CN110093431A - 解脲脲原体的lamp检测方法及试剂盒 - Google Patents

解脲脲原体的lamp检测方法及试剂盒 Download PDF

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CN110093431A CN201910222877.8A CN201910222877A CN110093431A CN 110093431 A CN110093431 A CN 110093431A CN 201910222877 A CN201910222877 A CN 201910222877A CN 110093431 A CN110093431 A CN 110093431A
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汤昕
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Abstract

本发明的一种解脲脲原体的LAMP检测方法及试剂盒，针对针解脲脲原体的高度保守的序列ureaseB genes基因的6或8个区域设计4或6条特异引物，通过发明人的创造性劳动设计得到LAMP检测引物组，用于检测样本中的解脲脲原体，具有快速准确、简单价廉且重复性、特异性好，且灵敏度高的特点，检测线达到42pg/μL。

Description

解脲脲原体的LAMP检测方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种解脲脲原体的LAMP检测方法及试剂盒。
背景技术
支原体中的人型支原体(Mycoplasma hominis,Mh)、解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum,Uu)和生殖器支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)均能够导致实验室细胞污染，或引起人类疾病，例如：泌尿生殖道感染支原体感染、盆腔炎症等，尤其解脲脲原体感染最常见。
目前常用的解脲脲原体和人型支原体实验室检测方法有：形态学检查、支原体培养、抗原检测、血清学方法等。采用液体培养法和固体培养法检测解脲脲原体，液体培养法主要依靠解脲脲原体分解尿素产生碱性的NH3，但液体培养基不能准确判断有无解脲脲原体感染，存有一定的假阳性率；同时不能做到纯分离，且一种液体培养基不能同时判断两种以上支原体感染，而且这两种传统的检测方法耗时长。
因此，有必要提供一种快速、高灵敏度、高特异性、重复性好的检测解脲脲原体的方法。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种解脲脲原体的LAMP检测方法及试剂盒，以实现快速准确地检测解脲脲原体。
具体技术方案如下：
一种解脲脲原体的LAMP检测引物组，所述检测引物组包括：
针对靶基因F3c位点的上游外引物F3，选自：SEQ ID NO.1；
针对靶基因B3c位点的下游外引物B3，选自：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7；
针对靶基因F2c位点和F1位点的上游内引物FIP，选自：SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11；
针对靶基因B2c位点和B1位点的下游内引物BIP，选自：SEQ ID NO.4；
上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
本发明还提供了一种解脲脲原体的LAMP检测试剂盒，具体技术方案如下：
一种解脲脲原体的LAMP检测试剂盒，其包含有如上所述的LAMP检测引物组。
本发明还提供了一种非诊断目的的解脲脲原体的LAMP检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)以待测样品的DNA为模板，以如上所述的LAMP检测引物组为引物，进行实时荧光LAMP反应。
基于上述技术方案，本发明具有以下效果：
本发明针对针解脲脲原体的高度保守的序列ureaseB genes基因，通过发明人的创造性劳动设计得到LAMP检测引物组，用于检测样本中的解脲脲原体，具有快速准确、简单价廉且重复性、特异性好，且灵敏度高的特点，检测线达到42pg/μL。
将本发明的LAMP检测引物组用于检测解脲脲原体，该技术针对靶基因的6或8个区域设计4或6条特异引物，增强了反应的特异性；不需要模板的热变性、长时间温度循环，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下就能完成反应，缩短了检测时间；扩增产物呈特征性梯状条带，加入荧光染料，观察反应液的颜色变化，直接用肉眼判读结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察等过程，操作简单、方便；特别是它不需使用昂贵的热循环仪，凝胶电泳和紫外检测等设备，成本较低；适合于病原微生物的现场快速检测、战时野外及基层普及应用。
附图说明
图1为LAMP反应引物示意图；
图2为LAMP反应原理示意图；
图3～图8依次为实施例1中LAMP检测引物组Urease-1、Urease-2、Urease-3、Urease-4、Urease-5和Urease-6的LAMP反应结果图；
图9为LAMP检测引物组Urease-2的特异性检测结果图；
图10为LAMP检测引物组Urease-2的灵敏性检测结果图；
图11为LAMP检测引物组Urease-2的重复性检测结果图；
图12为16个临床样本的LAMP检测结果图；
图13为18个临床样本的LAMP扩增产物的凝胶电泳结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明提供了一种解脲脲原体的LAMP检测引物组，所述检测引物组包括：
上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.2、或核苷酸序列为SEQ ID NO.7；
