CN101501219A - 病原体的鉴定 - Google Patents

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Abstract

公开了一种鉴定体液样品中微生物病原体的方法，其包括下述步骤：a)提供体液样品；b)裂解微生物病原体并对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，其中或其后对所扩增的核酸进行标记；c)使在b)步骤中经标记的扩增核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上包含针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18S rRNA；d)通过检测与微阵列特异性结合的经标记的扩增核酸来检测经标记的扩增核酸的一种或多种与探针的结合；和e)通过使所检测到的经标记的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定体液样品中的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18SrRNA。

Description

病原体的鉴定
技术领域
本发明涉及鉴定体液感染的病原体。
背景技术
尽管血源性感染的诊断和早期治疗在不断进步，死亡率仍旧很高。鉴定微生物的传统方法是基于血液培养物的方法，其需要具有随后的形态学和生理学表征的微生物培养(Peters等人，2004)。
不同的科学家和一些临床研究项目周期性地监测人病原体的发生频率。显示超过所有血流感染的95％仅由15种不同的属引起。葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)和埃希氏菌属(Escherichia sp.)占感染的50％以上。多样性研究在不同国家和实验室仅略微不同。而总的病原体感染率随时间是稳定的，特别的是，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)感染明显增加，并代表着唯一与死亡率上升相关的病原体(Fluit等人，2001；Kempf等人，2000；Shigei等人，1995；Meremikwu等人，2005；Vincent等人，2006)。
确定血流感染中细菌数量的第一种方法基于将全血在固体培养基上的分布、孵育以及随后通过计数群落形成单位(CFU)的评价。分离自感染有葡萄球菌和链状球菌的患者的培养物含有高至100CFU/ml血液，而经计数大肠杆菌超过1000CFU/ml。发现其他革兰氏阴性菌也具有类似的数量(Yagupsky等人，1990；Henry等人，1983)。
最近基于分子技术的出版物提出细菌计数可能比最初设想的高。使用定量RT-PCR首先确定全血中细菌数量的标准曲线用于随后确定临床样品中细菌的负载量。发现血液中肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)的密度范围为104至5.4 x 105细菌/ml。在菌血症(bacteraemia)患者中检测到其他革兰氏阳性或阴性微生物为104至107/ml的范围。Hackett甚至显示在严重败血病病例中的浓度峰值最大为1.8 x 109细菌/ml(Hackett等人，2002；van Haeften等人，2003；Massi等人，2005，)。对于培养方法和分子方法之间的差异的解释是一些微生物不能在标准培养条件下繁殖(Keer和Birch，2003)。此外，基于DNA检测的方法还包括死亡或静息细菌的未分解的基因组(Nogva等人，2000；Nikkari等人，2001)。
自动血液培养系统，例如BacT/Alert和BAC-TEC9240，是现代临床实践中的标准培养技术。几个研究显示由于不适当的生长条件导致假阴性结果周期性发生。进一步处理没有可检测的微生物生长的血液培养物，结果在3至40％的病例中(取决于检测方法)得到阳性结果(Shigei等人，1995；Kocoglu等人，2005；Karahan等人，2006)。Heininger等人(1999)证实了在前抗生素治疗的大鼠模型中PCR检测的优点。经典的血液培养物的检测率在静脉内施用头孢噻肟后25分钟内降低至10％，而那时PCR检测率仍然为100％。
常规下酵母的培养在特殊的培养瓶中进行。当用于检测假丝酵母(Candida)感染时，所提供的系统在100％的灵敏度下进行(Horvath等人，2004)。
由于其对微生物生长的需要，常规的诊断方法持续至少24小时。一般而言，检测和鉴定是一个长的过程，对大多数生物而言通常为2至5天，对难养生物而言甚至更长(Marlowe等人，2003；Reimer等人，1997；Henry等人，1983)。与之相反，基于DNA的方法满足快速、可靠从而救生诊断的需要(Belgrader等人，1999；Vincent andAbraham 2006)。然而，这些方法不适合目前血液诊断领域中特异性和灵敏度的需要。
Rivers等人(2005)强调了在加护病房(ICU)中出现菌血症的第一症状后6小时内(即在败血症转变成严重败血症之前)早期治疗的重要性。预期分子检测将替代目前用于检测血流感染的常规微生物技术。基于PCR扩增和随后的荧光探针杂交的方法似乎是最有前途的方法(Peters等人，2004)。已经对不同的分子方法(包括荧光标记探针的利用)进行改变使其适用于检测临床病原体。已经采用荧光原位杂交(FISH)、PCR、实时PCR、基于荧光的PCR单链构象多态性(SSCP)和寡核苷酸微阵列来鉴定来自菌血症患者的微生物，然而仍然包括基于培养的细菌富集步骤(Kempf V.A.J.等人，(2000)；Peters等人，2006；Mothershed E.A.和Whitney A.M.(2006)；Rantakokko-Jalava(2000)；Turenne CY.等人，(2000)；Aoki S.等人，(2003)；Martineau F.等人，(2001)；Yadaf A.K.等人，(2005)；LehnerA.等人，(2005)；Shang S.，等人，(2005))。
微阵列技术已经被描述为各种临床应用的有力工具，所述临床应用例如，尿道感染(UTI)、急性上呼吸道感染、牙周病原体和人肠道细菌的病原体鉴定。微阵列进一步应用于微生物基因表达和多样性的分析(Bryant等人，2004；Kato-Maeda等人，2001；Wang等人，2002；Roth等人，2004；Yu等人，2004)。
WO 2001/07648 A1描述了采用扩增步骤(例如PCR)的鉴定方法。微生物可以根据扩增物的长度进行分类。
US 2004/0023209 A1描述了引物延伸反应，其用于显现鉴定用的微生物序列。16S和18S rRNA可用做探针。
根据DE 197 13 556 A1，可通过短的寡核苷酸的分布来鉴定微生物。特殊的分布模式可能与某些微生物如大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草杆菌(B.subtilis)和流行性感冒杆菌(H.influenzae)有关。
总之，在日常临床生命中微生物的传统鉴定方法通常基于耗时的培养以及随后的形态学和生理学表征。血液培养方法是血源性微生物感染诊断中的金标准。然而，早期鉴定由微生物引起的感染是快速和最佳靶向感染治疗的关键必要条件。然而，不幸地是，由于需要富集微生物，这些常规诊断方法持续至少24小时。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供快速但仍然可靠的用于体液中病原体的测试，特别是那些与人败血症相关或有关(或推测有关)的病原体。此外，需要一种方法，其能区分，还优选快速追踪密切相关但病理上或生理上不同的生物物种或类型。
因此，本发明提供体液样品中微生物病原体特别是传染性病原体的鉴定方法，其包括下述步骤：
a)提供体液样品(怀疑其含有所述微生物病原体)，
b)裂解所述微生物病原体(如果存在的话)，并对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，其中或其后对所扩增的核酸进行标记，
c)使在b)步骤中经标记的扩增核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上含有针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18S rRNA，
d)通过检测与微阵列特异性结合的经标记的扩增核酸来检测经标记的扩增核酸的一种或多种与探针的结合，和
e)通过使所检测到的经标记的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定体液样品中的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18S rRNA。
在具体的实施方式中，所述微生物病原体是血流感染(例如败血症)的，且所述体液样品是血液样品。因此提供血液样品中微生物病原体的鉴定方法，其包括下述步骤：
a)提供血液样品(怀疑其含有所述微生物病原体)，
b)裂解所述微生物病原体(如果存在的话)，并对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，其中或其后对所扩增的核酸进行标记，
c)使在b)步骤中经标记的扩增核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上含有针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述血流感染的微生物病原体的16S或18S rRNA，
d)通过检测与微阵列特异性结合的经标记的扩增核酸来检测经标记的扩增核酸的一种或多种与探针的结合，和
e)通过使所检测到的经标记的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定血液样品中血流感染的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述血流感染的微生物病原体的16S或18S rRNA。
在其他优选的实施方式中，所述病原体是阴道病病原体且所述体液是阴道液。因此提供阴道液样品中阴道病的微生物病原体的鉴定方法，其包括下述步骤：
a)提供阴道液样品(怀疑其含有所述微生物病原体)，
b)裂解所述微生物病原体(如果存在的话)，并对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，其中或其后对所扩增的核酸进行标记，
c)使在b)步骤中经标记的扩增核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上含有针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述血流感染的微生物病原体的16S或18S rRNA，
d)通过检测与微阵列特异性结合的经标记的扩增核酸来检测经标记的扩增核酸的一种或多种与探针的结合，和
e)通过使所检测到的经标记的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定阴道液样品中阴道病的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述阴道病的微生物病原体的16S或18S rRNA。
在本发明提供一种用于快速鉴定血液中传染性病原体的分子方法，其结合核酸扩增与微阵列检测。根据本发明的DNA芯片包括人体液的相关病原体的寡核苷酸捕获探针，例如，在实施例部分中以完全开发的工业可应用的微芯片提供，25种不同的病原体包括革兰氏阳性球菌、肠杆菌科家族的不同属、非发酵的和临床相关的念珠菌类。
通过使用根据本发明检测的微阵列，在短时间内，例如在6小时内检测微生物是可能的，实现在属和种水平上快速诊断来自感染患者的体液的病原体并提供重要的抗生素治疗结论。细菌感染的快速诊断加速了治疗并减少了复原护理(healthcare)。所述方法的灵敏度高并已经显示在血流感染病原体的情况下降低至10细菌/ml全血(依赖于感染的物种)。
