KR102279821B1 - 패혈증 원인균 검출용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 패혈증 원인균을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 패혈증 원인균 검출용 조성물, 키트, 검출방법 내지 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트 또는 검출용 조성물 내지 정보제공방법에 대한 것이다.
본 발명의 패혈증 원인균 검출용 조성물을 이용하는 경우 신속하고 높은 민감도로서 패혈증 주요 원인균을 검출할 수 있는데, 특히, 디지털 PCR 용도로 사용하는 경우 일반적인 TaqMan PCR 또는 혈액 배양(blood culture)에 비하여 높은 민감도 및 특이도를 제공할 수 있다. 또한 임상적으로도 활용 가능하며 배양단계 없이 패혈증 의심 환자의 혈액에서 바로 패혈증 원인균 관련 유전자를 검출할 수 있으므로 패혈증 진단 또는 예후 예측을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

패혈증 원인균 검출용 조성물 및 이의 용도 {Composition for detecting pathogen of sepsis and uses thereof}
본 발명은 패혈증 원인균을 검출할 수 있는 프라이머 세트를 포함하는 패혈증 원인균 검출용 조성물, 키트, 검출방법 내지 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물, 키트 또는 검출용 조성물 내지 정보제공방법에 대한 것이다.
박테리아 혈류 감염(Bacterial bloodstream infection, BSI)은 생명을 위협하는 상태이며 여전히 전 세계 주요 의료 문제 중 하나이다. 대부분의 BSI를 유발하는 그람 음성균은 높은 이환율과 사망률을 유발하는 가장 흔한 유기체이며, 항균성 내성을 일으킨다. BSI로 인해 발생할 수 있는 패혈증은 BSI에 민감한 기저 질환 또는 증상을 앓는 입원 환자, 또는 화상, 외상 또는 수술 환자들에게서 가장 흔하게 나타난다. 한국에서 패혈증 발병률은 10만명 당 347명으로, 이는 심근경색의 3배, 뇌졸중의 1.5배이며, 사망률은 31%(심근경색 및 뇌졸중 사망률 9%)에 이르는 치명적인 질환이다. 특히 전세계 5세 미만 영유아 사망원인의 60%, 한국내 '집중치료시설(intensive care unit; ICU)' 내 사망원인의 1위이며, 북미, 호주, 유럽 등지에서 패혈증 사망률은 20% 수준인데 비해 한국 내 패혈증 사망률은 31%로 다소 높다.
패혈증 환자의 임상 결과를 개선하기 위해서는 원인균의 신속하고 정확한 식별이 필수적인데, 현재 혈류 병원균을 식별하기 위한 황금 표준은 혈액 배양(blood culture)이다. 자동화된 혈액 배양 시스템이 도입됨에 따라 더욱 빠르고 효과적으로 원인균을 식별할 수 있게 되었다. 그러나 최근까지도 원인균을 식별하고 최종 감수성 결과를 얻는 데 일반적으로 5일 이상, 최소 24시간 이상이 소요되며, 이로 인해 불필요한 넓은 스펙트럼의 항생제 또는 적절한 항생제 투여 지연이 불가피한 실정이다.
최근 3 세대 PCR 플랫폼이라 불리는 디지털 PCR(digital PCR, dPCR)이 개발되었는데, 이는 기존의 PCR 기반 도구보다 감도가 훨씬 높으며 다양한 원인균 및 항균성 내성 유전자를 검출하는 데 사용되고 있다. 그러나, 항균제 저항성 유전자를 갖는 그람 음성 원인균을 유발하는 주요 패혈증을 커버하거나 이들의 다중 검출을 가능하게 하는 dPCR 시스템은 없었다. 약물 내성 그람 음성균의 유병률이 증가함에 따라, BSI를 성공적으로 관리하기 위해서는 이들을 효율적으로 식별하는 것이 중요하다.
대한민국 공개특허 제10-2017-0003403호는 디지털 PCR을 이용한 식중독균의 검출 방법에 대한 것으로서, 실시간 PCR보다 높은 감수성으로 식중독균을 검출할 수 있도록 디지털 PCR에 사용할 수 있는 프라이머 세트를 제공한다.
다만, 패혈증을 일으키는 주요 원인균 내지 상기 원인균에 항균제 내성 유전자를 검출, 특히 다중 검출할 수 있는 디지털 PCR에 대한 연구 내지 기재는 개시된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 패혈증을 일으키는 주요 원인균을 빠르고 민감하게 검출할 수 있는 PCR 시스템을 제공하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 프라이머 세트, 개체의 무세포 DNA를 사용하는 다중 디지털 PCR 시스템의 경우 약 3시간 만에 배양단계 없이 환자의 혈액에서 직접 주요 패혈증 원인균을 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 패혈증 원인균 검출용 조성물 및 이의 다양한 용도를 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제1프라이머 세트;
서열번호 4 의 염기서열 및 서열번호 5 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제2프라이머 세트;
서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제3프라이머 세트;
서열번호 10 의 염기서열 및 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제4프라이머 세트; 및
서열번호 13 의 염기서열 및 서열번호 14 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제5프라이머 세트;
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 패혈증 원인균 검출용 조성물 내지 이를 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 패혈증 원인균은 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 시겔라 소이네(Shigella sonnei), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물의 검출한계는 1 ag/㎕ 내지 500 fg/㎕ 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 제1프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제2프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 6 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제3프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제4프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 12 의 염기서열을 포함하는 프로브; 및
제5프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 15 의 염기서열을 포함하는 프로브; 를 포함하는 것이다.