上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10或SEQ ID NO.11；
下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；
上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
可选地，具体的引物组为：
(a)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQID NO.2；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.3；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(b)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.7；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.3；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(c)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.2；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.8；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(d)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.7；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.8；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(e)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.2；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.9；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(f)上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.7；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.9；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(g)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.2；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.10；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(h)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.7；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.10；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(i)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.2；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.11；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
或(j)：上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.7；上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.11；下游内引物BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；上游环引物LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；下游环引物LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
优选地，检测引物组选自如上所述的：(a)、(b)、(c)、(e)、(g)、(i)。
更优选地，检测引物组为如上所述的(b)。
本发明还提供了一种解脲脲原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含有如上所述的LAMP检测引物组。
本发明的LAMP检测试剂盒中还可以包含有dNTPs、引物工作液、缓冲液、甜菜碱、Mg2+溶液、荧光染料和DNA聚合酶中的至少一种。便于在进行LAMP检测时，配制反应体系，调整合适的反应浓度。可以理解的是，dNTPs、引物工作液、缓冲液、甜菜碱、Mg2+溶液、荧光染料或DNA聚合酶，并非是试剂盒中必要的组成试剂，均可以由其他合适的市售产品代替。
本发明还提供一种非诊断目的的解脲脲原体的LAMP检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品的DNA；(2)以待测样品的DNA为模板，以如上所述的LAMP检测引物组为引物，进行实时荧光LAMP反应。
优选地，在实时荧光LAMP反应体系中，所述检测引物组的浓度比上游内引物FIP：下游内引物BIP：上游外引物F3：下游外引物B3：上游环引物LOOPF、下游环引物LOOPB为(7～9)∶(7～9)∶1∶1∶(3～5)∶(3～5)。
更优选地，所述检测引物组的浓度比上游内引物FIP：下游内引物BIP：上游外引物F3：下游外引物B3：上游环引物LOOPF、下游环引物LOOPB为8∶8∶1∶1∶4∶4。