优选地，通过PCR反应对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应。所述扩增反应例如可以通过多重PCR进行，然而，根据本发明已经证明降低核酸扩增的引物数是有利的。因此，在本发明的方法中，优选用编码16S或18S rRNA的微生物DNA的通用引物对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，优选不超过8个(4个正向、4个反向)引物，更优选不超过6个(3个正向、3个反向)引物，优选不超过4个(2个正向、2个反向)引物。已经确定Seq.ID Nos.1、2、4和5所示的引物特别适用于本方法。
对于血液样品，任何来自怀疑具有所述血流病原体的患者的样品都是可用的，包括来自处理过的血液制品(例如，血液级份、血液衍生物或血液产品)的样品。根据本发明，特别优选在进行核酸扩增反应前进行初始过滤步骤，其中所述体液样品，尤其是所述血液样品通过过滤器进行过滤，所述过滤器将白细胞保留在所述体液样品中但不保留微生物病原体。通常，白细胞的排阻尺寸是11μm(直径)，而本发明鉴定的大多数(细菌)病原体的大小为2μm。因此，例如排阻尺寸为5～10μm的过滤器，优选7μm，绝对适合于过滤步骤。
到目前为止，本方法的最大应用领域是人血液样品的诊断，特别是与患有败血症或处于发展出败血症的风险中的患者相关的血液样品的诊断。然而，本方法适合测试多种样品，例如在医院人员的测试或兽医测试(例如，许多动物)中。优选地，然而，根据本发明方法的测试用于鉴定人病原体。
对于扩增期间或扩增后核酸(特别是DNA)的标记，本领域的技术人员可以利用许多方法。例如，核酸的标记可以通过下述方法进行：引物延伸、体外转录、生物素-链亲合素-标记、基于Klenow片段的等温标记(isothermal Klenow fragment based labelling)或直接核酸扩增标记，优选通过直接PCR标记。根据本发明大多数优选的标记方法是引物延伸，优选使用荧光染料(特别是Cy5)的引物延伸。该优选的实施方式显示最佳的灵敏度和特异性。
根据本发明方法的优选实施方式，在核酸扩增反应后将所述扩增的标记核酸直接应用于微阵列，无需纯化或洗涤步骤。令人吃惊地，没有纯化在产物与微阵列结合过程中并没有导致不利影响。相反，由于在与微阵列结合之前没有进一步纯化核酸，防止了产物损失。
本发明的方法可以在其实验过程中包括从血液中分离DNA、多重PCR、通过引物延伸步骤进行荧光标记(Cy5-dCTP)和随后的微阵列杂交。
优选地，根据本发明的微阵列包含针对编码16S或18S rRNA的微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA来自下述微生物病原体中的至少10种，优选至少15种，特别是至少20种：大肠杆菌(ATCC 35218，EC5，EC17，81617，68933，68307)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)(DSMZ 30053，12676)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)(26385，79232，93840，12720，74892)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(25809，85813，26385，13253)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(26785，26384，73739，26786，96633)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)(DSMZ 4595)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)(80324，73489)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 6538，ATCC 25923，ATCC29213，83799，82913，73237，12998)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(ATCC 14990，73711，35989，80320，13000，77504，79510)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(ATCC29212，EF4，81239，83776，27520)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)(DSMZ 20477)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(DSMZ 25500)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(ATCC 19615，10388)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)(26786，ATCC 14153，27761，97656，71913)、普通变形菌(Proteus vulgaris)(DSMZ 13387，80196)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(DSMZ 30121)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)(DSMZ 6675，12615)、铜绿假单胞菌(26178，12950，26535，68961，74352)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(DSMZ 50170，26394，26396)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(DSMZ 30007)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)(DSMZ 2403，75496)、抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)(DSMZ 6976)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)(DSMZ 6963)、白色假丝酵母(Candida albicans)(ATCC 10231，21179，27184，96917，96635)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(4344)。在血流感染的情况下，这些病原体特别重要。
根据优选的实施方式，根据本发明的微阵列包含下述物种的至少10个不同物种，优选至少15个不同物种，特别是至少20个不同物种的至少一种菌株：大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、克氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、奇异变形菌、普通变形菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、抗辐射不动杆菌、约氏不动杆菌、白色假丝酵母、近平滑假丝酵母。
本发明微阵列的一个优选实施方式包括多特异性的固定探针。根据本发明“多特异性的”理解为结合多种可能存在于体液样品中的微生物病原体的特异性。这意味着对多种病原体的扩增核酸而言可以得到单一探针的特异性结合。然而，鉴定对多种变形菌属(Proteus)类型(例如奇异变形菌或普通变形菌)或多种不动杆菌属(Acinetobacter)类型(例如鲍氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、抗辐射不动杆菌或约氏不动杆菌)具有特异性的核酸不认为是根据本发明“多特异性的”，只有例如特异性识别粘质沙雷氏菌和弗氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌和嗜麦芽糖寡养单胞菌，或大肠杆菌、奇异变形菌和粘质沙雷氏菌(然而每一种可能具有不同的强度)的探针被认为是根据本发明“多特异性的”。
根据本发明的微阵列优选包含在表面上作为点的探针，优选在每个点中只存在一种探针。本发明的探针是核酸分子，特别是与根据本发明所扩增的核酸结合的DNA分子，即，针对编码16S或18S rRNA的病原体微生物DNA具有特异性。优选地，所述探针与扩增核酸的一部分结合，所述部分位于扩增反应的引物序列之间，因此仅扩增扩增产物的扩增部分而非引物序列。在该实施方案中，可以排除由于探针的引物结合所引起的假阳性信号的检测风险。
优选地，根据本发明的微阵列包含至少10种，优选至少20种，更优选至少30种，特别是至少40种多特异性固定探针。根据本发明的具体实施方式，微阵列优选包含固定在微阵列上的探针总数的至少20％的多特异性探针，优选至少40％的多特异性探针，特别是至少50％的多特异性探针的部分。
根据本发明的优选微阵列包含Seq.ID Nos 6至80所示的探针中的至少5个，优选至少10个，更优选至少20个，甚至更优选至少30个，特别是至少50个。优选地，选择所述探针以呈现至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，特别是至少98％的与微芯片上的败血症相关或怀疑与其相关(通过公认的医学权威)的微生物病原体，特别是细菌病原体。
优选地，步骤e)的所述关联通过使用经标记的核酸与固定在微阵列表面上的多特异性探针结合的信息来进行。该关联可以通过计算机分析来进行。例如，通过使用加权错配的推测杂交模式来进行步骤e)的关联已经证明给出了本发明测试的极好结果。开发了提供统计学评价程序的原型软件，允许在属水平上100％以及在种水平上96％的正确率。该自学软件(如在本发明的实施例部分所描述的)可以在提供有病原体鉴定微阵列的全自动分析平台上执行。
根据另一方面，本发明涉及如上定义的微阵列。微阵列(通常也称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片)是显微镜可见的DNA点的集合，所述点贴附于固体表面(例如玻璃、塑料或硅芯片)形成用于表达谱目的的阵列，同时监测大量扩增核酸的水平。可以使用不同技术来制作微阵列，包括用尖头针在玻璃片上印刷，使用预先做好的掩模的光刻法，使用动力微镜设备的光刻法，喷墨印刷，或微电极阵列上的电化学法。微阵列包含大量固定的寡核苷酸分子，其在固体载体上以高密度提供。微阵列是以单一检测步骤检测数十、数百或甚至数千不同的根据本发明的扩增产物的高度有效的工具。所述微阵列通常在特别的微量滴定板中以玻片或刻板提供。在本领域现状中，微阵列即可以定义为结合位点的微型化排列(即，材料，载体)也可以定义为包含微型化结合位点的载体(即，阵列)。这两种定义都可应用于本发明的实施方式。对于这些定义的第一种，本发明优选的实施方式是本发明寡核苷酸在微阵列中的微型化排列。在确保以高密度固定在固体载体上的印刷设备的帮助下，所述寡核苷酸分子优选固定在微阵列上。该微阵列在分析大量样品时是特别有用的。根据本发明的微阵列通常指在表面的规定位置上以有序模式固定有探针的平面。
根据备选实施方案，本发明提供体液样品中微生物病原体的鉴定方法，其包括下述步骤：
a)提供体液样品(怀疑其含有所述微生物病原体)，
b)裂解所述微生物病原体(如果存在的话)，并对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，
c)使在b)步骤中所扩增的核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上含有针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18S rRNA，
d)使用检测扩增核酸与固定探针的结合事件的微阵列装置，通过检测与微阵列特异性结合的扩增核酸来检测扩增核酸的一种或多种与探针的结合，和
