CN106282340A - 鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒及制备方法 Download PDF

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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开一种鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒及制备方法，根据鼠三毛滴虫、人五毛滴虫16S rRNA基因的部分保守序列设计引物，建立特异nested PCR检测方法，并且通过优化PCR反应的Mg2+浓度、退火温度等反应条件来提高其灵敏性和准确性，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果方便、快捷。用一套nested PCR引物即可对鼠三毛滴虫和人五毛滴虫进行快速检测，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点。

Description

鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒及制备方法
技术领域
本发明公开一种鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒，主要用于鼠粪便中鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)或人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)的快速PCR检测，本发明还提供了该试剂盒的制备方法和用法，属于寄生虫检测技术领域。
背景技术
毛滴虫(Trichomoniasis)是原生动物门(Protozoa)鞭毛纲(Flagellata)动鞭毛亚纲(Zoomastigina)毛滴虫目(Trichomonadida)的条件性致病寄生虫。在临床上，鼠类动物尤以鼠三毛滴虫(T.muris)和人五毛滴虫(P.hominis)的致病性最强，普遍存在于多种动物消化道，特别是鼠的盲肠中。
小白鼠、豚鼠等鼠常用作实验动物，是很重要的实验材料，根据实验动物国家标准《实验动物寄生虫学等级及监测》(GB14922.1-2001)规定：无特定病原体(specificpathogen free,SPF)级的小鼠、大鼠、豚鼠和地鼠作为实验动物时体内不得携带鞭毛虫及纤毛虫。从实验动物管理层面上看，动物的屏障系统作用下小鼠、大鼠等实验动物感染了毛滴虫，说明实验室的实验动物管理水平有待提高或实验员的操作技术不成熟，需进一步加强实验动物管理。从寄生虫角度上看，小鼠、大鼠等实验动物中存在毛滴虫，在一定程度上预示着实验动物可能感染了其他病原体，对以后的实验具有一定预警作用，提示实验员需加强预防、控制病原体的侵入。
目前，鼠毛滴虫检测试剂盒暂时没有，因而鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒同样空缺。检测鼠毛滴虫的主要方法是涂片镜检法，该法费时费力，检出率和可信度低。研发一种与免疫学技术相关的检测试剂盒周期长、耗费大，故从分子生物学技术的角度研发一种特异性和灵敏度高的鼠毛滴虫特异PCR检测试剂盒是首选。由于粪便样本组分十分复杂，其中含有大量生物，使用普通PCR法进行检测经常出现假阳性结果。而nested PCR针对普通PCR的缺陷改进后，其特异性、灵敏性进一步提升。本专利以鼠毛滴虫16S rRNA 基因部分保守序列为靶序列，设计两对特异nested PCR 引物，建立特异nested PCR 检测方法，制备鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒，用于检测鼠毛滴虫。
发明内容
本发明提供一种鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒，能检测鼠粪便中鼠三毛滴虫、人五毛滴虫的nested PCR检测试剂盒，可用于鼠三毛滴虫或人五毛滴虫的快速检测。
本发明进一步提供了鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒的制备方法。
本发明所述的一种鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒的组成材料：
（1）PCR反应液：dNTP Mixture(2.5mM/each)，MgCl2(25mM)，10╳PCR Buffer(Mg2+free)，和灭菌ddH2O。其中，r Taq Polymerase(5U/μl)另装。
（2）特异nested PCR 引物(均15pM)：
第一轮PCR引物：F1：5'-ACA CTT CGG TCA TAG ATT AA-3'
F2：5'-AGG GAT TCC TGG TTC AT-3'
第二轮PCR引物：R1：5'-AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG-3'
R2：5'-CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC-3'