优选地，在实时荧光LAMP反应体系中，
所述上游内引物FIP的终浓度为1～2μmol/L；和/或
所述下游内引物BIP的终浓度为1～2μmol/L；和/或
所述上游外引物F3的终浓度为0.1～0.3μmol/L；和/或
所述下游外引物B3的终浓度为0.1～0.3μmol/L；和/或
所述上游环引物LOOPF的终浓度为0.7～0.9μmol/L；和/或
所述下游环引物LOOPB的终浓度为0.7～0.9μmol/L。
更优选地，在实时荧光LAMP反应体系中，
所述上游内引物FIP的终浓度为1.6μmol/L；和/或
所述下游内引物BIP的终浓度为1.6μmol/L；和/或
所述上游外引物F3的终浓度为0.2μmol/L；和/或
所述下游外引物B3的终浓度为0.2μmol/L；和/或
所述上游环引物LOOPF的终浓度为0.8μmol/L；和/或
所述下游环引物LOOPB的终浓度为0.8μmol/L。
在其中一些实施例中，所述实时荧光LAMP反应体系为25μl反应体系。
优选地，反应体系中包括：
优选地，扩增反应液包括：dNTP、反应缓冲液、MgSO4和甜菜碱。
其中，引物工作液由上游内引物FIP：下游内引物BIP：上游外引物F3：下游外引物B3：上游环引物LOOPF、下游环引物LOOPB为(7～9)∶(7～9)∶1∶1∶(3～5)∶(3～5)的浓度比混合配制得到。优选地，为上游内引物FIP：下游内引物BIP：上游外引物F3：下游外引物B3：上游环引物LOOPF、下游环引物LOOPB为8∶8∶1∶1∶4∶4混合配制得到。
在其中一些实施例中，所述实时荧光LAMP反应的反应程序为：63±1℃15s，63±1℃45s作为一个循环，做50～70个循环，95±1℃15s终止反应，于63±1℃45s处收集荧光信号。
优选地，所述实时荧光LAMP反应的反应程序为：631℃15s，631℃45s作为一个循环，做60个循环，95℃15s终止反应，于63±℃45s处收集荧光信号。
LAMP：环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。
本发明中实施例中涉及的材料来源如下：
解脲脲原体和人型支原体的标准菌株由广州医科大学附属第三医院检验科保存菌株，两种菌的临床菌株收集的是临床患者支原体检查固体培养后为阳性结果的标本；
TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)购自TIANGEN北京生物技术有限公司；
双螺旋基因DNA扩增试剂盒购自广州双螺旋基因技术有限公司，均在有效期内使用。
下面将结合具体实施例对本发明进行详细说明：
实施例1
1、基因组DNA的提取
将-70℃保存的菌株在室温下平衡后接种于支原体固体培养基和液体培养基，在37℃温箱培36-48h左右，取液体培养基的菌经过PBS洗涤，制成1ml的菌悬液。接下来的步骤按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行操作,提取后的标本在DNA浓度测试仪上进行浓度以及纯度测定。
2、LAMP引物设计及合成
(1)根据解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)的ureaseB genes基因序列(SEQ ID NO.1)，设计引物。如图1所示。
ureaseB genes基因序列(SEQ ID NO.12，327bp)为：
AATTAGTACCAGGAGCAATTAACTTCGCTGAAGGCGAAATTGTGATGAACGAAGGTAGAGAAGCAAAAGTAATCAGCATTAAAAATACTGGTGACCGTCCTATCCAAGTTGGATCACATTTCCACTTATTTGAAACAAATAGTGCATTAGTATTCTTTGATGAAAAAGGAAACGAAGACAAAGAACGTAAAGTTGCTTATGGACGTCGTTTCGATATTCCATCAGGTACTGCTATTCGTTTTGAACCAGGAGACAAAAAAGAAGTTTCAGTTATTGATTTAGTCGGAACACGTGAAGTTTGAGGTGTAAACGGCTTAGTTAACGGAA
引物组合包括上游外引物F3、下游外引物B3、上游内引物FIP、下游内引物BIP、上游环引物LoopF、下游环引物LoopB，如图1所示，由自英潍捷基上海贸易有限公司合成6套Urease基因引物，分别是Urease-1、Urease-2、Urease-3、Urease-4、Urease-5和Urease-6，见表1-6。
表1 Uu Real-LAMP检测体系引物UreaseB-1
表2 Uu Real-LAMP检测体系引物UreaseB-2
表3 Uu Real-LAMP检测体系引物UreaseB-3
表4 Uu Real-LAMP检测体系引物UreaseB-4
表5 Uu Real-LAMP检测体系引物UreaseB-5
表6 Uu Real-LAMP检测体系引物UreaseB-6
3、Real-LAMP反应体系
按照DNA扩增试剂说明书配制LAMP反应体系，如表7所示。体系加完后加一滴石蜡油，再加荧光染料SYTO-9。其中，引物工作液由FIP、BIP、F3、B3、LOOPF、LOOPB按照浓度比8∶8∶1∶1∶4∶4混合配制，使上述引物加入25μl体系后浓度分别达到浓度分别为1.6μmol/L、1.6μmol/L、0.2μmol/L、0.2μmol/L、0.8μmol/L、0.8μmol/L。荧光通道选择SYBR或FAM。LAMP反应原理如图2所示。
表7 LAMP反应体系
3、Real-LAMP反应条件
分别用6套引物(Urease-1、Urease-2、Urease-3、Urease-4、Urease-5和Urease-6)配制工作液，以提取Uu的DNA为模板，按照DNA扩增试剂盒说明书的要求进行加样和设置反应条件，反应程序为63℃15s，63℃45s作为一个循环，做60个循环，95℃15s终止反应，于63℃45s处收集荧光信号，同时对各反应管做阴性对照。结果如图3-图8所示。其中Urease-x-P为阳性结果，Urease-x-N指阴性对照。