본 발명은 또한, 상기 패혈증 원인균 검출용 조성물 내지 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 패혈증 원인균 검출용 키트 내지 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명은 또한, i) 패혈증 의심 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 무세포 DNA(cell free DNA)를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 무세포 DNA와 상기 제1항의 조성물을 이용하여 패혈증 원인균을 검출하는 단계;
를 포함하는 패혈증 원인균 검출방법 내지 패혈증 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 i)의 생물학적 시료는 혈액, 소변, 뇌척수액 및 타액 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 혈액은 개체의 중앙 혈관(central vessels) 또는 말초 혈관(peripheral vessels)으로부터 수득된 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 검출은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 검출하는 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 패혈증 원인균 검출용 조성물을 이용하는 경우 신속하고 높은 민감도로서 패혈증 주요 원인균을 검출할 수 있는데, 특히, 디지털 PCR 용도로 사용하는 경우 일반적인 TaqMan PCR 또는 혈액 배양(blood culture)에 비하여 높은 민감도 및 특이도를 제공할 수 있다. 또한 임상적으로도 활용 가능하며 배양단계 없이 패혈증 의심 환자의 혈액에서 바로 패혈증 원인균 관련 유전자를 검출할 수 있으므로 패혈증 진단 또는 예후 예측을 위해 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 표적별 단일 디지털 PCR(singleplex digital PCR)의 산점도를 나타낸다. (A) ompA 프라이머-VIC 프로브 세트(x-축, 적색)에 의해 특이적으로 검출된 A. baumannii 표준 균주(ATCC 19606); (B) ecfX 프라이머-FAM 프로브 세트(y-축, 청색)에 의해 검출된 P. aeruginosa 표준 균주(ATCC 27853); (C) phoE 프라이머 -VIC 프로브 세트(x-축, 적색)에 의해 검출된 K. pneumoniae 표준 균주(KCTC 12385); (D 및 E) uidA 프라이머-VIC(x-축, 적색) 및 lacY 프라이머-FAM(y-축, 청색) 프로브 세트에 의해 검출된 E. coli 표준 균주(ATCC 25922); (F 및 G) S. sonnei 표준 균주(ATCC 19585)는 uidA 양성이지만 lacY 음성이었다. 산점도의 노란색 점은 대상별 신호를 나타내지 않는다.
도 2는 단일 디지털 PCR(singleplex digital PCR)에 의한 항균제 내성 유전자의 표적 특이적 식별 결과를 나타낸다. (A 및 B) blaTEM 프라이머-VIC(x-축, 적색) 및 blaCTX-M 그룹 1 프라이머-FAM 프로브 세트(y-축, 청색)에 의해 특이적으로 검출된 blaTEM 및 blaCTX-M-15 유전자 E. coli 분리체, cm241; (C) P. aeruginosa 분리체 cmPA-1로부터의 blaIMP-type 프라이머-FAM 프로브 세트(y-축, 청색)에 의해 검출된 blaIMP-type 유전자; (D) E. coli 분리체 cmEC-1로부터 blaNDM-1 프라이머-VIC 프로브 세트(x-축, 적색)에 의해 검출된 blaNDM-1; (E 및 F) E. coli 분리체 cm66에서 blaTEM 유전자가 검출되었지만, blaCTX-M 그룹 1 유전자는 검출되지 않았다.
도 3은 A. baumannii의 검출 한계를 나타낸다. (A) X-축은 dPCR에 의한 A. baumannii 특이적 ompA 프라이머-VIC 프로브 신호의 적색 형광 진폭을 나타낸다; (B) A. baumannii(ATCC 19606)로부터 단리된 50pg/㎕, 500fg/㎕, 5fg/㎕의 DNA를 사용하는 TaqMan qPCR 증폭 곡선을 나타낸다.
도 4는 디지털 PCR에 의한 표적 유전자의 이중 식별을 나타낸다. (A) E. coli 표준 균주 (ATCC 25922)로부터 이중(duplex) 조건에서 특이적으로 확인된 uidA(x-축, 적색) 및 lacY(y-축, 청색) 유전자; (B) P. aeruginosa 및 K. pneumonia의 DNA 혼합물로부터 동정된 ecfX(y-축, 청색) 및 phoE(x-축, 적색) 유전자; (C) A. baumannii와 P. aeruginosa의 DNA 혼합물로부터 확인된 ompA(x-축, 적색) 및 ecfX(y-축, 청색) 유전자; (D) E. coli 분리체 cm241로부터 동정된 blaTEM-type(x-축, 적색) 및 blaCTX-M 그룹 1(y-축, 청색) 유전자; (E) P. aeruginosa cmPA-1 및 E. coli cmEC-1 분리체의 DNA 혼합물로부터 확인된 blaIMP-type(y-축, 청색) 및 blaNDM-1(x-축, 적색) 유전자.
도 5는 이중 디지털 PCR(duplex digital PCR)에 의한 패혈증 환자의 혈액에서 그람 음성 원인균의 검출 결과를 나타낸다. (A) 18-C 샘플로부터 이중 dPCR에 의해 검출된 E. coli 특이 유전자, uidA(x-축, 적색) 및 lacY(y-축, 청색); (B) 6-C 샘플로부터 ecfX(y-축, 청색) 및 phoE(x-축, 적색) 이중 dPCR에 의해 검출된 P. aeruginosa 특이적 ecfX 유전자; (C) 36-C 샘플로부터 ecfX(y-축, 청색) 및 phoE(x-축, 적색) 이중 dPCR에 의해 검출된 K. pneumonia 특이적 phoE 유전자; (D) 18-C 샘플로부터 검출된 blaTEM-type(x-축, 적색) 및 blaCTX-M 그룹 1(y-축, 청색) 유전자; (E) 6-C 샘플로부터 blaIMP-type(y-축, 청색) 및 blaNDM-1(x-축, 적색) 이중 dPCR에 의해 검출된 blaIMP-type 유전자; (F) 36-C 샘플에서 항균 내성 유전자가 검출되지 않았다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 ‘디지털 PCR(Digital polymerase chain reaction, dPCR)’ 은 핵산을 탐지하고 정량하는 새로운 접근법으로서 기존 PCR에 비해 정확한 정량 분석과 표적 핵산 분자의 고감도 탐지가 가능하다. 기존의 PCR의 결과 분석 방식이 아날로그 방식인 점에 반해, dPCR은 결과 신호가 "0" 또는 "1"의 값을 가져 분석 방식이 디지털 방식이기 때문에 대용량의 다양한 시료를 다양한 검사 항목에 대하여 분석할 수 있다. 또한, dPCR은 DNA 시료를 표준 곡선이 필요 없는 단일 분자 계수법을 적용하여 절대정량이 가능하므로 하나의 웰 당 하나의 액적(droplet)에 대한 PCR 반응으로 보다 정확한 절대 정량을 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 ‘프라이머 및 프로브 세트(프라이머/프로브 세트)’는 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브의 3가지 서열이 하나의 세트로 구성된 것을 의미한다. 본 발명에서는 제1프라이머 세트 내지 제5프라이머 세트에 각각 서열번호 3, 6, 9, 12 또는 15의 염기서열을 포함하는 프로브가 포함된 세트를 의미한다.