（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA 模板为鼠三毛滴虫(T.muris)或人五毛滴虫(P.hominis)基因组DNA，用于比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确；
（4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。
本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖（Agarose）、溴酚蓝点样缓冲液和溴化乙锭(E.B)10μg/μl，也还可以含有PCR反应管。
本发明所述的一种鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1) 粪便基因组DNA的提取：
使用生物公司出售的粪便基因组DNA提取试剂盒，提取鼠粪便中鼠三毛滴虫(T.muris)、人五毛滴虫(P.hominis)的基因组DNA。
2）PCR 扩增：
（1）准备待检样品的PCR 反应管并分别标记，管内加入PCR 反应液，然后加入引物、基因组DNA模板和r Taq Polymerase(5U/μl)，涡旋混匀后瞬时离心后，放入PCR仪中，设置PCR反应条件。
（2）第一轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性50s、50℃退火50s、72℃延伸1min，共30个循环，后72℃延伸12min。
（3）以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性50s、50℃退火50s、72℃延伸1min，共30个循环，后72℃延伸12min。
3）PCR产物观察：
配制1.0%琼脂糖凝胶(加入浓度0.5μg/mL的E.B)，加样后100V-150V电压下电泳20-30min，之后在紫外灯或凝胶成像系统下观察实验结果，若样品第二轮在724bp或727bp大小处存在条带就证明该样品为阳性。测序可准确知道是何种鼠毛滴虫。
本发明的积极效果在于：根据鼠三毛滴虫、人五毛滴虫16S rRNA基因的部分保守序列设计引物，建立特异nested PCR检测方法，并且通过优化PCR反应的Mg2+浓度、退火温度等反应条件来提高其灵敏性和准确性，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后观察结果方便、快捷。用一套nested PCR引物即可对鼠三毛滴虫和人五毛滴虫进行快速检测，具有操作简单、灵敏度高、特异性强等特点。
附图说明
附图1：鼠毛滴虫nested PCR的引物验证图；
附图2：鼠毛滴虫nested PCR的Mg2+浓度的优化图；
附图3：第一轮PCR退火温度的优化图；
附图4：第二轮PCR退火温度的优化图；
附图5：鼠毛滴虫nested PCR的灵敏度试验图；
附图6：鼠毛滴虫nested PCR的特异性试验图；
附图7：鼠毛滴虫nested PCR的实际应用图。
具体实施方式
下列实施例旨在更清楚地阐明该发明，而不是限制本发明。本领域技术人员充分可以明白到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例1
1、鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒的引物设计
根据鼠三毛滴虫、人五毛滴虫16S rRNA基因部分保守序列，用生物软件设计特异性诊断引物如下：
第一轮PCR引物：F1：5'-ACA CTT CGG TCA TAG ATT AA-3'
F2：5'-AGG GAT TCC TGG TTC AT-3'
第二轮PCR引物：R1：5'-AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG-3'
R2：5'-CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC-3'
以上两对引物中F1、F2为第一轮PCR 引物，R1、R2为第二轮PCR引物。其中，第一轮在基因组DNA浓度较高时能扩增出1362bp或 1360bp大小的条带，第二轮能扩增出724bp或727bp大小诊断基因片断，目的条带明亮，无非特异性杂带(见附图1)。能够实现灵敏、特异地检测出鼠三毛滴虫、人五毛滴虫的目的。
、鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒的组成
（1）PCR反应液：dNTP Mixture(2.5mM/each)， MgCl2(25mM)，10╳PCR Buffer(Mg2+free) 和灭菌ddH2O。其中，r Taq Polymerase(5U/μl)另装。
（2）引物：外侧上游引物(F1)、外侧下游引物(F2)、内侧上游引物（R1）和内侧下游引物(R2)(均15pM)。
（3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA 模板为鼠三毛滴虫或人五毛滴虫基因组DNA，用于比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确。