e)通过使所检测到的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定体液样品中的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的编码16S或18S rRNA。
根据本发明的这种特异性备选方法，不需要标记扩增核酸，通过微阵列上特异性探针的杂交信号来检测结合事件。根据本领域可利用的常规技术，可以将其安排在微阵列上，使得可以分析每种探针或探针的点是否产生了特异性结合(杂交)信号。在该特异性实施方式中，本发明的微阵列包含其他工具或设备，以检测与微阵列表面上的探针或指定区域特异性结合的信号。这些设备包括计算机接口，例如以图示法使结合事件可见，使得芯片(微阵列)上的结合事件可有效地相关联以给出在本发明的步骤e)下合理的分析结果。
尤其是，在血流感染的情况下，提供血液样品中血流感染的微生物病原体的鉴定方法，其包括下述步骤：
a)提供血液样品(怀疑其含有所述微生物病原体)，
b)裂解所述微生物病原体(如果存在的话)并对编码16S或18SrRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，
c)使在b)步骤中所扩增的核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上含有针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述血流感染的微生物病原体的16S或18S rRNA，
d)使用检测扩增核酸与固定探针的结合事件的微阵列装置，通过检测与微阵列特异性结合的扩增核酸来检测扩增核酸的一种或多种与探针的结合，和
e)通过使所检测到的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定血液样品中血流感染的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述血流感染的微生物病原体的16S或18SrRNA。
在另一方法，本发明提供阴道液样品中阴道病(也称为阴道炎)的微生物病原体的鉴定方法，其包括下述步骤：
a)提供阴道液样品(怀疑其含有所述微生物病原体)，
b)裂解所述微生物病原体(如果存在的话)并对编码16S或18SrRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，
c)使在b)步骤中所扩增的核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上含有针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述阴道病的微生物病原体的16S或18S rRNA，
d)使用检测扩增核酸与固定探针的结合事件的微阵列装置，通过检测与微阵列特异性结合的扩增核酸来检测扩增核酸的一种或多种与探针的结合，和
e)通过使所检测到的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定血液样品中血流感染的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述阴道病的微生物病原体的16S或18S rRNA。
优选待鉴定的阴道病病原体选自阴道加德纳氏菌(Gardnerellavaginalis)、阿托波氏菌属(Atopobium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)和拟杆菌属(Bacteroides)。尤其是，固定探针选自下表4的SEQ IDNOs 81至138。
健康的阴道通常含有许多微生物，常见的一些是卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)和詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)。乳杆菌属(Lactobacillus)，特别是产生过氧化氢的物种，表现出帮助防止其他阴道微生物繁殖到引起症状的水平。涉及细菌性阴道病的微生物是非常多样化的，但总是伴随有标志物种之一，所述标志物种为阴道加德纳氏菌、阿托波氏菌属、动弯杆菌属和拟杆菌属。可能由抗生素的使用或pH不平衡引起的正常细菌丛的改变，包括乳杆菌属减少，允许具有更强抗性的细菌获得据点并繁殖。随即这些细菌产生影响身体自然防御并使健康细菌更难再移殖的毒素。
在其他人病原体中，阴道病标记物种的存在可以通过使用DNA微阵列进行检测，所述微阵列由物种特异性以及多特异性探针组成，所述多特异性探针在杂交后得到特征的信号模式。基于所述的统计学方法对杂交信号模式的评价允许明显辨别感染物种以及标记物种。如本文所述实现数据库的创建，其由分位数标准化信号强度和单一杂交的统计学分析组成(Sha等人(2005)J.Clon.Microbiol.，43，4607-4612，Donders等人(1998)N.Eng1.J.Med.，338，1548，Donders(1999)Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod.Bio1.，83，1-4，Donders(1999)Infect.Dis.Obstet.Gynecol.，7，126-127)。
根据另一实施方式，本发明涉及测试试剂盒，其包括：用于血液样品的样品夹持工具(a sample holding means)、根据本发明的微阵列和任选地根据本发明进行扩增反应的引物。例如，根据本发明的测试试剂盒可以包括对扩增如上定义的病原体的编码16S和18S rRNA的微生物DNA具有特异性的引物。
根据另一实施方式，本发明还涉及根据本发明的阵列的用途或根据本发明的测试试剂盒，其用于鉴定血液样品中血流感染的微生物病原体，特别用于监测败血症患者或处于发展出败血症的风险中的患者的血液。
在本发明所有方面的优选实施方式中(包括所述微阵列用于本发明方法的用途)，例如，通过PCR和/或标记，例如，通过引物延伸的扩增用选自下述的聚合酶来进行：栖热菌属(Thermus)的种(例如，水生栖热菌(Thermus aquaticus)、黄栖热菌(Thermus flavus)或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus))聚合酶，例如Taq聚合酶I，特别是
Figure A200780029365D0019102129QIETU
或
Figure A200780029365D0019102132QIETU
 DNA聚合酶。用这两种优化的聚合酶得到特别例外的结果。FirePol是热稳定的聚合酶并类似于具有3′向5′核酸外切酶活性的Taq DNA聚合酶I(98％的同源性)。与Taq聚合酶I相比，优选聚合酶的温度抗性增加，优选增加至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或更多，和/或具有3′向5′核酸外切酶活性和/或没有5′向3′核酸外切酶活性。特异性聚合酶例如描述于EP 0745676 A1或US 5079352中。所述反应进一步优选在pH为7和9之间，特别优选大于8，最优选在约8.5，例如8.2～8.7之间进行。Mg(例如以MgCl2形式)，例如可以以0.5mM～5mM之间，优选在1mM和3mM之间，最优选约为1.5mM的浓度存在于聚合酶反应中。
在另一方面，本发明提供病原体的鉴定方法，其包括：
a)提供所检测到的结合事件的信号数据矩阵，所述结合事件为病原体的核苷酸材料与对病原体具有特异性的探针的结合事件，
b)对该矩阵进行分位数标准化，
c)通过k-最近邻(k-nearest neighbour)(KNN)方法对信号数据进行分类。
使用KNN算法，所述信号数据通过其临近数据的多数票来进行分类，使所述信号被归类在其k个最近邻中最共同的类，如Ripley(1996)＂Pattern Recognition and Neural Networks＂，Cambridge和Venables等人(2002)，＂Modern Applied Statistic with S.＂，4th Ed.，Springer；Quantile Normalization was performedaccording to Bolstad等人，Bioinformatics 19(2)(2003)，185-193所述。优选k为1，所述信号被简单地归类为其最近邻那一类。
尤其是，所述矩阵包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18或20种病原体的数据。优选，对每一种待检测的病原体，使用至少1种探针来产生信号。然而，还可以对每一病原体使用多种不同探针，例如2、3、4、5、6、7、8、10种或更多。换句话说，在所述矩阵中存在结合事件的至少两种信号数据。尤其是，如果使用多种探针，在所述方法，特别是分类步骤中使用检测每种病原体的探针的信号数据的中值。所述分类器(classifier)优选在步骤d)中通过交叉验证法，特别是通过留一(leave-one-out)法进行验证。交叉验证是将数据矩阵划分到子集中的统计学实践，使得所述分析最初在单一子集上进行，而保留其他子集随后用于确认和验证最初分析。矩阵的初始子集被称为训练集而其他子集被称为验证集或测试集。所述留一法包括使用来自所述矩阵的单一信号数据作为验证数据，和剩下的信号作为训练数据。对其进行重复，使得样品中每一种信号数据都被用作验证数据一次。
优选地，所述病原体的核酸材料是DNA或RNA，特别是16S rRNA或18S rRNA。
优选地，所述结合事件包括多特异性探针的数据，所述多特异性探针结合两种或多种病原体，优选血流感染的病原体或阴道液病原体。
通过下述附图和实施例对本发明进行进一步说明，但不对其进行限制。
附图说明
图1显示系统树，其基于通过邻近相连法计算的在最新开发的微阵列上显现的微生物的16S和18S rRNA序列分析。
图2显示推测所设计的微阵列探针的杂交行为的矩阵(水平绘制)。错配的范围用颜色进行编码。初始文件包括约19.000个物种。图2B显示图2的图例：加权错配的色键。
图3显示由探针和物种所列出的所有杂交实验的正常信号强度。首先使用分位数标准化对原始信号值进行标准化，然后对重复点和重复杂交进行平均(为了更清楚呈现，将真实值除以1000)。5001-10000、10001-20000、和>20001的经背景校正的杂交信号，分别以黄色、橙色和红色表示。低于5000的标准化值没有用颜色进行调配。对于计算，使用绝对值无需限定引起低信号指示的阈值，甚至当GenePix软件将信号标记为负时。根据16S和18S rRNA序列的亲缘关系列出物种。通过物种特异性对探针进行分类。探针名称的缩写列于表3中。
图4显示来自细菌细胞培养物的稀释系列的PCR产物，其溶于1.5％的琼脂糖胶中。从103细菌/试验的初始计数开始可以检测出条带。
图5显示最低稀释步骤的图，其中可以检测到微阵列上的阳性信号。所述稀释系列由来自大肠杆菌(图5A)和金黄色葡萄球菌(图5B)的纯培养物制成。大肠杆菌(检出限：10细菌/试验)显示比金黄色葡萄球菌(检出限：103细菌/试验)低得多的检出限。红色、蓝色和黄色条代表特异性和非特异性信号以及阳性对照(BSrev为杂交对照，和pr_FW和pr_FW T7为PCR扩增对照)。标记的靶衍生自图4所示的PCR产物。
图6显示病原体的不同平行鉴定的比较。在分级群聚后绘制热图(Heatmap)。将每种靶组合与在等价的实验条件下的单一培养物的杂交结果进行比较。排对应于探针且柱对应于杂交。颜色对应于信号值。使得蓝色显示高的信号值和红色显示无信号值。
图7显示分离自全血的大肠杆菌的杂交信号。虽然血液中存在人DNA的大背景，但没有观察到干扰(蓝色显示非特异性信号)。特异性信号显示为红色的条并且阳性对照显示为黄色的条。
图8显示从掺入大肠杆菌和奇异变形菌的血液中分离细菌DNA，模拟多微生物感染。探针名称的缩写列于表3。红色、蓝色和黄色的条代表特异性和非特异性信号以及阳性对照。
图9显示分位数标准化的影响。
