选为，所述的低互补结合能力为PCR反应 退火温度至多为45℃时，引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序 列不会发生动态过程中的相对互补结合或可以发生部分互补结合但是无法到达延伸反应所 需的结合自由能。
优选为，本发明的扩增上下游引物1为：
TRC1-F 5′-GGTAATTCCAGCTCTGCG-3′；
TRC1-R 5′-TGGTAAGTTTCCCCGTGT-3′。
优选为，本发明的扩增上下游引物2为：
TRC2-F 5′-GTTAAAACGCCCGTAGTC-3′；
TRC2-R 5′-CCAGAGCCCAAGAACTAT-3′。
其中，本发明所选的不同的滴虫物种，在进化分支上属于不同的物种，或相同物种的亚 种。
优选为，所述的滴虫包括：阴道毛滴虫、口腔滴虫、人五毛滴虫和四毛滴虫。
本发明还包括一种基于该引物和巢式PCR法为基础的人类肺部滴虫感染检测试剂，该检
测试剂，该检测试剂包含阳性对照、阴性对照、质控品以及巢式PCR通用试剂，该检测
试剂还包括：
PCR反应液I；所述的PCR反应液I包含扩增上下游引物1及其变体；
PCR反应液II；所述的PCR反应液II包含扩增上下游引物2及其变体。
本发明还包括一种基于上述检测试剂的人类肺部滴虫感染检测方法，该检测方法可以实 现引起人类肺部感染的多种滴虫一次性检测并鉴定的高灵敏度和特异性的检测。该方法包 括：以不同种类的滴虫的保守序列为模板设计引物，PCR反应液I和PCR反应液II制备， 标本采集，巢式PCR一次性检测。
优选为，该方法包括以下步骤：
1)引物设计：针对进化树分支的不同滴虫物种，选择18S rRNA基因序列进行分析，序列 比对分析得到保守序列，以该保守序列为模板，设计引物1和引物2，引物2结合在引物1的PCR产物内部；
2)PCR反应液I和PCR反应液II制备：将获得的引物用水或缓冲液稀释得到；
3)样本采集：生理盐水肺泡灌洗得灌洗液，离心，弃去上清液，收集沉淀作为样本；
4)DNA提取：取支气管肺泡灌洗液沉淀物，进行DNA提取，获得DNA样本；
5)巢式PCR：第一轮PCR：向反应管中加入PCR反应液I，DNA样本，配制PCR反应体系；PCR仪设置PCR反应条件，进行PCR获得PCR产物1；第二轮PCR：向反应管中加入PCR 反应液II，PCR产物1，配制PCR反应体系；PCR仪设置PCR反应条件，进行PCR获得 PCR产物2；
6)PCR产物2电泳检测。
优选为，步骤3)中，每位患者用20至120ml的生理盐水灌洗，该数据根据实际情况而定。
优选为，DNA提取方法可以选自DNA提取试剂盒、酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠 绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备中的任意 一种。不同的DNA提取方法根据实验室本身的条件而定。
发明人根据自身实验条件，优选为，DNA提取试剂盒，该方法简单方便，结果稳定。
巢式PCR后得到PCR产物2，可以通过电泳检测，其条带大小为≈380bps；初步的检测还可以通过分光光度法对核酸浓度检测是否含有PCR产物2，其大小可以通过电泳检测。优选为，PCR产物2电泳检测可以为琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳。
由于琼脂糖凝胶电泳简单方便，优选为，琼脂糖凝胶电泳。
巢式PCR后得到PCR产物2的电泳检测，无法对BALF标本中的不同种类的滴虫进行鉴 定。为了进一步了解患者BALF标本中滴虫的种类，需要进一步做鉴定。
优选为，通过测序和系统发育进化树分析鉴定，优点是该鉴定方法准确。
优选为，所述的系统发育进化树分析鉴定包括用基因组数据库BLAST分析鉴定和滴虫专 业数据库18S rRNA进行序列比对分析鉴定。
优选为，所述的基因组数据库为GenBank数据库,所述的滴虫专业数据库为国家生物技 术信息中心数据库。
实施例1
PCR反应液I和PCR反应液II制备
1.引物设计：针对进化树分支的不同滴虫物种，选择18S rRNA基因序列进行分析，引物
设计方法为：从NCBI下载了不同种类滴虫的所有18S rRNA基因序列，序列比对分析得