（4）阴性对照的模板为灭菌ddH2O，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。
此外，本发明的试剂盒还可以含有琼脂糖（Agarose）、溴酚蓝点样缓冲液和溴化乙锭(E.B)10μg/μl，还可以含有PCR反应管。
实施例2
1、鼠毛滴虫nested PCR反应条件优化
特异nested PCR反应条件的优化过程为：
Mg2+浓度的优化：设置Mg2+浓度梯度分别为0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2.0mmol/L、2.5 mmol/L、3.0 mmol/L、3.5 mmol/L、4.0 mmol/L，结果显示最佳Mg2+浓度为2.0mmol/L(见附图2)。第一轮PCR退火温度的优化：设置退火温度梯度分别为44.0℃、47.0℃、50.0℃、53.0℃、56.0℃、59.0℃、62.0℃、65.0℃、68.0℃、71.0℃，结果显示最佳退火温度为50.0℃(见附图3)。
第二轮PCR退火温度的优化：设置退火温度梯度分别为44.0℃、47.0℃、50.0℃、53.0℃、56.0℃、59.0℃、62.0℃、65.0℃、68.0℃、71.0℃，结果显示最佳退火温度为50.0℃(见附图4)。
、鼠毛滴虫nested PCR灵敏度试验
将培养的毛滴虫计数后，并用灭菌的ddH2O依次倍比稀释为每毫升中含 106、105、104、103、102、101、100个鼠毛滴虫，分别提取其基因组DNA。应用上述含不同虫体数量的基因组DNA作为模板，混合液按照上游引物1.5μl、下游引物1.5μl、dNTP Mixture 4μl、10╳PCRBuffer(Mg2+ free) 5μl、MgCl2 4μl、DNA模板1μl、r Taq Polymerase 0.5μl，最后用灭菌ddH2O补至50μl体系，并且用优化好的反应条件进行 PCR扩增，以此来确定nested PCR的灵敏度。第一轮能检测出103个/mL鼠毛滴虫，第二轮可检测出101个/mL鼠毛滴虫，最终确定nested PCR可检测到粪便10个/mL鼠毛滴虫的DNA，属高灵敏度检测方法，符合敏感性检测标准(见附图5)。
、鼠毛滴虫nested PCR特异性试验
为了确定nested PCR特异性，本实验可选取鼠三毛滴虫或人五毛滴虫作为阳性对照，灭菌的ddH2O作为阴性对照，然后选取吉林大学动物医学学院寄生虫科研实验室保存的寄生虫基因组，分别是隐孢子虫、新孢子虫、Eimeria tenella、弓形虫、伊氏锥虫、贾第虫作为DNA模板，同时按照上述的体系操作和优化好的反应条件进行PCR扩增，来确定所建立的nested PCR检测方法是否特异，结果只有阳性对照（鼠毛滴虫）出现特异条带，证明所建立的nested PCR方法特异性良好(见图6)。
、实际样品检测
购买辽宁省实验动物资源中心普通级小白鼠62只，取其盲肠粪便作为检测样品62份，提取其粪便基因组DNA 62份，按照上述的体系操作和优化好的反应条件进行PCR扩增，操作重复3次，经nested PCR检测出51个阳性结果(见附图7)。
实施例3
1、鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒的稳定性和重复性试验
阳性模板、nested PCR反应液、引物和r Taq Polymerase(5U/μl)在-20℃条件下贮存，溴酚蓝等其它物品常温保存即可。当贮存时间为1个月、2个月、3个月、5个月和6个月时取出试剂盒，用已知的阳性样品鉴定试剂盒稳定性。取10份阳性样品用该试剂盒重复检测3次，同时做阴性对照，结果表明在724bp或727bp大小处有特异的目的带，而阴性对照均无任何扩增带，故此试剂盒稳定性和重复性良好。
、鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒的保质期试验
将在-20℃贮存1个月、3个月和6个月的试剂盒取出并对已知阳性样品进行检测。按照该试剂盒的说明进行操作，结果表明在-20℃条件下保存达6月之久的试剂盒依然能扩增出清晰的目的条带，无杂带。
序列表
<110> 吉林大学
<120>
<140>
<160> 1
<210> 1
<211> 1362
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)
<400> 1
1 ACACTTCGGT CATAGATTAA GCCATGCAAG TGTTAGTTCA GGCAACGAAA CTGCGAACAG
61 CTCATTAATA CGCTCAGAAT CTACCTGGTG GCAACCTTTC AGGTTTTATT TGGATAGCAG
121 CAGTAATTCT GGTGCTAATA CATGCGATTG TTTCACTACG TTGAGAAATA GTGGAAAAGT
181 TGACCCTTAC GGGCACACCA ATCGATTGAG CGACCTATCA TGCTTGTACT TAGGGTCTTT
241 ACCTAGGTAG GCTATCACGG GTAACGGGCG GTTACCGTCG GACTGCCGGA GAAGGCGCCT
301 GAGAGATAGC GACTATATCC ACGGGTAGCA GCAGGCGCGA AACTTACCCA CTCGAGACTT