图10显示分级群聚后以热图表示的所有杂交实验的结果。柱对应于探针，排对应于杂交。颜色对应于信号值。不同实验的变化系数与标准化信号值的表一起给出。由于eco2探针的假阴性信号聚集大肠杆菌靶的一种杂交结果而与其他分离。然而，在鉴定过程中，这可通过秩变换和k最近邻法避免，其仍给出正确结果。显示杂交的所述排可以被归类到所检测到的微生物(从上到下)：大肠杆菌(35次)、克氏柠檬酸杆菌(8次)、白色假丝酵母(8次)、近平滑假丝酵母(4次)、白色假丝酵母(2次)、大肠杆菌(1次)、嗜麦芽窄食单孢菌(7次)、铜绿假单胞菌(11次)、金黄色葡萄球菌(20次)、表皮葡萄球菌(12次)、化脓链球菌(10次)、肺炎链球菌(5次)、产酸克雷伯氏菌(10次)、阴沟肠杆菌(11次)、肺炎克雷伯氏菌(4次)、产气肠杆菌(11次)、肺炎克雷伯氏菌(8次)、摩氏摩根菌(6次)、弗氏柠檬酸杆菌(9次)、粘质沙雷氏菌(5次)、肺炎克雷伯氏菌(2次)、奇异变形菌(9次)、普通变形菌(4次)、奇异变形菌(4次)、普通变形菌(1次)、奇异变形菌(2次)、普通变形菌(1次)、奇异变形菌(1次)、粪肠球菌(12次)、屎肠球菌(3次)、鲁氏不动杆菌(3次)、约氏不动杆菌(3次)、鲁氏不动杆菌(1次)、鲍氏不动杆菌(3次)、抗辐射不动杆菌(4次)、鲍氏不动杆菌(1次)。
实施例
实施例1：样品-参考株
在本研究中测试的所有参考菌株来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)或＂Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkultur＂(DSMZ)。除了参考菌株外，还用临床分离物测试了探针特异性和灵敏度，所述分离物已经通过经典微生物方法进行鉴定。对于长时间保存，在-80℃下以50％的甘油储液保存所有的细菌株。对大多数实验而言，使用一定数量细菌/ml的纯培养物，其通过于37℃下在Caso肉汤中培养各种微生物过夜，并最后使用Mc Farlandstandard # 0.5调节微生物浓度/ml来得到。对下述细菌进行微阵列测试：大肠杆菌(ATCC 35218，EC5，EC17，81617，68933，68307)、产气肠杆菌(DSMZ 30053，12676)、阴沟肠杆菌(26385，79232，93840，12720，74892)、肺炎克雷伯氏菌(25809，85813，26385，13253)、产酸克雷伯氏菌(26785，26384，73739，26786，96633)、克氏柠檬酸杆菌(DSMZ 4595)、弗氏柠檬酸杆菌(80324，73489)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538，ATCC 25923，ATCC 29213，83799，82913，73237，12998)、表皮葡萄球菌(ATCC 14990，73711，35989，80320，13000，77504，79510)、粪肠球菌(ATCC 29212，EF4，81239，83776，27520)、屎肠球菌(DSMZ 20477)、肺炎链球菌(DSMZ 25500)、化脓链球菌(ATCC 19615，10388)、奇异变形菌(26786，ATCC 14153，27761，97656，71913)、普通变形菌(DSMZ 13387，80196)、粘质沙雷氏菌(DSMZ 30121)、摩氏摩根菌(DSMZ 6675，12615)、铜绿假单胞菌(26178，12950，26535，68961，74352)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(DSMZ 50170，26394，26396)、鲍氏不动杆菌(DSMZ 30007)、鲁氏不动杆菌(DSMZ 2403，75496)、抗辐射不动杆菌(DSMZ 6976)、约氏不动杆菌(DSMZ 6963)、白色假丝酵母(ATCC 10231，21179，27184，96917，96635)、近平滑假丝酵母(4344)。
实施例2：寡核苷酸探针的设计
用ARB软件包进行探针设计和分析(Ludwig等人，2004)。从NCBI主页(www.ncbi.nlm.ni-h.gov)的GenBank下载所选择的病原体细菌和酵母的核糖体DNA(rDNA)序列，并将其上载到ARB软件包以创建包括超过27,000个16S rDNA序列同时也超过7,000个18S rDNA序列的数据库以检测与真核序列的可能错配。
在将新序列与预先存在的数据库进行比对后，使用邻近相连法计算系统树(参见图1)。
使用探针设计函数(包括可变参数设定，例如探针长度(20个碱基)、最大非组命中率(maximum non group hits)、G+C含量、解链温度和最小发夹环)，根据ARB软件的结果，设计物种和所选属的探针。
用软件＂Oligo＂测试探针序列的双链和发夹的形成以及解链温度。在其解链温度下，首先通过删除或添加碱基来改变不配对的序列。
用ARB中的探针配对函数检查最终探针序列。生物序列与任何单一探针配对产生的每一个杂交表用作CalcOligo(www.calcoligo.org)的输入信息，CalcOligo为用于加权错配计算的软件。根据实验确定的公式对错配进行加权(参见表1和表2)。
表1：与序列中错配位置相关的错配加权。在第一位置的单一错配加权为0.3，而在中心位置的错配最高加权为1.2。
5′→3′位
Figure A200780029365D00241
表2：由于错配碱基类型引起的错配加权。探针上腺嘌呤与靶序列上胞嘧啶的错配加权为0.4，而相同探针与靶序列中的鸟嘌呤的错配加权为1.2。
对每种探针的单一错配进行加和以产生每一个物种的总加权值。排列这些值以产生杂交矩阵，然后在电子数据表中列表(关于该杂交矩阵的最终结果，参见图2)。
由于假丝酵母属的临床相关性，也考虑将它们用于检测，例外地用它们的18S rRNA序列。所述树(参见图1)进一步显示革兰氏阳性球菌属(cocci sp.)和革兰氏阴性细菌的明显差异。肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族的成员在树的顶部形成一个孤立的组，表示与其他物种没有关系以及强的内部序列类似度。在该组中，单一物种彼此紧密相关，使得充分鉴定属于该组的细菌相对困难。
探针序列
基于几个在ARB数据库中挑选的个别序列为所选物种设计探针。使用arb软件包设计所有96种不同的DNA探针的全部。从probeBase网站(www.microbial-ecology.net/probebase/)下载其他探针(LoyA.等人，2003)。用于该研究的rDNA探针列于表3和4中。
表3：在血流病原体研究中使用的探针的列表，包括其核苷酸序列和一些特征。缩写：Ab：不动杆菌属、Cb：柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、Eb：肠杆菌属(Enterobacter)、Ec：肠球菌属、E：埃希氏菌属、K：克雷伯氏菌属(Klebsiella)、M：摩根菌属、P：变形菌属、Pm：假单胞菌属、Sr：沙雷氏菌属、Sm：寡养单胞菌属、Str：链球菌属、Sta：葡萄球菌属、C：假丝酵母属
 
特异性 名称 E.coliPos.  序列[5′-3′] 长度(碱基) Tm(℃) GC-含量％ SEQIDNo.  
鲍氏不动杆菌 aba1 64 CAAGCTACCTTCCCCCGCT 19 60.3 63 6
aba2 453 GTAACGTCCACTATCTCTAGGTATTAACTAAAGTAG                 36 59.1 36 7
aba4 1132 GCAGTATCCTTAAAGTTCCCATCCGAAAT                        29 60.8 41 8
约氏不动杆菌 ajo2 620 TCCCAGTATCGAATGCAATTCCTAAGTT                         28 60.1 39 9
ajo3 979 GAAAGTTCTTACTATGTCAAGACCAGGTAAG                      31 58.8 39 10
ajo4 1114 CTTAACCCGCTGGCAAATAAGGAAAA 26 60 42 11
鲁氏不动杆菌 a1w1 133 GAGATGTTGTCCCCCACTAATAGGC 25 60.4 52 12
a1w2 577 TGACTTAATTGGCCACCTACGCG 23 61 52 13
a1w3 637 CCCATACTCTAGCCAACCAGTATCG 25 59.9 52 14
 
特异性 名称 E.coliPos.  序列[5′-3′] 长度(碱基) Tm(℃) GC-含量％ SEQ IDNo.  
抗辐射不动杆菌 ara1 78 CGCTGAATCCAGTAGCAAGCTAC 23 59.1 52 15
ara2 450 GTCCACTATCCTAAAGTATTAATCTAGGTAGCCT                   34 60.3 38 16
ara3 1115 CCGAAGTGCTGGCAAATAAGGAAA 24 59.8 46 17
弗氏柠檬酸杆菌 cif1 62 GCTCCTCTGCTACCGTTCG 19 58.2 63 18
cif2 442 CCACAACGCCTTCCTCCTCG 20 61.1 65 19
cif3 472 TCTGCGAGTAACGTCAATCGCTG 23 60.7 52 20
克氏柠檬酸杆菌 cik1 469 CGGGTAACGTCAATTGCTGTGG 22 59.9 55 21
cik2 639 CGAGACTCAAGCCTGCCAGTAT 22 60 55 22
阴沟肠杆菌 ec14 471 GCGGGTAACGTCAATTGCTGC 21 60.6 57 23
ec16 643 CTACAAGACTCCAGCCTGCCA 21 60 57 24
ec17 652 TACCCCCCTCTACAAGACTCCA 22 60 55 25
产气肠杆菌 ena2 444 GGTTATTAACCTTAACGCCTTCCTCCT                          27 60.2 44 26
ena3 453 CAATCGCCAAGGTTATTAACCTTAACGC                         28 60.4 43 27
ena4 473 TCTGCGAGTAACGTCAATCGCC 22 60.8 55 28
肺炎克雷伯氏菌 kpn1 61 GCTCTCTGTGCTACCGCTCG 20 60.7 65 29
kpn2 203 GCATGAGGCCCGAAGGTC 18 58.9 67 30
产酸克雷伯氏菌 k1o1 81 TCGTCACCCGAGAGCAAGC 19 60.5 63 31
k1o2 633 CCAGCCTGCCAGTTTCGAATG 21 60 57 32
大肠杆菌 eco2 448 GTAACGTCAATGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCCCTTCC             40 61.9 40 33
eco3 994 CCGAAGGCACATTCTCATCTCTGAAAACTTCCGTGGATG              39 65.6 49 34
摩氏摩根菌 mom2 121 GCCATCAGGCAGATCCCCATAC 22 60.9 59 35
mom3 440 CTTGACACCTTCCTCCCGACT 21 59.7 57 36
mom4 581 CATCTGACTCAATCAACCGCCTG 23 59.4 52 37
奇异变形菌 pmi3 247 GTCAGCCTTTACCCCACCTACTAG 24 59.8 54 38
pmi4 444 GGGTATTAACCTTATCACCTTCCTCCC                          27 60 48 39
pmi5 625 CCAACCAGTTTCAGATGCAATTCCC 25 60.4 48 40
pmi6 820 GTTCAAGACCACAACCTCTAAATCGAC                          27 59.3 44 41
普通变形菌 pvu2 179 CTGCTTTGGTCCGTAGACGTCA 22 60.3 55 42
pvu4 1010 TTCCCGAAGGCACTCCTCTATCTCTA 26 61.9 50 43
 
特异性 名称 E.coliPos.  序列[5′-3′] 长度(碱基) Tm(℃) GC-含量％ SEQ IDNo.  