본 발명의 ‘단일 dPCR(singleplex dPCR)’은 하나의 프라이머(및 프로브) 세트를 이용하는 디지털 PCR을 의미하고, ‘이중 dPCR(duplex dPCR)’은 두 개의 프라이머(및 프로브) 세트를 이용하는 디지털 PCR을 의미하며, ‘다중 dPCR(multiplex dPCR)’은 복수개의 프라이머(및 프로브) 세트를 이용하는 디지털 PCR을 의미한다.
본 발명의 ‘프라이머’는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 즉, 프라이머는 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, DNA 폴리머라제 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성을 개시할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명의 ‘진단(diagnosis)’은 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 바람직하게는 박테리아 혈류 감염으로 발생할 수 있는 패혈증 및 이의 발병 위험성을 판단하는 것이다.
본 발명의 ‘예후(prognosis)’는 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 패혈증의 재발, 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미한다. 예후의 예측(또는 예후의 진단)은 특히 초기 패혈증 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 패혈증 치료에 대한 단서를 제시할 수 있으며, 패혈증 치료제에 대한 환자의 반응, 치료 경과에 대한 예측도 포함한다.
본 발명의 ‘검출 한계(limit of detection)’는 특정 패혈증 원인균을 검출할 수 있는 최소 DNA의 양을 의미한다.
상기 기재한 바와 같이, 종래 패혈증 원인균 검출을 위해 사용한 혈액 배양방법은 18 내지 24 시간이 걸리기 때문에 패혈증 진단에 너무 오랜 시간이 소요된다. 보다 효과적인 패혈증 예방 내지 치료를 위해 신속하게 패혈증을 진단 내지 예측하는 방법이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 패혈증을 일으키는 주요 그람 음성 병원균을 표적으로 하는 디지털 PCT(dPCR) 프라이머/프로브 세트를 제작했다. P. aeruginosa의 경우, ecfX, gyrB, oprI, algD, toxA 및 16s rRNA 유전자가 후보로 제안되었다. 그중 ecfX 유전자가 P. aeruginosa-특이적 식별을 위한 적절한 표적임을 실험적으로 확인하고 이를 선택하였다. E. coli의 경우, 보편적인 E. coli 표적인 β-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase)를 인코딩하는 uidA 유전자를 표적으로 하는 프로브를 설계 하였다. 그러나, E. coli과 시겔라 종(Shigella spp.)의 유전적 유사성으로 인해 uidA만으로는 E. coli를 시겔라 종과 구별할 수 없다. 따라서, 락토오스 투과효소(lactose permease)를 암호화하는 E. coli 특이 유전자인 lacY를 표적으로 하는 프로브를 추가적으로 제작했다. K. pneumoniae의 경우 이에 특이적인 phoE 유전자를 선택하였다. A. baumannii의 경우, 이에 특이적이고 실시간 PCR을 통하여 민감도 및 특이성이 실험적으로 확인된 ompA 유전자를 선택하였다. 또한 4 가지 주요 약물 내성 유전자(blaTEM-type, blaCTX-M 그룹 1, blaIMP-type 및 blaNDM-1)를 대상으로 dPCR 프라이머/프로브 세트를 제작했다. 본 발명의 프라이머/프로브 세트의 적절성을 단일 dPCR을 사용하여 확인하였다(실시예 1 및 실시예 2).
본 발명의 프라이머/프로브 세트를 이용한 dPCR의 최소 검출 한계는 50 ag로, 실시간 qPCR (500 fg)보다 104 배 더 민감했다(실시예 3). 원칙적으로, 하나의 E. coli 세포에서 게놈 DNA의 양은 약 0.017pg이며, 이는 dPCR이 혈액에서 1 CFU/㎖ 미만의 원인균을 검출할 수 있음을 의미한다. 1 ~ 100 CFU/㎖의 원인균이 성인 박테리아 혈류 감염(BSI) 환자의 혈액에 존재한다면, 본 발명의 dPCR 시스템은 BSI의 초기 단계에서 패혈증 원인균 내지 항균제 내성 유전자를 검출하기에 충분히 민감하다.
본 발명의 표적 특이적 프라이머/프로브 세트를 2 개(VIC 또는 FAM)의 상이한 염료와 혼합하여, 5 개의 이중 dPCR 반응에 의해 9 개의 표적 모두를 검출할 수 있었고 총 반응 시간은 3 시간 미만이었다(실시예 4). 이는 혈액 샘플링에서 최종 해석까지의 dPCR의 전체 절차에 3 시간 미만이 소요된 것이므로 신속하게 패혈증을 진단 내지 예측할 수 있음을 의미한다. 상기 FAM과 VIC은 올리고 뉴클레오티드(프라이머/프로브) 라벨링에 사용되는 형광 염료이다. 프라이머/프로브가 타켓이 되는 균주의 시퀀스와 적절하게 결합하였을 경우, FAM 또는 VIC 형광 염료가 각각 파란색 또는 빨간색으로 발광하게 됨으로써 검출할 수 있다.