361 TCGGAGGTGG TAATGACCAG TTACATGTTA TCCCTTTTGG GGTATTTGTA TAGGATCGCA
421 CTTTTCCAGT GCGGTGCAAT CTAGCAGAGG GCCAGTCTGG TGCCAGCAGC TGCGGTAATT
481 CCAGCTCTGC GAGTTTGCTC CCATATTGTT GCAGTTAAAA CGCTCGTAGT CAGAATTGCC
541 TGTCAAAGGC TTGCGAACTT CTGTTCGTTC ACTGTGAACA AATCAGGACG CTTAGCGTAC
601 GGTTTTCGGG AATGACTCAG CGCAGTATGA TATCTTTACT TCTAGTAAAA TCAATGAGAG
661 CCACCGGGGG TAGATCTATT TCATGGCGAA CGGTGGAATG TTTTGACCCA TGAGAGAGAA
721 ACGAAGGCGA AAGCATCTAC CTAGAGGGTT TCTGTCGATC AAGGGCGAGA GTAGGAGTAT
781 CCAACCGGAT CAGAGACCCG GGTAGTTCCT ACCTTAAACG ATGCCGACAG GGGCTTGTCC
841 TTTCATGAGG GCAGGACCTT AGGAGAAATC ATAGTTCTTG GGCTCTGGGG GAACTACGAC
901 CGCAAGGCTG AAACTTGAAG GAATTGACGG AAGGGCACAC CAGGGGTGGA GCTTGTGGCT
961 TAATTTGAAT CAACACGGGG AAACTTACCA GGACCAGATG TTTTTTATGA CTGACAGGCT
1021 TTAGGTCTTT CAGGATATGA TTTTTGGTGG TGCATGGCCG TTGGTGGTGC GTGGGTTGAC
1081 CTGTCATGCG TTGATTCAGA TAACGAGCGA GATTATCGCC AATTAAATAC CAGGTTCTGC
1141 TTTCAGATCT ATGGTTCTAA TTGGGACTCC CTGCGTTTCA AGCAGGAGGA AGAGGGTAGC
1201 AATAACAGGT CCGTGATGTC CTTTAGATGC TCTGGGCTGC ACGCGCGCTA CAATGTTAGG
1261 ATCAATGGGA TTCTGCTGCA CCGAAAGGTT TTAGCTACTC CCACAATACC TAACGTAGTT
1321 GGGATTGAGG ATTGTAATCA TTCTCATGAA CCAGGAATCC CT
<110> 吉林大学
<120>
<140>
<160> 1
<210> 1
<211> 724
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)
<400> 1
1 AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCTCGTAGTC AGAATTGCCT GTCAAAGGCT
61 TGCGAACTTC TGTTCGTTCA CTGTGAACAA ATCAGGACGC TTAGCGTACG GTTTTCGGGA
121 ATGACTCAGC GCAGTATGAT ATCTTTACTT CTAGTAAAAT CAATGAGAGC CACCGGGGGT
181 AGATCTATTT CATGGCGAAC GGTGGAATGT TTTGACCCAT GAGAGAGAAA CGAAGGCGAA
241 AGCATCTACC TAGAGGGTTT CTGTCGATCA AGGGCGAGAG TAGGAGTATC CAACCGGATC
301 AGAGACCCGG GTAGTTCCTA CCTTAAACGA TGCCGACAGG GGCTTGTCCT TTCATGAGGG
361 CAGGACCTTA GGAGAAATCA TAGTTCTTGG GCTCTGGGGG AACTACGACC GCAAGGCTGA
421 AACTTGAAGG AATTGACGGA AGGGCACACC AGGGGTGGAG CTTGTGGCTT AATTTGAATC
481 AACACGGGGA AACTTACCAG GACCAGATGT TTTTTATGAC TGACAGGCTT TAGGTCTTTC
541 AGGATATGAT TTTTGGTGGT GCATGGCCGT TGGTGGTGCG TGGGTTGACC TGTCATGCGT
601 TGATTCAGAT AACGAGCGAG ATTATCGCCA ATTAAATACC AGGTTCTGCT TTCAGATCTA
661 TGGTTCTAAT TGGGACTCCC TGCGTTTCAA GCAGGAGGAA GAGGGTAGCA ATAACAGGTC
721 CGTG
<110> 吉林大学
<120>
<140>
<160> 1
<210> 1
<211> 1360
<212> DNA
<213>人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