Pm.aerogenes psa4 585 GATTTCACATCCAACTTGCTGAACCA 26 59.9 42 44
psa5 1136 TCTCCTTAGAGTGCCCACCCG 21 61.7 62 45
psa6 1245 CGTGGTAACCGTCCCCCTTG 20 61 65 46
粘质沙雷氏菌 sem1 62 CTCCCCTGTGCTACCGCTC 19 60.4 68 47
sem2 439 CACCACCTTCCTCCTCGCTG 20 60.7 65 48
sem3 460 GAGTAACGTCAATTGATGAGCGTATTAAGC                       30 59.8 40 49
嗜麦芽糖寡养单胞菌           sma1 713 AGCTGCCTTCGCCATGGATGTTC 23 63.7 57 50
sma3 1265 TGGGATTGGCTTACCGTCGC 20 61 60 51
肺炎链球菌 spn1 56 CTCCTCCTTCAGCGTTCTACTTGC 24 60.7 54 52
spn3 201 GGTCCATCTGGTAGTGATGCAAGTG 25 60.9 52 53
spn5 634 TCTTGCACTCAAGTTAAACAGTTTCCAAAG                       30 60.1 37 54
化脓链球菌 spy1 175 ATTACTAACATGCGTTAGTCTCTCTTATGCG                      31 60.2 39 55
spy2 471 CTGGTTAGTTACCGTCACTTGGTGG 25 60.8 52 56
spy3 623 TTCTCCAGTTTCCAAAGCGTACATTG 26 59.6 42 57
屎肠球菌 efa1 67 CAAGCTCCGGTGGAAAAAGAAGC 23 60.3 52 58
efa2 208 CATCCATCAGCGACACCCGA 20 60.4 60 59
efa3 1240 ACTTCGCAACTCGTTGTACTTCCC 24 60.8 50 60
efa42 446 CCGTCAAGGGATGAACAGTTACTCTCATCCTTGTTCTTC              39 66.8 46 61
efa43 1242 ATTAGCTTAGCCTCGCGACTTCGCAACTCGTTGTACTTC              39 69.3 49 62
efa51 65 CTCCGGTGGAAAAAGAAGCGT 21 59 52 63
efa52 82 CTCCCGGTGGAGCAAG 16 57 52 64
葡萄球菌 sta1 995 CTCTATCTCTAGAGCGGTCAAAGGAT 26 59 46 65
sta2 1137 CAGTCAACCTAGAGTGCCCAACT 23 60 52 66
sta3 1237 AGCTGCCCTTTGTATTGTCCATT 23 59 44 67
sta4 1264 ATGGGATTTGCATGACCTCGCG 22 62 55 68
金黄色葡萄球菌 sar1 186 CCGTCTTTCACTTTTGAACCATGC 24 59 46 69
sar2 230 AGCTAATGCAGCGCGGATC 19 59 58 70
sar3 447 TGCACAGTTACTTACACATATGTTCTT                          27 57 33 71
表皮葡萄球菌 sep1 1005 AAGGGGAAAACTCTATCTCTAGAGGG 26 59 46 72
 
特异性 名称 E.coliPos.  序列[5′-3′] 长度(碱基) Tm(℃) GC-含量％ SEQ IDNo.  
sep2 983 GGGTCAGAGGATGTCAAGATTTGG 24 59 50 73
sep3 993 ATCTCTAGAGGGGTCAGAGGATGT 24 60 50 74
粪肠球菌 efc1 84 CCACTCCTCTTTCCAATTGAGTGCA 24 61 50 75
efc2 176 GCCATGCGGCATAAACTGTTATGC 24 61 50 76
efc3 193 CCCGAAAGCGCCTTTCACTCTT 22 62 55 77
efc4 452 GGACGTTCAGTTACTAACGTCCTTG 25 59 48 78
白色假丝酵母 call - CCAGCGAGTATAAGCCTTGGCC 22 61.2 59 79
近平滑假丝酵母 cpa1 - TAGCCTTTTTGGCGAACCAGG 21 60.6 52 80
表4：在阴道病研究中使用的探针的列表，包括核苷酸序列和一些特征：
 
特异性 名称 E.coliPos.  序列[5′-3′] 长度(碱基) Tm(℃) GC(％) SEQ IDNo.  
Atopobium vaginae ava1 136 CUUUGCACUGGGAUAGCCUCGGG 23 61 60.9 81
ava2 434 GCUUUCAGCAGGGACGAGGC 20 61.2 65 82
ava3 837 AGAUUAUACUUUCCGUGCCGCAGC 24 59.4 50 83
拟杆菌属 bac1 145 CGGGGAUAGCCUUUCGAAAGAAAGA 25 58.7 48 84
bac2 601 UUGUGAAAGUUUGCGGCUCAACCGU 25 61.1 48 85
bac3 1155 GACUGCCGUCGUAAGAUGUGAGG 23 59.6 56.5 86
加德纳菌 gva1 153 UCUUGGAAACGGGUGGUAAUGCUGG 25 61.1 52 87
毛滴虫 gva2 434 GCUUUUGAUUGGGAGCAAGCCUUUUG 26 59.5 46.2 88
gva3 988 UUGACAUGUGCCUGACGACUGCA 22 61.2 52.2 89
阴沟肠杆菌 ec14 471 GCGGGTAACGTCAATTGCTGC 21 60.6 57 90
ec16 643 CTACAAGACTCCAGCCTGCCA 21 60 57 91
ec17 652 TACCCCCCTCTACAAGACTCCA 22 60 55 92
产气肠杆菌 ena2 444 GGTTATTAACCTTAACGCCTTCCTCCT 27 60.2 44 93
ena3 453 CAATCGCCAAGGTTATTAACCTTAACGC 28 60.4 43 94
ena4 473 TCTGCGAGTAACGTCAATCGCC 22 60.8 55 95
肺炎克雷伯氏菌 kpn1 61 GCTCTCTGTGCTACCGCTCG 20 60.7 65 96
kpn2 203 GCATGAGGCCCGAAGGTC 18 58.9 67 97
产酸克雷伯氏菌 k1o1 81 TCGTCACCCGAGAGCAAGC 19 60.5 63 98
k1o2 633 CCAGCCTGCCAGTTTCGAATG 21 60 57 99
大肠杆菌 eco2 448 GTAACGTCAATGAGCAAAGGTATTAACTTTACTCCC                             36 60 38.9 100
eco3 994 CCGAAGGCACATTCTCATCTCTGAAAA 27 59.2 48.8 101
 
特异性 名称 E.coliPos.  序列[5′-3′] 长度(碱基) Tm(℃) GC(％) SEQ IDNo.   
动弯杆菌属 mob1 298 GAGGGUGGUCGGUCGCACU 19 62.3 68.4 102
mob2 586 GCGUCUGUCGUGAAAGCCAGC 21 61.3 61.9 103
mob3 821 GGAACUAGGUGUGGGGAUGCUAUC 24 59 54.2 104
Pm.aerogenes psa4 585 GATTTCACATCCAACTTGCTGAACCA 26 59.9 42 105
psa5 1136 TCTCCTTAGAGTGCCCACCCG 21 61.7 62 106
psa6 1245 CGTGGTAACCGTCCCCCTTG 20 61 65 107
粘质沙雷氏菌 sem1 62 CTCCCCTGTGCTACCGCTC 19 60.4 68 108
sem2 439 CACCACCTTCCTCCTCGCTG 20 60.7 65 109
sem3 460 GAGTAACGTCAATTGATGAGCGTATTAAGC 30 59.8 40 110
嗜麦芽糖寡养单胞菌               sma1 713 AGCTGCCTTCGCCATGGATGTTC 23 63.7 57 111
sma3 1265 TGGGATTGGCTTACCGTCGC 20 61 60 112
肺炎链球菌 spn1 56 CTCCTCCTTCAGCGTTCTACTTGC 24 60.7 54 113
spn3 201 GGTCCATCTGGTAGTGATGCAAGTG 25 60.9 52 114
spn5 634 TCTTGCACTCAAGTTAAACAGTTTCCAAAG 30 60.1 37 115
屎肠球菌 efa1 67 CAAGCTCCGGTGGAAAAAGAAGC 23 60.3 52 116
efa2 208 CATCCATCAGCGACACCCGA 20 60.4 60 117
efa3 1240 ACTTCGCAACTCGTTGTACTTCCC 24 60.8 50 118
efa42 446 CCGTCAAGGGATGAACAGTTACTCTCATCCTTGTTCTTC                          39 66.8 46 119
efa43 1242 ATTAGCTTAGCCTCGCGACTTCGCAACTCGTTGTACTTC                          39 69.3 49 120
efa51 65 CTCCGGTGGAAAAAGAAGCGT 21 59 52 121
efa52 82 CTCCCGGTGGAGCAAG 16 57 52 122
葡萄球菌 sta1 995 CTCTATCTCTAGAGCGGTCAAAGGAT 26 59 46 123
sta2 1137 CAGTCAACCTAGAGTGCCCAACT 23 60 52 124
sta3 1237 AGCTGCCCTTTGTATTGTCCATT 23 59 44 125
sta4 1264 ATGGGATTTGCATGACCTCGCG 22 62 55 126
金黄葡萄球菌 sar1 186 CCGTCTTTCACTTTTGAACCATGC 24 59 46 127
sar2 230 AGCTAATGCAGCGCGGATC 19 59 58 128
sar3 447 TGCACAGTTACTTACACATATGTTCTT 27 57 33 129
表皮葡萄球菌 sep1 1005 AAGGGGAAAACTCTATCTCTAGAGGG 26 59 46 130
sep2 983 GGGTCAGAGGATGTCAAGATTTGG 24 59 50 131
sep3 993 ATCTCTAGAGGGGTCAGAGGATGT 24 60 50 132
粪肠球菌 efc1 84 CCACTCCTCTTTCCAATTGAGTGCA 24 61 50 133
efc2 176 GCCATGCGGCATAAACTGTTATGC 24 61 50 134
 
特异性 名称 E.coliPos.  序列[5′-3′] 长度(碱基) Tm(℃) GC(％) SEQ IDNo.  