由结果可知，在开始反应后，对比各引物的体系反应曲线，综合考虑各引物的出峰时间、荧光强度、等因素；解脲脲原体的UreaseB基因所设计的第二套引物UreaseB-2有相对高的扩增效率，30分钟反应出峰，40分钟达峰，同时阴性对照的结果为阴性，第二套引物为最佳引物组。而其他引物中，UreaseB-1的Fluorescence intensity(荧光强度)较UreaseB-2的弱；UreaseB-3、UreaseB-4、UreaseB-5、UreaseB-6的出峰时间和荧光强度都较UreaseB-2的差。
实施例2
1、特异性试验
提取解脲脲原体及其他临床常见病原菌的基因组DNA，按照Real-LAMP的反应条件进行扩增，分析检测信号，评价该引物的特异性。
解脲脲原体其他相关临床菌分别为：大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯、产气肠球菌、溶血葡萄球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、人型支原体。结果如图9所示。可见，在解脲脲原体体系的试验选取的常见的病原菌均未出现扩增，而解脲脲原体的DNA可被检测出来，说明该引物对解脲脲原体检测的特异性较好，与非目标菌不存在交叉反应。
2、灵敏性试验
测定解脲脲原体的DNA液浓度，先用1μl TE液对微量分光光度计调0，再加1μl解脲脲原体的DNA提取液，测量DNA模板浓度。
取2μl DNA原液用超纯水进行100倍梯度稀释5次，得到6个不同浓度的DNA模板，然后加入Real-LAMP体系中反应，观察扩增曲线，检测引物对解脲脲原体检测灵敏度。结果如图10所示，其中，B1：420pg/μl；B2：42pg/μl；B3：4.2pg/μl；B4：0.42pg/μl；B5：0.042pg/μl；B6：0.0042pg/ul。由B1、B2两条可检测到解脲脲原体的曲线可见，本发明建立的解脲脲原体的LAMP检测方法，灵敏度可达42pg/μl。
3、重复性试验
用Real-LAMP对1份阳性菌株及阴性对照各进行3次重复试验，所有菌株重复性试验所用模板为同一份模板。结果如图11所示，阳性样品各自的3个重复管都几乎同时出峰，扩增曲线几乎重叠，说明Real-LAMP的重复性良好。
4、LAMP的临床标本检测
使用第二套引物UreaseB-2，将临床标本提取的DNA加入实施例1所述的Real-LAMP的反应体系的，按照实施例1所述的Real-LAMP的反应条件进行扩增，分析检测信号，评价该体系的临床应用情况。结果如图12所示，该体系可检测到临床标本，证明该方法体系的建立是可行的。
对扩增产物进行凝胶电泳检测，结果如图13所示，可见，在经过曝光处理后的凝胶显示出：在18个解脲脲原体标本中，检测出16个标本为阳性。
5、实时荧光LAMP与PCR以及固体培养法三种方法的比较
从临床标本中选取出固体培养镜下结果为阳性的标本，用其液体培养基菌液进行核酸提取，进一步使用LAMP法和常规PCR法进行检测。
LAMP法使用如实施例1的第二套引物UreaseB-2，检测体系如实施例1。
常规PCR法使用的引物如表8：
表8
Uu PCR primer 序列(5’to 3’) 引物长度(bp)
Uu forward CAGGATCATCAAATCAATTCAC 22
Uu reverse CATAATGTTCCCCTTCGTCTA 21
反应体系为：
在由2μl模板、各1μl的上游引物和下游引物、0.5U TaKaRa Ex Taq，0.2mmol/L脱氧核苷酸混合物以及10×TaKaRa Ex Taq缓冲液组成的25μl体系中进行PCR；扩增条件用初始变性步骤设定1分钟，然后是30个循环，包括94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，最后延伸在72℃15分钟。扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA的扩增情况。结果如下表9：
表9
在本实验中，和PCR检测的方法相比较，在解脲脲原体的LAMP检测体系中，16株临床标本全部都能够检测出，PCR体系只能检测出14株，说明本发明所述的LAMP检测方法相对于现有的检测方法更有优势。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州医科大学附属第三医院（广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院）
<120> 解脲脲原体的LAMP检测方法及试剂盒
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggagataat gattatatgt cagga 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taacgctatc accagttgtg 20
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caacttggat aggacggtca ccaattagta ccaggagcaa ttaact 46
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attccatcag gtactgctat tcgttttccg ttaactaagc cgtt 44
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctctacctt cgttcatcac aatt 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttagtcggaa cacgtgaagt t 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccagttgt gataccatat agat 24
<210> 8