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181 TGACCTCTTA CGAGGCGCGT CGTTCGACTG AGTGACCTAT CAGCTTGTAC TTAGGGTCTT
241 TACCTAGGTA GGCTATCACG GGTAACGGGC GGTTACCGTC GGACTGCCGG AGAAGGCGCC
301 TGAGAGATAG CGACTATATC CACGGGTAGC AGCAGGCGCG AAACTTTCCC ACTCGAGACT
361 TTCGGAGGAG GTAATGACCA GTTTCATGTG AAGCTTATGC TTCTGTGAAT AGGATCACAC
421 TTTTCCAGTG TGGTGAAACC TAGCAGAGGG CCAGTCTGGT GCCAGCAGCT GCGGTAATTC
481 CAGCTCTGCG AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCCCGTAGTC GGAATTGGAC
541 AGCAATGTCC CTACGTTTCA ACGTTCACTG TGAACAAATC AGGACGCTTA GAGTATGGTA
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901 ACCGCAAGGC TGAAACTTGA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC ACCAGGGGTG GAGCCTGTGG
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1261 AGATCAATAG GAAGCTAGTC TGATAGGACA TGCTACTCTT ATAATCCTTA GCGTAGTTGG
1321 GATTGATCCT TGTAATCAGG ATCATGAACC AGGAATCCCT
<110> 吉林大学
<120>
<140>
<160> 1
<210> 1
<211> 727
<212> DNA
<213>人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
1 AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCCCGTAGTC GGAATTGGAC AGCAATGTCC
61 CTACGTTTCA ACGTTCACTG TGAACAAATC AGGACGCTTA GAGTATGGTA ACAAGAATGA
121 CTCAGCGCAG TATGAAGTCT TTGTTTCTTT CGGGAAACAA GCTCAATGAG AGCCATCGGG
181 GGTGGATCTA TTTCATGGCG AGTGGTGGAA TACTTTGACC CATGAGAGAG ACACGGAGGC
241 GAAGGCGTCC ACCTAGAGGG TTTCTGTCGA TCAAGGGCGA GAGTAGGAGT ATCCAACCGG
301 ACTAGAGACC CGGGTAGTTC CTACTGTAAA CGATGCCGAC AGAGGTTTGT CATTTTATAA
361 TGGCAGAACT TTTAGAGAAA TCATAGTTCT TGGGCTCTGG GGGAACTACG ACCGCAAGGC
421 TGAAACTTGA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC ACCAGGGGTG GAGCCTGTGG CTTAATTTGA
481 ATCAACACGG GGAAGCTTAC CAGGACCAGA TGTTTTTTAT GACTGACAGG CTTCGGGTCT
541 TTCAGGATAT TGCTTTTGGT GGTGCATGGC CGTTGGTGGT GCGTGGGTTG ACCTGTCTAG
601 CGTTGATTCA GCTAACGAGC GAGATTATCG CCAATTATAT ACCTCGCATT GGCTTCAGTG
661 TTGAGGTTCT AATTGGGACT CCCTGCGATT TTAGCAGGCG GAAGAGGGTA GCAATAACAG
721 GTCCGTG
<110> 吉林大学
<120> 鼠毛滴虫nested PCR 检测试剂盒及其方法
<140>
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
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<110> 吉林大学
<120>鼠毛滴虫nested PCR 检测试剂盒及其方法
<140>
<160> 4
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
AGG GAT TCC TGG TTC AT 17
<110> 吉林大学
<120>鼠毛滴虫nested PCR 检测试剂盒及其方法
<140>
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG 20
<110> 吉林大学
<120>鼠毛滴虫nested PCR 检测试剂盒及其方法
<140>