到保守序列，以该保守序列为模板，设计引物。所选用的不同的滴虫的物种包含：阴道
毛滴虫、口腔滴虫、人五毛滴虫和四毛滴虫。
扩增上下游引物1为：
TRC1-F 5′-GGTAATTCCAGCTCTGCG-3′；
TRC1-R 5′-TGGTAAGTTTCCCCGTGT-3′。
扩增上下游引物2为：
TRC2-F 5′-GTTAAAACGCCCGTAGTC-3′；
TRC2-R 5′-CCAGAGCCCAAGAACTAT-3′。
2.PCR反应液I制备：用超纯水配置扩增上下游引物1，浓度为10μM。
3.PCR反应液II制备：用超纯水配置扩增上下游引物2，浓度为10μM。
实施例2
人类肺部滴虫感染检测试剂及检测方法
一、方法
1.支气管肺泡灌洗标本采集
样本来源：温州医科大学附属第一医院就诊的113例患者中，共获得115份BALF样本， 样本进行编盲。
样本制备方法：用支气管镜检查进行肺泡灌洗时，尽可能避免口腔接触。根据情况给每 位患者进行20至120ml的生理盐水冲洗。然后，在400g离心5分钟后，弃去上清液，收集沉淀物400μl。
2.显微镜检查
取50μl沉淀物，用生理盐水直接涂片，湿片镜检。这种直接显微镜检查在BALF收集后 两小时内进行。整个研究中显微镜的质量控制由经验丰富的显微镜专家保持，经验丰富的显 微镜专家在15分钟内重新检查所有载玻片。在400倍的放大倍数下进行显微镜检查，检查 20个视野。鞭毛化的原生动物，有一到四个白细胞大小，其被认为是滴虫。如没有发现滴 虫，诊断为阴性。
3.DNA提取和巢式PCR
取200μl的BALF沉淀物，用TIANamp Blood DNA试剂盒进行基因组DNA提取。
18S rRNA基因第一轮PCR扩增。
第一轮PCR反应体系如下：
反应条件：94℃2分钟→(98℃10秒→53℃30秒→68℃30秒)×20个循环→68℃5分钟。
18S rRNA基因第二轮PCR扩增。
第二轮PCR反应体系如下：
反应条件：98℃2分钟→(98℃10秒→54℃30秒→68℃30秒)×35个循环→68℃5分钟。
4.巢式PCR法的灵敏度和特异性
为了比较巢式PCR和镜检之间的最低检测限：直观法检测最低检测限方法为，取不同 的离心管，用阴道毛滴虫梯度稀释BALF溶液得到已知浓度分析物样品，该样品中滴虫的终 浓度分别为0.1,1,10,102只滴虫/μl；以此样品作为检测样品，分装一式三份进行检测。巢式PCR法特异性检测方法为获取阴道毛滴虫、口腔毛滴虫、肠道毛滴虫、人血DNA、弓形 虫和蓝氏贾弟鞭毛虫的基因，配置样品进行巢式PCR特异性评价。
5.系统发育进化树分析
PCR扩增之后，通过琼脂糖凝胶电泳，切胶获得约400bp的单个扩增子。使用测序引物 TRC2-F和TRC2-R对扩增子进行测序，获得18S rRNA基因序列。将获得的18S rRNA基因序列导入GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行BLAST分析， 并鉴定滴虫的类型。将18S rRNA基因序列和国家生物技术信息中心数据库获得的80种滴虫18S rRNA进行序列比对分析，做进一步鉴定。使用MEGA7构建系统发育树，方法为用ClustalW程序进行多重比对，用基于Tamura-Nei模型的邻接方法推断出进化树。通过自助测试(1000 次重复)计算相关分类群聚集在一起的复制树的百分比。基于分支长度与用于推断系统发育 树的进化距离相同，按比例绘制系统发育进化树。使用最大复合似然法计算进化距离，并以 每个位点的碱基取代数的单位表示。分析涉及91个核苷酸序列，密码子位置包括第1+第2+ 第3+非编码；所有包含缺口和缺失数据的位置都被消除，最终数据集中总共有314个。
6.统计分析
巢式PCR和显微镜镜检法对115个样品检测，并用Microsoft Excel和IBM SPSS20.0 分析数据。Fisher检验用于比较频率数据，基于β分布的Clopper-Pearson分析方法用于 确定比例为95％的置信区间。当P<0.05时，差异被认为是统计学上显着的。
二、结果
1.不同种类滴虫的特异性检测结果