efc3 193 CCCGAAAGCGCCTTTCACTCTT 22 62 55 135
efc4 452 GGACGTTCAGTTACTAACGTCCTTG 25 59 48 136
白色假丝酵母 cal1 - CCAGCGAGTATAAGCCTTGGCC 22 61.2 59 137
近平滑假丝酵母 cpa1 - TAGCCTTTTTGGCGAACCAGG 21 60.6 52 138
实施例3：微阵列的制备
寡核苷酸探针来自VBC Genomics(奥地利)。在每一个寡核苷酸的5′端加入5个胸腺嘧啶残基作为间隔分子。为了确保与微阵列表面(CSS-100 Silylated Slides，Cel Associates，USA)上反应性醛基团的共价连接，探针为5′氨基修饰的。通过接触式排列仪(contactarrayer)(Omnigrid，GeneMachines)，以不同浓度(在3x SSC和1.5M一水合甜菜碱中50μM，20μM和10μM)将探针印刷到硅烷化的载玻片上，同时调节空气湿度为55和60％之间。
每个微阵列印刷每种探针的6个副本。用SMP3针(TeleChem，USA)进行点样，得到100μm直径的点大小。
实施例4：靶的制备
DNA分离
通过无菌抽取到10ml K3E小管(BD Vacutainer Systems，UK)中采集血液样品。将细菌掺入到血液中，通过使用McFarland standard# 0.5调节合适的密度，并转移该恰当体积或稀释到10ml全血中。为了分离白细胞，进行过滤步骤。细菌透过过滤器。如果不进行过滤，备选地应用下述Percoll步骤。对于最初的血细胞裂解，加入3mlTris-EDTA，pH 8(10mM Tris，1mM EDTA)，混合并在10000g下离心10分钟。重复该步骤以获得重悬浮于生理NaCl中的小丸粒并小心转移至Percoll(Amersham Biosciences)溶液的顶部。根据制造商的说明书，将Percoll的物理密度调节至1.05g/cm3。在1500g下进行密度离心20分钟。弃去上清液并用生理NaCl洗涤丸粒以除去残余的Percoll。剩下的丸粒重悬浮于50μl的蒸馏水中，并通过将悬浮液加热至95℃持续15分钟来完成细胞裂解。通过在10000g下离心10分钟得到DNA悬浮液，并将上清液转移到新的小管中。
DNA扩增
使用正向引物27 T7(5′-TAATACGACTCACTATAGAGAGTTTGATCMTGGCTCAG；SEQ ID No.1)和反相引物1492(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT；SEQ IDNo.2)(VBC Genomics，Austria)(在PCR混合物中0.3nM)对16S rRNA基因进行PCR扩增(Gutenberger等人，1991)。在其5′端含有T7启动子位点的正向引物(5′-TAATACGACTCACTATAG-3′；SEQID NO.3)，其使用PCR产物作为不同标记方法直接比较的模板实现T7RNA聚合酶对体外转录的介导(Bodrossy等人，2003)。通过用引物CanFW(5′-TCCGCAGGTTCACCTAC；SEQ ID No.4)和CanRev(5′-CAAGTCTGGTGC CAGCA；SEQ ID No.5)预先扩增18S rRNA基因来鉴定假丝酵母物种(White等人，1990)。
在10ml全血中的细菌用作优化产生全长16S rRNA扩增子的靶scenario。用分离自1ml血液的细菌DNA，通过变化不同组分的浓度并加入PCR增强子来优化PCR的效率。对于25μl PCR反应混合物的优化条件为：3 U Taq DNA聚合酶(Invitrogen，California)、2.5μl 10x PCR-缓冲溶液、2mM MgCl2、10％甘油和0.5％甜菜碱。
备选应用的PCR Mastermixes为：1.25U 
Figure A200780029365D0031102804QIETU
 DNA聚合酶(
Figure A200780029365D0031102804QIETU
 Flexi DNA-聚合酶，Promega Corporation)、1mM MgCL2、5μl 5x GoTaq-PCR-缓冲溶液、最终PCR浓度为0.5mM的每一种dNTP(ATP、GTP、CTP和TTP)和各自在PCR中的最终PCR-浓度为0.3nM的正向-和反向-引物。还备选的Mastermix为：1.25U 
Figure A200780029365D0031102827QIETU
 DNA聚合酶I(Solis Biodyne)、2mM MgCL2、2.5μl 10x GoTaq-PCR-缓冲溶液、最终PCR浓度为0.5mM的每一种dNTP(ATP、GTP、CTP和TTP)和各自在PCR中的最终PCR-浓度为0.15nM的正向-和反向-引物。
PCR循环包括在95℃下持续5分钟的初始变性步骤，然后40个在95℃下持续30秒、在55℃下持续1分钟和在72℃下持续1分钟的循环。温度循环中止于在72℃下持续10分钟，然后在4℃下储存直到下一次使用。
成功的扩增通过将PCR产物溶于1.5％琼脂糖胶(SeaKem，Biozym)来证实，所述琼脂糖胶含有溶于TBE缓冲溶液(0.1M Tris，90mM硼酸，1mM EDTA)的溴化乙锭(Invitrogen，UK)。
扩增产物可以直接标记或在引物延伸PCR中标记。
对于直接标记步骤，可以使用6nmol Cy5-dCTP(AmershamBiosciences，UK)或使用0.3nM Cy3 5′端标记引物/反应混合物。
标记
对不同的标记方案(例如引物延伸、体外转录、生物素-链亲合素-标记、基于Klenow片段的等温标记，或使用5′端标记的引物的直接PCR标记)进行优化和比较。无需PCR产物的纯化也可以获得好的结果。引物延伸的方法显示好的灵敏度和特异性，并因此用作标准方法。在引物延伸反应混合物中使用6μl的PCR产物用于标记，其含有0.9mM正向引物27、1.5 U Vent(exo)聚合酶(New England Biolabs，UK)、3mM MgSO4和50μM的dATP、dGTP、dTTP、dCTP以及25μMCy5-dCTP。所述反应混合物循环25次于95℃、60℃和72℃下各20秒，然后在72℃下进行最终延伸步骤5分钟。在进行温度循环之前于95℃下孵育3分钟。
实施例5：杂交
在杂交之前，所述微阵列玻片在室温下用封闭缓冲溶液(氰硼氢化物缓冲溶液：20mM Na2HPO4，10mM NaH2PO4，200mM NaCl，50mMNaBH3CN)预处理30分钟，以使玻片表面上的反应基团失活。
将杂交混合物调节到在24μl的经扩增和标记的DNA反应混合物中4 x SSC、0.1％ SDS的终浓度。将22μl的总体积转移到盖玻片上(22x 22mm)并将其施用到微阵列表面。在65℃下，在饱和蒸汽室中实现杂交1小时。在2 x SSC和0.1％ SDS中洗涤玻片5分钟，然后在0.2 x SSC中洗涤2分钟并在0.1 x SSC中洗涤1分钟。通过在900g下离心2分钟来干燥玻片。
实施例6：信号检测和数据分析
对于每一个玻片，在相同的光电倍增器(650pmt)的激光功率和灵敏度水平下，用Axon Genepix 4000A微阵列扫描仪器(Axon，USA)在10μm的分辨率下扫描玻片。因此，可以直接比较独立实验的绝对和相对信号强度。使用Genepix软件分析所获得的图象并将所得的gpr-文件用于进一步分析。
统计学评价
在R(www.r-project.org)中使用limma、affy、stats和class软件包进行数据分析。数据集由在病原体鉴定微阵列的3种不同布局(layout)上的241杂交组成。不同的布局共享76种探针；在分析中使用这些。忽略所有其他探针。每一种病原体由不同序列的2-5种不同探针表示。为了增加牢固度，每种探针在阵列上点样6次。
每一种杂交由一个gpr文件表示，所有的gpr文件在R中共同储存为RGList对象。使用来自affy软件包的分位数标准化对信号进行标准化。将6个重复点的中值用于监视型(supervised)k-最近邻(k＝1)分类法。在留一交叉验证法中验证分类器。(根据Ripley(1996)＂Pattern Recognition and Neural Networks＂，Cambridge andVenables等人(2002)，＂Modern Applied Statistic with S.＂，4thEd.，Springer进行KNN；根据Bolstad等人，Bioin-formatics 19(2)(2003)，185-193进行分位数标准化)
标准化
标准化是所有微阵列试验的一个重要方面。通常，其需要一组探针，所述探针预期在所有杂交中给出恒定信号。在本组实验中，这是不可行的。因此，基于这样一个假定(即，每个阵列应该具有许多给出阳性信号(对应于样品中存在病原体)的探针且其余的探针给出低信号(或没有)信号)，来选择分位数标准化方法。该算法是阵列间的标准化方法，所述方法通过用所有阵列的最高信号的平均值来代替每个阵列的最高信号，然后通过用所有第二高信号的平均值来代替第二高信号等。在致密区中，通过推移每一个致密区以匹配所有阵列的平均密度。
实施例7：电脑模拟杂交矩阵
用ARB软件包和CalcOligo软件中的探针匹配函数(Probe Matchfunction)来产生杂交矩阵。每种探针的模型杂交行为(图2)良好地与真实的实验数据符合。
由于每个成员高度保守的16S rRNA序列，可预期肠杆菌科家族中的交叉杂交，其导致在预测的杂交矩阵中引起强的群聚(clustering)。其他物种的探针应该导致特异性信号。尤其是，预期革兰氏阳性物种给出物种特异性信号。与此相反，在柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属组中的革兰氏阴性菌显示较低的特异性杂交。
然而，甚至这些个别物种最终也能被来自多种探针的多特异性信号模式鉴定。毫无疑问所有其他革兰氏阴性菌将在物种水平上被区分。假丝酵母属的18S rRNA探针对细菌物种没有显示非特异性信号并在物种间提供良好的区分。预测的杂交值可以通过实验数据验证。
实施例8：特异性
在图3中总结了241个杂交实验的标准化信号值。观察到的杂交值在6个重复点中和在不同试验中显示低的变异系数(CV)。所有特异性信号的CV对于80％的探针而言为2.4％～64.1％。实验结果与由ARB和CalcOligo软件预测的杂交行为密切相关(与图2的比较显示类似的杂交强度)。如根据CalcOligo分析所预期的，个别探针的交叉杂交发生在肠杆菌科家族内，特别是在克雷伯氏菌属-肠杆菌属-柠檬酸杆菌属的组中。然而，特异性信号模式可被归属到每一个物种，实现物种水平上的培养物鉴定。
实施例9：灵敏度
用掺杂的血液样品和纯培养物(使用从108～100细菌/ml的稀释系列，所述细菌来自所选的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌物种)来评估细菌检出限(LOD)。由于血液成分的PCR干扰，在纯培养物中的检出限比掺杂血液中的低。发现由纯培养物进行PCR来扩增DNA(低至103细胞/试验)，在1.5％琼脂糖胶上得到明显可见的条带(参见图4)。