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tggataggac ggtcaccagt attaattagt accaggagca attaact 47
<210> 9
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttggatagga cggtcaccag tataattagt accaggagca attaact 47
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttggatagga cggtcaccag taattagtac caggagcaat taact 45
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
acttggatag gacggtcacc aaattagtac caggagcaat taact 45
<210> 12
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aattagtacc aggagcaatt aacttcgctg aaggcgaaat tgtgatgaac gaaggtagag 60
aagcaaaagt aatcagcatt aaaaatactg gtgaccgtcc tatccaagtt ggatcacatt 120
tccacttatt tgaaacaaat agtgcattag tattctttga tgaaaaagga aacgaagaca 180
aagaacgtaa agttgcttat ggacgtcgtt tcgatattcc atcaggtact gctattcgtt 240
ttgaaccagg agacaaaaaa gaagtttcag ttattgattt agtcggaaca cgtgaagttt 300
gaggtgtaaa cggcttagtt aacggaa 327

Claims (10)

1.一种解脲脲原体的LAMP检测引物组，其特征在于，所述检测引物组包括：
针对靶基因F3c位点的上游外引物F3，选自：SEQ ID NO.1；
针对靶基因B3c位点的下游外引物B3，选自：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.7；
针对靶基因F2c位点和F1位点的上游内引物FIP，选自：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11；
针对靶基因B2c位点和B1位点的下游内引物BIP，选自：SEQ ID NO.4；
上游环引物 LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
下游环引物 LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的解脲脲原体的LAMP检测引物组，其特征在于，所述检测引物组包括：
上游外引物F3：核苷酸序列为SEQ ID NO.1；
下游外引物B3：核苷酸序列为SEQ ID NO.7；
上游内引物FIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
下游内引物 BIP：核苷酸序列为SEQ ID NO.4；
上游环引物 LoopF：核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
下游环引物 LoopB：核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
3.一种解脲脲原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包含有权利要求1或2所述的LAMP检测引物组。
4.根据权利要去3所述的解脲脲原体的LAMP检测试剂盒，其特征在于，还包括：dNTPs、引物工作液、缓冲液、甜菜碱、Mg2+溶液、荧光染料和DNA聚合酶中的至少一种。
5.一种非诊断目的的解脲脲原体的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的DNA；
(2)以待测样品的DNA为模板，以权利要求1～3任一项所述的LAMP检测引物组为引物，进行实时荧光LAMP反应。
6.根据权利要求5所述的解脲脲原体的LAMP检测方法，其特征在于，在实时荧光LAMP反应体系中，所述检测引物组的浓度比上游内引物FIP：下游内引物BIP：上游外引物F3：下游外引物B3：上游环引物LOOPF、下游环引物LOOPB为(7～9)∶(7～9)∶1∶1∶(3～5)∶(3～5)。
7.根据权利要求6所述的解脲脲原体的LAMP检测方法，其特征在于，所述检测引物组的浓度比上游内引物FIP：下游内引物BIP：上游外引物F3：下游外引物B3：上游环引物LOOPF、下游环引物LOOPB为8∶8∶1∶1∶4∶4。
8.根据权利要求5～7任一项所述的解脲脲原体的LAMP检测方法，其特征在于，所述实时荧光LAMP反应体系，按每25μl计，包括：
9.根据权利要求8所述的解脲脲原体的LAMP检测方法，其特征在于，所述扩增反应液包括：dNTP、反应缓冲液、MgSO4和甜菜碱；和/或
所述实时荧光LAMP反应体系中：
所述上游内引物FIP的终浓度为1～2μmol/L；和/或
所述下游内引物BIP的终浓度为1～2μmol/L；和/或
所述上游外引物F3的终浓度为0.1～0.3μmol/L；和/或
所述下游外引物B3的终浓度为0.1～0.3μmol/L；和/或
所述上游环引物LOOPF的终浓度为0.7～0.9μmol/L；和/或
所述下游环引物LOOPB的终浓度为0.7～0.9μmol/L。
10.根据权利要求5～7任一项所述的解脲脲原体的LAMP检测方法，其特征在于，所述实时荧光LAMP反应的反应程序为：63±1℃15s，63±1℃45s作为一个循环，做50～70个循环，95±1℃15s终止反应，于63±1℃45s处收集荧光信号。
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