为了测试检测滴虫的方法的能力，测试了人体中三种最常见的滴虫和两种其他常见寄生 虫。在巢式PCR后的凝胶电泳中结果如图1所示：阴道毛滴虫、口腔毛滴虫、肠道毛滴虫 都有单一条带(380bp)而阴性对照(人血DNA)与弓形虫、蓝氏贾弟鞭毛虫没有条带出现而阳性对照(阴道毛滴虫)有单一条带。
2.巢式PCR法灵敏度检测结果
如图2所示：通过对一系列稀释的含阴道毛滴虫的肺泡灌洗液的标本进行检测发现巢式 PCR法的最低检测限是100个滴虫/亳升，而镜检法的最低检测限是10000个滴虫/毫升。
3.支气管肺泡灌洗液的检测结果
通过巢式PCR检测115例常规送检的肺泡灌洗液标本，其中有10例标本出现阳性。同 时阴性对照(人血基因组、弓形虫基因组)没有条带，而阳性对照(阴道毛滴虫标本)有单一条带。10例阳性标本以及阴、阳性对照的电泳结果如图3所示，通过回顾性分析，没有 发现检测阳性的患者有HIV感染或放射治疗史。
4.序列比对结果
阳性标本通过测序技术进行序列检测，然后通过NCBI的序列比对功能进行序列比对。 经过序列比对发现，全部样本均比对到滴虫属，与滴虫的同源性均不少于99％。
5.显微镜镜检法和巢式PCR法阳性检出率结果
通过巢式PCR和显微镜检查从113名患者获得的115个BALF样品。结果如下表所示，在巢 式PCR中10个样品是阳性的，而没有样品在显微镜检查中呈阳性(P<0.01)。
方法类型 阳性(n) 阴性(n) P
巢式PCR法 10 105
显微镜镜检法 0 115 <0.01
6.系统发育进化树分析结果
如图4所示，两个样品被分类为四毛滴虫属(Tetratrichomonas)，其他样品被分类为 口腔毛滴虫(Trichomonas tenax)。

Claims (20)

1.一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的引物包含：
扩增上下游引物1及其变体；
扩增上下游引物2及其变体；
其中，所述的扩增上下游引物1和引物2均是以不同种类滴虫的保守序列为模板设计，所述引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列具有PCR退火条件下低互补结合能力；所述的扩增上下游引物2与扩增上下游引物1的关系为：扩增上下游引物2结合在扩增上下游引物1的PCR产物内部。
2.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的保守序列截取自不同种类滴虫的18S rRNA基因序列。
3.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的变体为参照引物的变体，所述的参照引物为扩增上下游引物1和扩增上下游引物2，所述的变体与所述的参照引物保持相同的扩增功能，所述相同的扩增功能为可以扩增出不同种类滴虫的基因，且无法扩增出人类支气管肺泡灌洗液中存在的本底基因。
4.根据权利要求3所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的变体的引物序列长度为18bp-27bp，GC含量为40-60％，自身不易形成严重的发卡结构和二聚体结构。
5.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的人类支气管肺泡灌洗液包括：正常人类的支气管肺泡灌洗液、患有或不患有肺部滴虫感染的人类支气管肺泡灌洗液、患病或不患病的人类的支气管肺泡灌洗液；所述的人类包括各个年龄段的人类。
6.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的低互补结合能力为PCR反应退火温度至多为45℃时，引物1和引物2的序列与人类支气管肺泡灌洗液中存在的核酸序列不会发生动态过程中的相对互补结合或可以发生部分互补结合但是无法到达延伸反应所需的结合自由能。
7.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的扩增上下游引物1为：
TRC1-F 5′-GGTAATTCCAGCTCTGCG-3′；
TRC1-R 5′-TGGTAAGTTTCCCCGTGT-3′。
8.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的扩增上下游引物2为：