基于微阵列的鉴定比所证实的琼脂糖胶评价灵敏100倍。对于大肠杆菌，可以获得特异性和可繁殖的信号低至10细菌/试验。分析葡萄球菌培养物显示在革兰氏阳性菌组中最高的检出限为必需约103细胞/试验才能在微阵列上看到信号(参见图5)。灵敏度的差异可以归因于效率较低的细胞裂解，其由持久的细胞壁的存在或葡萄球菌蛋白组学中热稳定DNAse的存在引起(Heininger等人，2004)。然而，所述工具的预期用途要求快速和可靠的方法，其迫切要求时间、适用性和灵敏度之间的折衷。该方案通过采用不同的细胞裂解步骤或额外的酶处理能进一步改善检出限。
实施例10：病原体的平行检测
如实施例4所述调节细菌悬浮液密度，并将等量的悬浮液加入到单一物种和两个物种实验中。将不同株的组合的杂交结果与单一株的杂交结果比较。显示在相同的细菌负载下，信号强度是类似的，与单一物种或多个物种的组合无关。多种微生物试验产生显示单一物种杂交的复合信号的信号模式(参见图6)。由于这些结果，在多种微生物感染中明显区分物种是可能的。基于掺杂血液进行一些实验，证实了纯培养物的结果(图8)。
实施例11：血液样品分离物的杂交
用分离自血液样品的细菌DNA来优化PCR和标记方案以降低血液组分的干扰。虽然存在大量残留的人DNA，甘油和甜菜碱的加入降低PCR和标记步骤中的非特异性扩增。通过这种方式，特异性PCR产物的产率还明显增加，导致与培养的微生物相当的特异性。观察到由人DNA引起的非交叉-杂交(图7)。如上面已经描述的，通过检测模拟多种微生物感染的单一微生物的组合得到类似结果。所获得的信号模式对于所加入的菌株具有与来自单一微阵列杂交的那些一样的特异性(图8)。
通过提供在10ml掺杂血液中的10倍稀释系列来确定该方法的灵敏度。发现检出限在全血样品中低至10细菌/ml。然而，如用纯培养物观察到的，革兰氏阳性菌的灵敏度高得多，例如，对于金黄色葡萄球菌而言为105/ml血液。
实施例12：假丝酵母
存在于微阵列上的微生物探针包括四种靶向18S rRNA基因的假丝酵母属特异性探针。图3已经显示了与细菌靶序列的低交叉-杂交，表明假丝酵母探针极高的特异性。白色假丝酵母靶的非特异性信号应答获自鲁氏不动杆菌探针。近平滑假丝酵母显示与spn3探针的低杂交，所述探针对肺炎链球菌具有特异性。以类似的灵敏度水平，还将细菌的优化方案应用于假丝酵母属。为了优化两个引物对的PCR，16SrRNA引物的浓度应该是相对于18S rRNA引物的三倍。
实施例13：分类
图9显示杂交以及探针的明显的簇(cluster)。虽然每种探针被设计为与一种特异性病原体结合，热图显示一些探针非常特异于一个物种而其他探针产生较宽范围的不同生物的信号，且一些探针完全不显示任何特异性信号。经典的方法将是评价所有杂交的每种探针集并确定信号阀值，例如通过ROC分析(Bilban等人，2002)以区分正信号和负信号。然而，由于一些探针在物种间或甚至在属间显示交叉-杂交，这不仅引起特异性问题，还意味着在交叉-杂交模式中包含的信息的损失。通过与已知生物杂交的类似性，使用机器改进方法(amachine learning approach)对杂交模式进行分类。使用k-最近邻(k＝1)方法并在留一交叉-验证法中进行验证。在属水平上，所有241个杂交被正确分类且96.7％的杂交在种水平上正确分类。
结论性说明
所陈述的鉴定血源性病原体的微阵列是第一分子诊断工具，其能鉴定宽范围的临床相关细菌和酵母，所述细菌和酵母直接来自合适时间内的血液。
PCR扩增与微阵列杂交的结合呈现了强有力的病原体鉴定工具。其在速度上优于常规技术，且在极高的特异性下进行。在实现比表型方法更强，重复性更高，和更准确的测试之前已经报道了16S rRNA基因的分析(Clarridge，2004)。
arb软件包分析超过27.000个序列，以计算所选物种的杂交行为。预测值和实验值显示高的相关性。平行于16S rRNA靶向探针对23SrRNA基因进行测试。由于较大的序列数据库，相对于23S rRNA更偏好16S rRNA基因。
通过在标记前引入DNA扩增步骤来增强灵敏度。扩增和标记方案的选择对灵敏度具有高的影响，虽然仅引起特异性的微小变化。微阵列的杂交导致灵敏度比直接扩增的靶检测高约100倍。
标准的临床鉴定方法需要2天并且对于难培养的微生物高至5天。基于微阵列的系统实现微生物快速和准确的鉴定。本方案从取血样到分析软件显示结果在6小时内完成。毛细管PCR或微型PCR设备大大降低目前约为2.5小时的PCR循环时间，所述设备允许PCR在不到20分钟内完成。
基于DNA的方法实现对静息细胞或甚至基因组降解前的死细胞的检测，例如在施用抗生素的情况下，当没有观察到培养物中进一步生长时(Heininger等人，1999)。
应用supervised k-最近邻(k＝1)分类法，在属水平上正确识别所有测试的细菌和酵母以及在种水平上正确识别96％的细菌和酵母。在奇异变形菌和普通变形菌以及抗辐射不动杆菌和鲍氏不动杆菌情况下，高的16S rDNA序列类似性引起误分类。
到目前为止，大多数公布的方法仅识别肠杆菌科家族或不同革兰氏阳性属(如葡萄状球菌和链球菌)的从属(affiliation)。此外，还没有公布同时鉴定细菌和酵母的技术(Shang等人，2005；Jordan等人，2005；Kempf等人，2000；Jansen等人，2000；Jordan and Durso，2005)。
所有血流感染的7％为多种微生物的(Henry等人，1983)。多种微生物的信号模式可以根据单一微生物信号来解释。信号强度与单一感染的强度相等。探针板对所有随机选择的双细菌组合具有特异性。未掺杂的血液的阴性对照给出阴性PCR扩增和杂交结果。这证实在健康人血液中不存在多形性细菌或细菌DNA(McLaughlin等人，2002；Nikkari等人，2001)。
来自纯培养物的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检出限分别为101和103细菌/测试。其他细菌物种的检出限(LOD)为102和103之间。显示来自纯培养物的灵敏度较高的公布数据，通常基于DNA浓度的稀释以及扩增小得多的靶序列，其只提供确定细菌存在的可能(Wilson等人，2002)。
对于掺杂的血液，发现本发明的方案和微阵列的LOD为10～105细菌/ml血液。然而，与纯的培养物相比，掺杂的血液样品较高的LOD可能由血液中的PCR抑制成分引起(A1-Soud等人，2000，2001)。额外的DNA纯化能降低这些抑制剂的量，但高含量的残留DNA仍然导致难以获得较低的LOD。
公布的大多数基于微阵列技术的鉴定方法，没有对LOD进行估计。对血液样品灵敏度的说明通常基于PCR和RT-PCR实验。此处LOD范围为40～2000 CFU/ml掺杂血液，尽管考虑静息细菌可能增加这些数量。对于标准的16S rRNA PCR，大肠杆菌的LOD为104/ml血液，金黄色葡萄球菌的LOD为105/ml血液。然而，这些试验仅在于证实血液中存在细菌而不是鉴定(Jordan and Durso，2005；Heininger等人，2004)。
可以将有希望增加强度并进一步降低微阵列分析LOD的不同方法应用于该测试。例如，已经提议使用连续和不连续的旋转微反应室(Vanderhoeven等人，2005；Peplies等人，2003；Liu等人，2001；Francois等人，2003)。
建立用作应用统计方法的分类器的数据库。评价执行模式识别和及其改进算法。k-最近邻法在完全自动的平台内完成准确鉴定。此外，软件包正在开发中，其包括连续添加单一探针、个别物种、物种组或甚至整个分类器的交换的机动性。因为降低了由假阴性信号或交叉杂交引起的误译的可能性(特别是对于变形菌和不动杆菌物种)，分类器的扩大通过添加进一步杂交结果来来增加鉴定特异性。所述软件将允许全自动处理来自genepix软件的gpr文件并将找回属和种名。
此外，根据对周期性更新的抗生素抗性信息的统计学评估来推荐合适的抗生素治疗。
在本实施例中，一种基于DNA鉴定临床相关病原体的快速和灵敏的方法，所述病原体引起血流感染。由于本结果，该微阵列的灵敏度是能在低至10细菌/ml的浓度下鉴定病原体。根据信号模式的分析，所述特异性在属水平上确定为100％，在种水平上高于96％。这显示基于16S rRNA标记基因的鉴定工具展示为一个用于常规临床实验的有力方法。与标准方法相比，使用血液培养物，可以在6小时内进行微阵列鉴定，且还考虑了多微生物感染。此外，可识别的生物的数量能容易地通过新病原体得到延伸。
本发明优选的实施方式提供多特异性探针，其特异性地鉴定Enteroceae家族内1个以上的物种，特别是特异性鉴定肠杆菌属、克雷伯氏菌属和柠檬酸杆菌属的探针。
序列表
<110>Austrian Research Centers GmbH-ARC
<120>病原体的鉴定
<130>R 50322
<150>AT A 1148/2006
<151>2006-07-05
<160>80
<170>PatentIn version 3.3
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Claims (32)

1.体液样品中微生物病原体的鉴定方法，其包括下述步骤：
a)提供体液样品，
b)裂解所述微生物病原体并对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，其中或其后对所扩增的核酸进行标记，
c)使在b)步骤中经标记的扩增核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上含有针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18S rRNA，
d)通过检测与微阵列特异性结合的经标记的扩增核酸来检测经标记的扩增核酸的一种或多种与探针的结合，和
e)通过使所检测到的经标记的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定体液样品中的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18S rRNA。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于通过PCR反应对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行所述核酸扩增反应。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于用编码16S或18S rRNA的微生物DNA的通用引物对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行所述核酸扩增反应，所述通用引物优选不超过8个(4个正向、4个反向)引物，更优选不超过6个(3个正向、3个反向)引物，优选不超过4个(2个正向、2个反向)引物。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于用Seq.ID Nos.1、2、4和5所示的引物，优选用或DNA聚合酶对编码16S或18S rRNA的微生物DNA进行所述核酸扩增反应。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于在步骤a)和步骤b)之间进行过滤步骤，其中所述样品通过过滤器进行过滤，所述过滤器将白细胞保留在所述体液样品，优选血液样品中但不保留微生物病原体。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于所述微生物病原体是人病原体。