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC 20
<110> 吉林大学
<120>
<140>
<160> 1
<210> 1
<211> 1360
<212> DNA
<213>人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
1 ACACTTCGGT CATAGATTAA GCCATGCAAG TGTTAGTTCA GGTAACGAAA CTGCGAATAG
61 CTCATTAATA CGCTCAGAAT CTATTCGACG ACAACCAACA GGTTTTAAAT GGATAGCAGC
121 AGTAACTCTG GTGCTAATAC ATGCGATTGT TTCTCCAGAA GCGAATTATG GAGGAAAAGT
181 TGACCTCTTA CGAGGCGCGT CGTTCGACTG AGTGACCTAT CAGCTTGTAC TTAGGGTCTT
241 TACCTAGGTA GGCTATCACG GGTAACGGGC GGTTACCGTC GGACTGCCGG AGAAGGCGCC
301 TGAGAGATAG CGACTATATC CACGGGTAGC AGCAGGCGCG AAACTTTCCC ACTCGAGACT
361 TTCGGAGGAG GTAATGACCA GTTTCATGTG AAGCTTATGC TTCTGTGAAT AGGATCACAC
421 TTTTCCAGTG TGGTGAAACC TAGCAGAGGG CCAGTCTGGT GCCAGCAGCT GCGGTAATTC
481 CAGCTCTGCG AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCCCGTAGTC GGAATTGGAC
541 AGCAATGTCC CTACGTTTCA ACGTTCACTG TGAACAAATC AGGACGCTTA GAGTATGGTA
601 ACAAGAATGA CTCAGCGCAG TATGAAGTCT TTGTTTCTTT CGGGAAACAA GCTCAATGAG
661 AGCCATCGGG GGTGGATCTA TTTCATGGCG AGTGGTGGAA TACTTTGACC CATGAGAGAG
721 ACACGGAGGC GAAGGCGTCC ACCTAGAGGG TTTCTGTCGA TCAAGGGCGA GAGTAGGAGT
781 ATCCAACCGG ACTAGAGACC CGGGTAGTTC CTACTGTAAA CGATGCCGAC AGAGGTTTGT
841 CATTTTATAA TGGCAGAACT TTTAGAGAAA TCATAGTTCT TGGGCTCTGG GGGAACTACG
901 ACCGCAAGGC TGAAACTTGA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC ACCAGGGGTG GAGCCTGTGG
961 CTTAATTTGA ATCAACACGG GGAAGCTTAC CAGGACCAGA TGTTTTTTAT GACTGACAGG
1021 CTTCGGGTCT TTCAGGATAT TGCTTTTGGT GGTGCATGGC CGTTGGTGGT GCGTGGGTTG
1081 ACCTGTCTAG CGTTGATTCA GCTAACGAGC GAGATTATCG CCAATTATAT ACCTCGCATT
1141 GGCTTCAGTG TTGAGGTTCT AATTGGGACT CCCTGCGATT TTAGCAGGCG GAAGAGGGTA
1201 GCAATAACAG GTCCGTGATG TCCTTTAGAT GCTCTGGGCT GCACGCGTGC TACAATGCTA
1261 AGATCAATAG GAAGCTAGTC TGATAGGACA TGCTACTCTT ATAATCCTTA GCGTAGTTGG
1321 GATTGATCCT TGTAATCAGG ATCATGAACC AGGAATCCCT
<110> 吉林大学
<120>
<140>
<160> 1
<210> 1
<211> 727
<212> DNA
<213>人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
1 AGTTTGCTCC CATATTGTTG CAGTTAAAAC GCCCGTAGTC GGAATTGGAC AGCAATGTCC
61 CTACGTTTCA ACGTTCACTG TGAACAAATC AGGACGCTTA GAGTATGGTA ACAAGAATGA
121 CTCAGCGCAG TATGAAGTCT TTGTTTCTTT CGGGAAACAA GCTCAATGAG AGCCATCGGG
181 GGTGGATCTA TTTCATGGCG AGTGGTGGAA TACTTTGACC CATGAGAGAG ACACGGAGGC
241 GAAGGCGTCC ACCTAGAGGG TTTCTGTCGA TCAAGGGCGA GAGTAGGAGT ATCCAACCGG