TRC2-F 5′-GTTAAAACGCCCGTAGTC-3′；
TRC2-R 5′-CCAGAGCCCAAGAACTAT-3′。
9.根据权利要求1所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的不同种类的滴虫在进化树分支上属于不同物种或相同物种的亚种。
10.根据权利要求9所述的一种人类肺部滴虫感染检测的引物，其特征在于，所述的滴虫包括：阴道毛滴虫、口腔滴虫、人五毛滴虫和四毛滴虫。
11.一种包含权利要求1-10的引物的检测试剂，包含阳性对照、阴性对照、质控品以及巢式PCR通用试剂，其特征在于，该检测试剂还包括：
PCR反应液I；所述的PCR反应液I包含扩增上下游引物1及其变体；
PCR反应液II；所述的PCR反应液II包含扩增上下游引物2及其变体。
12.一种包含权利要求1-11的检测试剂的人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，该方法可以对人类肺部感染的多种滴虫一次性检测并鉴定，方法包括：以不同种类的滴虫的保守序列为模板设计引物，PCR反应液I和PCR反应液II制备，标本采集，巢式PCR一次性检测。
13.根据权利要求12所述的一种人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)引物设计：针对进化树分支的不同滴虫物种，选择18S rRNA基因序列进行分析，序列比对分析得到保守序列，以该保守序列为模板，设计引物1和引物2，引物2结合在引物1的PCR产物内部；
2)PCR反应液I和PCR反应液II制备：将获得的引物用水或缓冲液稀释得到；
3)样本采集：生理盐水肺泡灌洗得灌洗液，离心，弃去上清液，收集沉淀作为样本；
4)DNA提取：取支气管肺泡灌洗液沉淀物，进行DNA提取，获得DNA样本；
5)巢式PCR：第一轮PCR：向反应管中加入PCR反应液I，DNA样本，配制PCR反应体系；PCR仪设置PCR反应条件，进行PCR获得PCR产物1；第二轮PCR：向反应管中加入PCR反应液II，PCR产物1，配制PCR反应体系；PCR仪设置PCR反应条件，进行PCR获得PCR产物2；
6)PCR产物2电泳检测。
14.根据权利要求13所述的一种人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，步骤3)中，每位患者用20至120ml的生理盐水灌洗。
15.根据权利要求13所述的一种人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，所述的步骤4)中DNA提取方法可以选自DNA提取试剂盒、酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备中的任意一种。
16.根据权利要求15所述的一种人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，所述的DNA提取方法为DNA提取试剂盒。
17.根据权利要求13所述的一种人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，所述的步骤6)中PCR产物2电泳检测可以为琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳。
18.根据权利要求12所述的一种人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，还包括巢式PCR最终PCR产物的测序和系统发育进化树分析鉴定。
19.根据权利要求18所述的一种人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，所述的系统发育进化树分析鉴定包括用基因组数据库BLAST分析鉴定和滴虫专业数据库18S rRNA进行序列比对分析鉴定。
20.根据权利要求19所述的一种人类肺部滴虫感染检测方法，其特征在于，所述的基因组数据库为GenBank数据库,所述的滴虫专业数据库为国家生物技术信息中心数据库。
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