7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于所述核酸的标记过程通过引物延伸、体外转录、生物素-链亲合素-标记、基于Klenow片段的等温标记或直接核酸扩增标记，优选通过直接PCR标记来进行。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于在核酸扩增反应后将所述扩增的标记核酸直接应用于微阵列，无需纯化或洗涤步骤。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于所述微阵列包含针对编码16S或18S rRNA的微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA来自下述微生物病原体中的至少10种，优选至少15种，特别是至少20种：大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC 35218，EC5，EC17，81617，68933，68307)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)(DSMZ 30053，12676)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)(26385，79232，93840，12720，74892)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(25809，85813，26385，13253)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(26785，26384，73739，26786，96633)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)(DSMZ 4595)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)(80324，73489)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(ATCC 6538，ATCC25923，ATCC 29213，83799，82913，73237，12998)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(ATCC 14990，73711，35989，80320，13000，77504，79510)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(ATCC29212，EF4，81239，83776，27520)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)(DSMZ 20477)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(DSMZ25500)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(ATCC 19615，10388)、奇异变形菌(Proteus mirabilis)(26786，ATCC 14153，27761，97656，71913)、普通变形菌(Proteus vulgaris)(DSMZ 13387，80196)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)(DSMZ 30121)、摩氏摩根菌(Morganella morganii)(DSMZ 6675，12615)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(26178，12950，26535，68961，74352)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(DSMZ 50170，26394，26396)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)(DSMZ30007)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)(DSMZ 2403，75496)、抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)(DSMZ 6976)、约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)(DSMZ 6963)、白色假丝酵母(Candida a lbicans)(ATCC 10231，21179，27184，96917，96635)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)(4344)。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于所述微阵列包含下列物种中的至少10个不同物种，优选至少15个不同物种，特别是至少20个不同物种的至少一种菌株：大肠杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、克氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、奇异变形菌、普通变形菌、粘质沙雷氏菌、摩氏摩根菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽糖寡养单胞菌、鲍氏不动杆菌、鲁氏不动杆菌、抗辐射不动杆菌、约氏不动杆菌、白色假丝酵母、近平滑假丝酵母。
11.根据权利要求1-10中任一项的方法，其特征在于所述微阵列包含多特异性的固定探针。
12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其特征在于所述微阵列包含至少10种，优选至少20种，更优选至少30种，特别是至少40种多特异性的固定探针。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其特征在于至少20％，优选至少40％，特别是至少50％固定在微阵列上的探针是多特异性探针。
14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其特征在于步骤e)的所述关联通过使用经标记的核酸与固定在微阵列表面上的多特异性探针结合的信息来进行。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于步骤e)的所述关联通过使用加权错配的推测杂交模式来进行。
16.根据权利要求1-15中任一项的方法，其特征在于所述微阵列包含Seq.ID Nos 6至80所示的探针中的至少5种，优选至少10种，更优选至少20种，甚至更优选至少30种，特别是至少50种。
17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其特征在于选择微阵列上的探针以呈现至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，特别是至少98％的与败血症相关或怀疑与其相关的微生物病原体，特别是细菌病原体。
18.根据权利要求1-17中任一项的方法，其特征在于所述微生物病原体是血流感染的且所述体液样品是血液样品。
19.根据权利要求1-16中任一项的方法，其特征在于所述病原体是阴道病病原体，并且所述体液样品是阴道液样品。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于所述微阵列包含Seq.IDNos 81至138所示的探针中的至少5种，优选至少10种，更优选至少20种，甚至更优选至少30种，特别是至少50种。
21.根据权利要求19或20的方法，其特征在于所述微阵列包含针对编码16S或18S rRNA的微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA来自下述微生物病原体中的至少1种，优选至少2种，特别是至少3种：阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、阿托波氏菌属(Atopobium)、动弯杆菌属(Mobiluncus)和拟杆菌属(Bacteroides)。
22.体液样品中微生物病原体的鉴定方法，其包括下述步骤：
a)提供体液样品(怀疑其含有所述微生物病原体)，
b)裂解所述微生物病原体(如果存在的话)，并对编码16S或18SrRNA的微生物DNA进行核酸扩增反应，
c)使b)步骤的扩增核酸与微阵列接触，所述微阵列在微阵列表面的规定区域上含有针对微生物DNA的固定探针，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18S rRNA，
d)使用检测扩增核酸与固定探针的结合事件的微阵列装置，通过检测与微阵列特异性结合的扩增核酸来检测扩增核酸的一种或多种与探针的结合，和
e)通过使所检测到的扩增核酸的结合与针对微生物DNA的固定探针的规定区域相关联来鉴定体液样品中的微生物病原体，所述微生物DNA编码来自所述微生物病原体的16S或18S rRNA。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于应用如权利要求2-21中任一项所定义的具体实施方式，除了应用未标记的核酸代替经标记的扩增核酸之外。
24.如权利要求1和9-23中任一项所定义的微阵列。
25.测试试剂盒，其包括：用于血液样品的样品夹持工具、根据权利要求24的微阵列、和任选地如权利要求1-4中任一项所定义的引物。
26.根据权利要求25的测试试剂盒，其特征在于其包含针对扩增如权利要求1、9、10、18、19或21中任一项所定义的病原体的编码16S和18S rRNA的微生物DNA具有特异性的引物。
27.根据权利要求24的微阵列或者根据权利要求25或26的测试试剂盒的用途，取决于权利要求18，用于鉴定血液样品中血流感染的微生物病原体，特别用于监测败血症患者或处于发展出败血症的风险中的患者的血液。
28.根据权利要求24的微阵列或者根据权利要求25或26的测试试剂盒的用途，取决于权利要求19，用于鉴定阴道液样品中阴道病的微生物病原体。
29.病原体的鉴定方法，其包括：
a)提供所检测到的结合事件的信号数据矩阵，所述结合事件为病原体的核苷酸材料，优选病原体的DNA或RNA，特别是16S rRNA或18SrRNA与对病原体具有特异性的探针的结合事件，
b)对该矩阵进行分位数标准化，
c)通过k-最近邻算法对信号数据进行分类，其中优选k＝1。
30.根据权利要求29的方法，其特征在于所述矩阵包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18或20种病原体的信号数据。
31.根据权利要求29或20的方法，其特征在于在矩阵中存在结合事件的至少两种信号数据，优选3、4、5或6种。
32.根据权利要求29-31中任一项的方法，其特征在于所述分类在步骤d)中通过交叉验证方法，特别是通过留一法进行验证。
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