또한 현재 원인균 검출을 위해 가장 일반적으로 사용되는 PCR 기반 기술인 TaqMan 실시간 PCR(TaqMan PCR)의 결과 또는 임상적으로 환자의 혈액 배양 결과는 본 발명의 이중 dPCR 시스템의 결과와 일치하였으며, 이는 본 발명의 100 % 검출 민감도를 나타낸다. 특히, TaqMan PCR에서 음성으로 나타난 6개의 샘플 또는 혈액 배양에서 음성으로 나타난 7개의 샘플은 이중 dPCR에서 원인균 특이적 양성 신호를 나타냈는데, 이는 본 발명의 dPCR의 민감도가 높기 때문에 혈액 배양에서 감지 할 수 없는 매우 낮은 용량의 원인균을 식별할 수 있음을 의미한다. 추가적으로, 상기 6 개의 TaqMan PCR 음성 샘플 중 5 개는 혈액 배양에서 양성으로 나타나, TaqMan PCR 분석의 검출 감도는 아직 임상 적용에 충분하지 않다는 것을 의미하였다. 음성 대조군 샘플의 경우 모두 dPCR 분석에서 원인균 음성이었고, 이는 본 발명의 dPCR 시스템의 100 % 특이도를 의미한다(실시예 5, 표 3).
따라서, 본 발명은 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제1프라이머 세트;
서열번호 4 의 염기서열 및 서열번호 5 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제2프라이머 세트;
서열번호 7 의 염기서열 및 서열번호 8 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제3프라이머 세트;
서열번호 10 의 염기서열 및 서열번호 11 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제4프라이머 세트; 및
서열번호 13 의 염기서열 및 서열번호 14 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제5프라이머 세트;
로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 패혈증 원인균 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트들은 패혈증 원인균의 유전자를 증폭시켜 검출할 수 있는 다양한 방법에 사용될 수 있으나, 바람직하게는 PCR(polymerase chain reaction)에 사용되는 것일 수 있다.
상기 PCR은 정량적 PCR(quantitative PCR, qPCR), 실시간 PCR(real-time PCR), 역전사 PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR), 고체상 PCR(Solid Phase PCR), 경쟁적 PCR(Competitive PCR), 오버랩 PCR(Overlap-extension PCR), 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR), 네스티드 PCR(Nested PCR), 역 PCR(Inverse PCR), 라이게이션-연관 PCR(Ligation-mediated PCR), ISSR(Intersequence-specific PCR), 메틸화-특이 PCR(Methylation-specific PCR, MSP), 콜로니 PCR(colony PCR), 미니프라이머 PCR(Miniprimer PCR), 나노 PCR(Nanoparticle-Assisted PCR, nanoPCR), TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR), 터치다운 PCR(Touchdown(Step-down) PCR), 핫 스타트 PCR(Hot start PCR), 인-실리코 PCR(In silico PCR), 대립유전자 특이 PCR(allele-specific PCR), 어셈블리 PCR(Assembly PCR), 비대칭 PCR(asymmetric PCR), 다이알-아웃 PCR(Dial-out PCR), 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 및 헬리카제-의존형 증폭 기술(helicasedependent amplification)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 바람직하게는 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR)일 수 있다.
상기 패혈증 원인균은 패혈증을 일으키는 그람 음성균을 모두 포함하는 개념이나, 바람직하게는 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 시겔라 소이네(Shigella sonnei), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis) 및 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 시겔라 소이네(Shigella sonnei)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 상기 조성물의 검출한계는 1 ag/㎕ 내지 500 fg/㎕ 인 것일 수 있으며, 바람직하게는 20 ag/㎕ 내지 50 fg/㎕ 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 40 ag/㎕ 내지 5 fg/㎕ 일 수 있다.
본 발명의 상기 제1프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 3 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제2프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 6 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제3프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 9 의 염기서열을 포함하는 프로브;
제4프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 12 의 염기서열을 포함하는 프로브; 및
제5프라이머 세트는 추가적으로 서열번호 15 의 염기서열을 포함하는 프로브; 를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 패혈증 원인균 검출용 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 패혈증 원인균 검출용 키트를 제공할 수 있다.
상기 PCR은 상기 패혈증 원인균 검출용 조성물이 사용될 수 있는 PCR과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명의 상기 키트는 PCR 증폭 반응을 수행하기 위해 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, i) 패혈증 의심 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 무세포 DNA(cell free DNA)를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 무세포 DNA와 상기 패혈증 원인균 검출용 조성물을 이용하여 패혈증 원인균을 검출하는 단계;
를 포함하는 패혈증 원인균 검출방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 상기 단계 i)의 개체는 인간을 포함하여 패혈증이 발병할 수 있는 모든 동물을 의미하며, 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 발명의 상기 단계 i)의 생물학적 시료는 혈액, 소변, 뇌척수액 및 타액 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 보다 바람직하게는 혈액인 것이 바람직하다. 상기 혈액은 상기 개체의 중앙 혈관 또는 말초 혈관으로부터 수득된 것일 수 있으며, 상기 혈액은 혈장일 수 있다.
본 발명의 상기 단계 iii)의 검출은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하여 검출하는 것일 수 있으며, 상기 PCR은 상기 패혈증 원인균 검출용 조성물이 사용될 수 있는 PCR과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명은 또한, 상기 패혈증 원인균 검출용 조성물을 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 키트를 제공할 수 있다.
