CN109402227A - 一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人基质金属蛋白酶1的试剂盒 - Google Patents

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杨培浩
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Abstract

本发明为一种实时荧光定量RT‑PCR检测人基质金属蛋白酶1的试剂盒，该试剂盒以mRNA为模板，使反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免了交叉污染，并可以精确定量检测标本中人基质金属蛋白酶1 (MMP1) 的mRNA表达量。该试剂盒可以用于临床及科研中检测患者结直肠癌手术切除标本中MMP1的表达，用以结直肠癌患者辅助诊断、指导治疗是否存在肝转移的指标。

Description

一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人基质金属蛋 白酶1的试剂盒
技术领域
本发明属生物技术领域，为一种通过以mRNA为模板，使反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行的检测技术，可以精确定量检测标本中人基质金属蛋白酶1 (MMP1)的mRNA表达量的试剂盒。
背景技术
上世纪中期，随着人们生存居住环境、饮食习惯以及生活水平的不断改变、不断提高，与此同时各类肿瘤的发病率/死亡率也呈逐年上升趋势。结直肠癌的发病率和死亡率仅次于肺癌和乳腺癌，已成为第三恶性肿瘤。结直肠癌具有高度恶性与侵袭性的生物学特性，常发生浸润、转移，此生物学特性是导致患者预后较差及死亡率较高的一个重要因素。结直肠癌的发生、发展是与多基因相关、多因素相互影响、多步骤、错综复杂循序渐进的过程；然而其诊治关键要点与大多数肿瘤一样，在于早期发现、早期诊断、早期治疗。临床研究表明，早期结直肠癌的手术治愈率可以达到 80%-90%，然而结直肠癌患者常常因早期缺乏特异性的临床症状与体征，不易引起患者足够的重视，难以在患病早期及时的发现并行手术治疗。多数结直肠癌患者在发现时已是中期，甚至是晚期，即使行手术治疗，也难以达到患者理想的效果，术后复发转移率较高，生存期也较短，预后不佳。近几年，以消化道内镜结合病理学检查为主的诊断方法在临床上广泛应用，但是针对我国目前医疗现状来说，暂不适合大规模消化内窥镜筛查，进而导致早期行手术治疗率较低。临床发现中晚期结直肠癌患者即使进行手术治疗，也有 30%-40%的患者术后出现复发或转移播散，复发和转移目前导致结直肠癌患者死亡最主要原因之一。近年来，结直肠癌治疗及手术方案有了明显的改善与进步，同时各种后期治疗手段如：放、化疗在不断更新与完善，生物治疗、基因治疗等新方法不断涌现。血循环中存活的肿瘤细胞是远处转移和复发的基础，尽管各种结直肠癌的各种检测方法不断的增多，然而这一类细胞数量极微，不易被临床常规手段检测出来。近年来，通过逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术检测外周血中微量循环肿瘤细胞(Circulatingtumor cell，CTC) 已成为可能并被尝试。
基质金属蛋白酶是一种细胞外基质肽链内切酶,所有基质金属蛋白酶含有共同的一个保守序列,这也是与金属离子结合的部位,其催化活性依赖于酶活性中心与金属锌离子的结合。基质金属蛋白酶最初都是细胞分泌的以无活性的酶的前体形式存在,只有通过被激活才能发挥作用。研究发现：基质金属蛋白酶1 (MMP1)在结直肠癌患者体内的表达量增加，而检测原发结直肠癌患者同时伴有肝转移者时，发现MMP1的表达量增高更加明显。一步法荧光定量PCR技术使反转录和PCR扩增在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免交叉污染，节省实验时间。具有方便、便捷、重复性好等特点。
发明内容
本发明试剂盒包含：逆转录聚合酶链反应液 (RT-PCR反应液)、莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV) 逆转录酶、RNA酶抑制剂 (Rnasin)、耐热性DNA聚合酶 (Taq DNA聚合酶)、标准品、阴阳性对照品。
其中逆转录聚合酶链反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、逆转录聚合酶链缓冲液、寡聚(dT)15-18(Oligo(dT)15-18)、dNTPs、MgCl2、检测用上下游引物、荧光探针。
检测用引物分检测用上游引物和检测用下游引物：