301 ACTAGAGACC CGGGTAGTTC CTACTGTAAA CGATGCCGAC AGAGGTTTGT CATTTTATAA
361 TGGCAGAACT TTTAGAGAAA TCATAGTTCT TGGGCTCTGG GGGAACTACG ACCGCAAGGC
421 TGAAACTTGA AGGAATTGAC GGAAGGGCAC ACCAGGGGTG GAGCCTGTGG CTTAATTTGA
481 ATCAACACGG GGAAGCTTAC CAGGACCAGA TGTTTTTTAT GACTGACAGG CTTCGGGTCT
541 TTCAGGATAT TGCTTTTGGT GGTGCATGGC CGTTGGTGGT GCGTGGGTTG ACCTGTCTAG
601 CGTTGATTCA GCTAACGAGC GAGATTATCG CCAATTATAT ACCTCGCATT GGCTTCAGTG
661 TTGAGGTTCT AATTGGGACT CCCTGCGATT TTAGCAGGCG GAAGAGGGTA GCAATAACAG
721 GTCCGTG
<110> 吉林大学
<120> 鼠毛滴虫特异nested PCR 检测试剂盒及其制备方法
<140>
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
ACA CTT CGG TCA TAG ATT AA 20
<110> 吉林大学
<120>鼠毛滴虫特异nested PCR 检测试剂盒及其制备方法
<140>
<160> 4
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
AGG GAT TCC TGG TTC AT 17
<110> 吉林大学
<120>鼠毛滴虫特异nested PCR 检测试剂盒及其制备方法
<140>
<160> 4
<210> 1
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<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG 20
<110> 吉林大学
<120>鼠毛滴虫特异nested PCR 检测试剂盒及其制备方法
<140>
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>鼠三毛滴虫(Tritrichomonas muris)、人五毛滴虫(Pentatrichomonas hominis)
<400> 1
CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC 20

Claims (2)

1.一种鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒，其特征在于是由以下材料组成：
1）PCR反应液：dNTP Mixture(2.5mM/each)，MgCl2(25mM)，10╳PCR Buffer(Mg2+free)，和灭菌ddH2O；r Taq Polymerase(5U/μl)；
2）特异nested PCR 引物(均15pM)：
第一轮PCR引物：F1：5'-ACA CTT CGG TCA TAG ATT AA-3'
F2：5'-AGG GAT TCC TGG TTC AT-3'
第二轮PCR引物：R1：5'-AGT TTG CTC CCA TAT TGT TG-3'
R2：5'-CAC GGA CCT GTT ATT GCT AC-3'
3）阳性对照：阳性对照的粪便基因组DNA 模板为鼠三毛滴虫或人五毛滴虫基因组DNA，用于比较PCR产物以及监测PCR操作过程是否正确；
4）阴性对照：阴性对照的模板为灭菌ddH2O，目的在排除反应液中的核酸污染和操作过程中的假阳性问题。
2. 如权利要求1所述的一种鼠毛滴虫nested PCR检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1) 粪便基因组DNA的提取：
使用生物公司出售的粪便基因组DNA提取试剂盒，提取鼠粪便中鼠三毛滴虫、人五毛滴虫的基因组DNA；
2）PCR 扩增：
（1）准备待检样品的PCR 反应管并分别标记，管内加入PCR 反应液，然后加入引物、基因组DNA模板和r Taq Polymerase(5U/μl)，涡旋混匀后瞬时离心后，放入PCR仪中，设置PCR反应条件；
（2）第一轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性50s、50℃退火50s、72℃延伸1min，共30个循环，后72℃延伸12min；
（3）以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性50s、50℃退火50s、72℃延伸1min，共30个循环，后72℃延伸12min；
3）PCR产物观察：
配制1.0%琼脂糖凝胶(加入浓度0.5μg/mL的E.B)，加样后100V-150V电压下电泳20-30min，之后在紫外灯或凝胶成像系统下观察实验结果，若样品第二轮在724bp或727bp大小处存在条带就证明该样品为阳性；测序判断。
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