상기 PCR 증폭 반응을 위한 시약은 상기 패혈증 원인균 검출용 키트에 포함될 수 있는 것과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
본 발명은 또한, i) 패혈증 의심 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 생물학적 시료로부터 무세포 DNA(cell free DNA)를 분리하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 무세포 DNA와 상기 패혈증 원인균 검출용 조성물을 이용하여 패혈증 원인균을 검출하는 단계;
를 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.
상기 단계 i) 내지 iii)은 상기 패혈증 원인균 검출방법에 포함되는 단계와 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
세균 균주
본 발명에 사용된 그람 음성 균주는 하기 [표 1]과 같다. American Type Culture Collection(VA, Manassas, VA), Korean Collection of Type Cultures(Jeongeup, South Korea)으로부터 5 개의 표준(reference) 균주를 얻었으며, 한국 서울 성모 병원에서 13 개의 임상(clinical) 균주(cm241, cm66, cmPA-1, cmEC-1, 13B-333, 13B-236, cmPA-2, cmPA-4, Aci_080004, Aci_080014, Aci_090023, Aci_090047 및 Aci_090050)를 획득하였다. 18 균주 각각을 혈액 한천(Blood agar) 플레이트(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) 및 루리아 베르타니(Luria-Bertani, LB) 한천 플레이트(BD, NJ Franklin Lakes)에서 37 ℃에서 24 시간 동안 무산소 배양하였다.
균주 종 항균제 내성 유전자
ATCC 19606 아시네토박터 바우마니균
(Acinetobacter baumannii)
ATCC 25922 에스케리키아 콜라이
(Escherichia coli)
KCTC 12385 크렙시엘라 뉴모니아
(Klebsiella pneumoniae)
ATCC 27853 슈도모나스 에루지노사
(Pseudomonas aeruginosa)
ATCC 19585 시겔라 소이네
(Shigella sonnei)
cm241 에스케리키아 콜라이
(Escherichia coli)		 TEM-유형 β-락타마제, CTX-M-1 그룹 확장 스펙트럼 β-락타마제(CTX-M-15)
cm66 에스케리키아 콜라이
(Escherichia coli)		 TEM-유형 β-락타마제, CTX-M-1 그룹 확장 스펙트럼 β-락타마제(CTX-M-9)
cmPA-1 슈도모나스 에루지노사
(Pseudomonas aeruginosa)		 IMP 메탈로-β-락타마제-1
cmEC-1 에스케리키아 콜라이
(Escherichia coli)		 뉴델리 메탈로-β-락타마제-1
13B-333 크렙시엘라 뉴모니아
(Klebsiella pneumoniae)		 TEM-유형 β-락타마제, CTX-M-1 그룹 확장 스펙트럼 β-락타마제(CTX-M-15)
13B-236 크렙시엘라 뉴모니아
(Klebsiella pneumoniae)
cmPA-2 슈도모나스 에루지노사
(Pseudomonas aeruginosa)		 IMP 메탈로-β-락타마제-1
cmPA-4 슈도모나스 에루지노사
(Pseudomonas aeruginosa)		 IMP 메탈로-β-락타마제-1
Aci_080004 아시네토박터 바우마니균
(Acinetobacter baumannii)
Aci_080014 아시네토박터 바우마니균
(Acinetobacter baumannii)
Aci_090023 아시네토박터 바우마니균
(Acinetobacter baumannii)
Aci_090047 아시네토박터 바우마니균
(Acinetobacter baumannii)
Aci_090050 아시네토박터 바우마니균
(Acinetobacter baumannii)
패혈증 원인균 검출을 위한 프라이머 및 프로브 설계
본 발명자들은 원인균 관련 서열을 변경함으로써 원인균 그람 음성 패혈증의 주요 원인을 타겟팅하는 디지털 PCR(dPCR) 프라이머/프로브 세트를 설계하였다. 이때, 그람 음성 원인균을 검출하는 것 외에도, 원인균에 항균 내성 유전자의 존재를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 하기 [표 2]와 같이 A. baumannii에 대한 ompA; P. aeruginosa에 대한 ecfX; K. pneumonia 에 대한 phoE; E. coli에 대한 uidA 및 lacY 을 표적으로 하는 dPCR 프라이머/프로브 세트를 제작하였다. 단일 dPCR(singleplex dPCR) 반응을 수행하여 저항 유전자(표 1)를 암호화하는 것으로 확인된 4 개의 임상 분리물을 분석함으로써 각각의 프라이머/프로브 세트의 특이성을 결정하였다. 항균 내성 유전자를 검출하기 위해, TEM-유형 β-락타마제(TEM-type beta-lactamase; bla TEM-type), CTX-M-1 그룹 확장 스펙트럼 β-락타마제(CTX-M-1 group extended-spectrum beta-lactamase; bla CTX-M group 1), 뉴델리 메탈로-β-락타마제-1(New Delhi metallo-beta-lactamase-1; bla NDM-1) 및 IMP 메탈로-β-락타마제(IMP metallo-beta-lactamse; bla IMP-type) 에 대한 프라이머/프로브 세트를 이전 연구에서 확인된 서열을 수정하여 제조하였다. 각 프로브의 하이브리드화 서열의 특이성은 BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)를 사용하여 확인되었다. 각 프로브 서열의 깁스 자유 에너지(ΔG)는 Mfold 소프트웨어(http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/)를 사용하여 결정되었으며, 본 연구에서는 ΔG≥0 인 프로브를 사용하였다. 저항성 유전자에 대한 프라이머/프로브 세트의 상동성 점수는 Clustal Omega 소프트웨어 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)를 사용하여 계산되었다.
타겟 유전자 프로브 프라이머/프로브 서열 서열번호
A. baumanii ompA VIC F: ACGTAGTTCTTGGTGGTCACTTGA 1
R: AGGTCTTCAGTTAACTCTTGTGGTTGT 2
P: CTCCTGTAGTAGAAGTTG 3
E. coli uidA VIC F: GGGCGAACAGTTCCTGATCA 4
R: TCATGACGACCAAAGCCAGTAA 5
P: CCACAAACCGTTCTAC 6
lacY FAM F: CTGGTCTGTTTCTGCTTCTTTAAGC 7
R: TGCCCGCCAGTACAGACA 8
P: ACTGGCGATGATTTT 9
K. pneumoniae phoE VIC F: TGCAGTACCAGGGTAAAAACGA 10
R: CGCCGTCGCCGTTCT 11
P: CCGTGAAGCGAAGAA 12
P. aeruginosa ecfX FAM F: CCGCGCGCATTTCTTTT 13
R: CCAATGGTCGCGCAACA 14
P: CAGATCGCCCGCAAC 15
항균제 내성
유전자 		bla TEM-type VIC F: TGCTGCCATAACCATGAGTGA 16
R: GGTCCTCCGATCGTTGTCA 17
P: TGCTGCCAACTTACT 18
bla CTX -M
group 1		 FAM F: GACGCTGGGTAAAGCATTGG 19
R: GGTATTGCCTTTCATCCATGTCA 20
P: ACAGCCAACGGGC 21
bla NDM-1 VIC F: GACCGCCCAGATCCTCAA 22
R: CGCGACCGGCAGGTT 23
P: TGGATCAAGCAGGAGAT 24
bla IMP-type FAM F: CGATCTATCCCCACGTATGCA 25
R: GGCTTGAACCTTACCGTCTTTTT 26
P: CTGAATTAACAAATGAACTGC 27
그 결과, [도 1]에서 나타나는 바와 같이 모든 세트는 표적 특정 신호를 보여 주었다. A. baumanii에 대한 표준 균주인 ATCC 19606은 ompA 프라이머-VIC 프로브 세트에 의해 특이적으로 검출되었다(도 1A). P. aeruginosa의 경우 ATCC 27853, K. pneumoniae의 경우 KCTC 12385는 각각 ecfX 프라이머-FAM 및 phoE 프라이머-VIC 프로브 세트로 식별되었다(도 1B 및 C). E. coli에 대한 ATCC 25922는 uidA 프라이머-VIC 및 lacY 프라이머-FAM 프로브 세트 모두에 의해 특이적으로 검출되었다(도 1D 및 E). 그러나 S. sonnei의 ATCC 19585에서는 uidA 만 탐지되었다(도 1F 및 G). 원인균 특이적 dPCR 프라이머/프로브 세트가 그람 양성 원인균과 같은 다른 원인균과 반응할 때, 신호가 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
또한, [도 2]에서 나타나는 바와 같이, blaTEM 및 blaCTX-M-15 유전자를 암호화하는 E. coil 분리체 cm241을 적용했을 때 두 ESBL 유전자가 성공적으로 검출되었다(도 2A 및 2B). 두 MBL 유전자는 P. aeruginosa 분리체 cmPA-1 및 E. coli 분리체 cmEC-1와 특이적으로 각각 구별된다(도 2C 및 2D). CTX-M 그룹 9 ESBL 및 blaTEM 효소를 생성하는 것으로 알려진 다른 E. coli 분리체 cm66은 blaCTX-M 그룹 1 신호가 아닌 blaTEM 신호를 나타냈다(도 2E 및 F). 다른 임상 균주에서도 각각의 표적 프라이머/프로브를 사용하여 해당 유전자 검출에 성공하였다.
검출 민감도
본 발명의 프라이머/프로브 세트의 검출 민감도(detection sensitivity)를 확인하고, 더 나아가 dPCR 시스템의 검출 민감도와 원인균 검출을 위해 가장 일반적으로 사용되는 PCR 기반 기술인 TaqMan 실시간 qPCR(qPCR) 분석의 검출 감도를 비교하고자 하였다.
구체적으로, A. baumannii 표준 균주(ATCC 19606)의 게놈 DNA를 50 pg/㎕, 5 pg/㎕, 500 fg/㎕, 50 fg/㎕, 5 fg/㎕, 500 ag/㎕, 50 ag/㎕ 및 5 ag/㎕로 연속 희석하고 dPCR 또는 qPCR 에 적용하였다.
dPCR 실험은 제조업체의 권장 사항과 이전 연구의 방법론에 따라 QuantStudio 3D 디지털 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행되었다. 7.2㎕의 QuantStudio 3D 디지털 PCR Mastermix v2(Thermo)를 포함하는 14.5㎕ 샘플의 최종 부피 1㎕의 게놈 DNA, 0.75㎕의 프라이머/프로브 세트(각각 900nM/250nM의 최종 농도)를 칩 상에 로딩하고 QuantStudio 3D 디지털 칩 로더를 사용하여 밀봉하였다. PCR은 다음 사이클링 프로토콜을 사용하여 GeneAmp　PCR 시스템 9700 thermocycler(Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었다: 96 ℃에서 10 분, 이어서 60 ℃에서 2 분 및 98 ℃에서 30 초로 45 사이클, 최종 신장은 60 ℃에서 2 분. 증폭 후, 형광 신호를 QuantStudio ™3D 디지털 PCR 소프트웨어 v3.0을 사용하여 분석하였다.
TaqMan qPCR은 정량적 폴리머라제 반응(Quantitative polymerase reaction)으로서 다음 사이클 프로토콜을 갖는 ViiA ™7 QuantStudio 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 수행하였다: 95 ℃에서 10 분 동안 초기 변성, 95 ℃에서 10 동안 45 사이클의 증폭, 20 초 동안 60 ℃, 20 초 동안 72℃. 앰플리콘 혼합물은 5㎕의 TaqMan Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems, Waltham, MA), dPCR에 사용된 0.5㎕의 동일한 프라이머/프로브 세트 및 환자의 혈액으로부터 5㎕의 무세포 DNA를 함유하였다. 모든 qPCR 반응을 3 회 수행하였다.
그 결과, dPCR에서 검출의 최소 한계는 50ag이고, TaqMan qPCR에서, 검출의 최소 한계는 500fg(도 3B) 인 것을 확인할 수 있었다. 이는 dPCR 분석의 민감도가 TaqMan qPCR 분석의 민감도보다 대략 104 배 더 높음을 나타냈다.
패혈증 원인균의 이중 식별
단일 방식(singleplex)으로 dPCR 시스템의 성능을 확인한 후, 교차 반응 또는 프라이머/프로브 세트 사이의 간섭없이 이중 반응(duplex) 조건에서 원인균을 특이적으로 검출할 수 있는지 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 이중 dPCR의 경우, 표적-특이적 프라이머/프로브 세트를 2 개의 상이한 염료(FAM 및 VIC 염료)와 혼합하고 반응 당 각 원인균 게놈 DNA 혼합물 25pg/㎕을 사용하여 dPCR을 수행하였다.
그 결과, [도 4]에서 나타나는 바와 같이, uidA 프라이머-VIC 및 lacY 프라이머-FAM 프로브 세트를 사용하면, 이중 반응 조건하에 E. coli DNA에서 uidA 및 lacY 유전자가 모두 명확하게 검출되었다(도 4A). P. aeruginosa 및 K. pneumoniae의 이중 식별을 위해 ecfX 프라이머-FAM 및 phoE 프라이머-VIC 프로브 세트를 적용했다. ecfX-FAM 및 phoE-VIC 신호는 이중 반응 조건에서 명확하게 감지되었다(도 4B). A. baumannii 및 P. aeruginosa의 이중 식별을 위해 ompA 프라이머-VIC 및 ecfX 프라이머-FAM 프로브 세트를 적용했다. 두 신호는 이중 반응 조건 하에서 명확하게 검출되었다(도 4C). 모든 이중 dPCR 실험에서 간섭은 없었다. 비특이적 증폭을 배제하기 위해, 각각의 프라이머/프로브 세트와 비교할 수 없는 그람 음성 원인균 DNA 사이의 교차 반응성을 확인하였다. 모든 조합에 비 특정 신호가 없었다(데이터는 표시되지 않음).
또한, blaTEM-type 프라이머-VIC 및 blaCTX-M 그룹 1 프라이머-FAM 프로브를 조합한 이중 dPCR에서, 표적 특이적 신호 모두 blaTEM-type 및 blaCTX-M-15 유전자를 코딩하는 E. coli cm241 DNA로부터 성공적으로 검출되었다(도 4D). blaIMP-type 프라이머-VIC 및 blaNDM-1 프라이머-FAM 프로브의 조합을 갖는 또 다른 이중 dPCR에서, P. aeruginosa cmPA-1 및 E. coli cmEC-1 분리체의 DNA 혼합물로부터 IMP 및 NDM-1 유전자 신호가 성공적으로 검출되었다(도 4E).
종합하면, 5 개의 이중 반응에 의해 9 개의 표적(5 개의 그람 음성 원인균 특이적 표적 및 4 개의 항균성 내성 유전자)이 성공적으로 확인되었다. 혈액 샘플링에서 원인균 식별에 이르기까지 전체 절차 시간을 최소화하기 위해 재료 및 방법에 설명 된대로 이중 dPCR 조건을 통합했다. 따라서, 5 개의 이중 dPCR 반응을 모두 동시에 수행할 수 있고 전체 절차는 3 시간 미만이 소요되었다.
패혈증 환자의 혈액에서 그람 음성 병원균의 검출
본 발명의 궁극적인 목표는 패혈증 환자의 혈액에서 주요 그람 음성 원인균 및 약물 내성 유전자를 민감하고 신속하게 감지하는 것이다.
구체적으로, 15 명의 열이 나는(ferbile) 환자 각각의 중앙(central vessels, C) 또는 말초 혈관(peripheral vessels, P)으로부터 총 30 개의 전혈 샘플을 수집하였다. 가톨릭 의료 센터의 기관 검토위원회(IRB no : KC16TNSI0999)의 승인하에 서울 성모 병원에서 4 개의 패혈증 음성 혈액 샘플을 음성 대조군으로 수집했다. 5㎖의 전혈을 1,200g에서 5 분 동안 원심 분리하여 혈장을 분리하였다. 혈장으로부터의 무세포 DNA(cfDNA)를 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen, Venlo, Netherlands)를 사용하여 추출하였다. cfDNA 샘플과 함께 QuantStudio 3D 디지털 PCR 시스템을 사용하여 전술한 동일한 dPCR 공정을 수행하였다. 총 30 개의 무세포 DNA 샘플을 이중 dPCR(샘플 당 5 개의 이중 반응)에 적용하였다. 분석 결과는 하기 [표 3]에 나타냈으며, 이는 양성(positive)으로 나타난 패혈증 원인균 내지 이의 항균제 내성 유전자를 나타낸다. ‘-’ 또는 음성(negative)은 어떤 유전자도 검출되지 않은 것을 의미한다.
혈액 샘플 dPCR TaqMan PCR 혈액 배양
6-C ecfX bla IMP-type ecfX, bla IMP-type 음성
6-P ecfX bla IMP-type ecfX, bla IMP-type P. aeruginosa , bla IMP-type
18-C uidA, lacY bla TEM-type , bla CTX-M
group 1		 uidA, lacY, bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1		 E. coli , bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1
18-P uidA, lacY bla TEM-type , bla CTX-M
group 1		 uidA, lacY, bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1		 E. coli , bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1
22-C uidA, lacY bla TEM-type , bla CTX-M
group 1		 - E. coli , bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1
22-P uidA, lacY bla TEM-type , bla CTX-M
group 1		 - 음성
36-C phoE - - K. pneumoniae
36-P phoE - - K. pneumoniae
67-C uidA, lacY - uidA, lacY 음성
67-P uidA, lacY - uidA, lacY 음성
78-C uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
78-P uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
93-C uidA, lacY - - E. coli
93-P uidA, lacY - - E. coli
96-C uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
96-P uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
100-C uidA, lacY - uidA, lacY 음성
100-P uidA, lacY - uidA, lacY 음성
102-C uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
102-P uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
107-C uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
107-P uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
109-C uidA, lacY bla TEM-type , bla CTX-M
group 1		 uidA, lacY, bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1		 E. coli , bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1
109-P uidA, lacY bla TEM-type , bla CTX-M
group 1		 uidA, lacY, bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1		 E. coli , bla TEM-type ,
bla CTX-M group 1
116-C uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
116-P uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
117-C uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
117-P uidA, lacY - uidA, lacY 음성
119-C uidA, lacY - uidA, lacY E. coli
119-P uidA, lacY - uidA, lacY E. coli 양
분석 결과, 혈액 샘플 중 23 개는 배양 양성(E. coli에 대해 20 개, K. pnuemoniae에 대해 2 개, P. aeruginosa에 대해 1 개)이었다. 모든 배양 양성 원인균은 이중 dPCR에 의해 일관되게 검출되었다. 다른 7 개의 배양 음성 샘플은 이중 dPCR(6 개의 E. coli에 및 1 개의 P. aeruginosa)에서 원인균 특이적 신호를 나타냈다. 항균 내성 유전자와 관련하여서는, 8 개의 샘플이 이중 dPCR 분석에 의해 유전자를 갖는 것으로 밝혀졌다(blaTEM-1 및 blaCTX-M 그룹 1 유전자 6 개 및 blaIMP-type 유전자 2 개). 이중 dPCR에 의해 확인된 8 개의 저항성 유전자 중 7 개는 배양 및 TaqMan PCR 분석에 의해 일관되게 식별되었다.
또한, [도 5]에서 나타나는 바와 같이, [도 5]의 A-C는 환자의 혈액 샘플(18-C, 6-C 및 36-C)에서 dPCR에 의해 확인된 E. coli(uidA 및 lacY 유전자), P. aeruginosa(ecfX) 및 K. pnuemoniae(phoE)의 예를 나타낸다. 비교를 위해, 동일한 샘플에 대해 실시간 PCR 분석도 수행되었다. TaqMan PCR 분석에서 24 개는 원인균 양성(E. coli은 22 개, P. aeruginosa은 2 개)으로 이중 dPCR에 의해 일관되게 검출되었다. 그러나, TaqMan PCR에 의해 음성인 6 개의 샘플 중 5 개는 혈액 배양 양성이었고, 이는 TaqMan PCR 분석의 검출 감도가 배양 분석의 검출 감도보다 낮을 수 있음을 의미한다.
하나의 샘플(22-P)의 유전자는 배양 또는 실시간 PCR에 의해 검출되지 않았으나 이중 dPCR에 의해 검출되었다. [도 5]의 D-F는 이중 dPCR에 의해 환자의 혈액 샘플 (각각 18-C, 6-C 및 36-C)로부터 동정된 항균 내성 유전자의 예를 나타낸다. 18-C 샘플에서, blaTEM-1 및 blaCTX-M 그룹 1 유전자 모두 명확하게 검출되었다(도 5D). 6-C 샘플에서, blaIMP-type 유전자가 검출되었다(도 5E). 36-C 샘플에서, 이중 dPCR에 의해 항균성 내성 유전자가 검출되지 않았다(도 5F). 또한, 패혈증이 없는 개인의 혈액 샘플을 음성 대조군으로 조사했을 때 이중 dPCR, TaqMan PCR 및 배양에 의한 원인균 특이적 신호가 나타나지 않는 것을 확인하였다.
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Claims (16)

  1. 서열번호 1 의 염기서열 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍으로 이루어진 제1프라이머 세트; 및
    서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프로브 ;
    를 포함하는 패혈증 원인균인 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii) 검출용 조성물로서,
    상기 조성물은 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 에 사용되는 것을 특징으로 하고,
    상기 조성물의 검출한계는 40 ag/㎕ 내지 5 fg/㎕ 인 것을 특징으로 하는 패혈증 원인균 검출용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항의 조성물과, PCR 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 패혈증 원인균인 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii) 검출용 키트로서,
    상기 키트는 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 에 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 삭제
  9. 패혈증 의심 개체에서 분리된 생물학적 시료로부터 수득한 무세포 DNA(cell free DNA)와 상기 제1항의 조성물을 이용하여 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR)로 패혈증 원인균인 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii) 을 검출하는 단계;
    를 포함하는 패혈증 원인균인 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii) 검출방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 소변, 뇌척수액 및 타액 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 패혈증 원인균 검출방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 혈액은 개체의 중앙 혈관(central vessels) 또는 말초 혈관(peripheral vessels)으로부터 수득된 것을 특징으로 하는 패혈증 원인균 검출방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항의 조성물을 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 조성물.
  15. 제14항의 조성물과, 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR) 증폭 반응을 위한 시약을 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측용 키트.
  16. 패혈증 의심 개체에서 분리된 생물학적 시료로부터 수득한 무세포 DNA(cell free DNA)와 상기 제1항의 조성물을 이용하여 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR)로 패혈증 원인균인 아시네토박터 바우마니균(Acinetobacter baumannii) 을 검출하는 단계;
    를 포함하는 패혈증 진단 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법.
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