上游引物序列为：5’—GGTGCAGTGGCTCACACTTG—3’，
下游引物序列为：5’—GGCTGGAGTGTAGTGGTACAATCTT—3’，
荧光探针序列为：5’—FAM—CCTGTCTCTACTAAAAGTACA—TAMRA—3’
标准品序列为：
GGTGCAGTGGCTCACACTTGTAATCGCAGCACTTTGGGAGGCGGAGGCGGGGGAATCATTTGAGATCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAATATGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAAGTACAAAAATTAGCTGGGCGTGTTGGCCTGTACCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCCTTGAATCTGGGAGGCAGAGGTTGCTCTGAGCCAAGATTGTACCACTACACTCCAGCC。
阴阳性对照品中，阴性对照品为无MMP1 mRNA的RNA样品，阳性对照品为有人基质金属蛋白酶1 (MMP1) mRNA的RNA样品。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明建立了一步法实时荧光定量逆转录聚合酶链反应技术检测MMP1表达的方法，反应过程中无需打开管盖，避免交叉污染，节省实验时间。在本检测项目中，我们采用了特异性荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下尽量减少假阳性干扰，使被检测基因的特异性大大提高。并经检测患者标本，表明该方法切实可行。本方法所设计的引物、探针以及检测结果，可以为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。
本发明试剂盒使用方法：
每次检测均应设立阳性对照品和阴性对照品。标准品用1×TE buffer 稀释为1×102-1×107拷贝/ml。
逆转录聚合酶链扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总体积50μl，其中逆转录聚合酶链反应液46.5μl，检测样品 (mRNA、标准品、阳性或阴性对照) 2μl，莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV) 逆转录酶0.5μl，RNA酶抑制剂 (Rnasin) 0.5μl，耐热性DNA聚合酶 (TaqDNA聚合酶) 0.5μl。反应条件：45℃逆转录30分钟，95℃预变性5分钟， 95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒共40个循环，72℃延伸10分钟。根据所获得的标准曲线，计算得到各待测标本中MMP1的量 (拷贝数/ml)。
附图说明
图1为实时荧光定量RT-PCR标准品检测。
图2为实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
一步法荧光定量RT-PCR法检测MMP1的表达。
一、材料：
Trizol试剂及限制性内切酶均购自美国invitrogen公司，pGEM-T-Easy克隆载体、M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、Oligo(dT)15-18购自美国Promega公司，ABI7500型定量PCR仪为美国ABI公司产品。
二、引物及探针设计与合成：
以MMP1全长cDNA序列 (GenBank登录号AY769434.1) 为模板，使用Primer ExpressTM (V3.0，美国ABI公司) 软件分析TaqMan引物和探针位点，并根据同时考虑MMP1基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合。本发明标准品的引物和检查用引物为相同引物。
上游引物序列为
5’—GGTGCAGTGGCTCACACTTG—3’，
下游引物序列为
5’—GGCTGGAGTGTAGTGGTACAATCTT—3，
荧光探针序列为
5’—FAM—CCTGTCTCTACTAAAAGTACA—TAMRA—3’，均由大连宝生物技术公司合成。
三、标准品制备
患者的新鲜手术标本立即液氮冻存，并于液氮存在下于研钵中磨碎后用Trizol试剂提取总RNA，取2.5μl RNA，在50μl 逆转录聚合酶链反应体积内，用上下游引物在ABI 7500型PCR仪上进行PCR扩增，条件为45℃逆转录30分钟，95℃预变性5分钟， 95℃ 30秒、60℃ 30秒、 72℃ 30秒共30个循环，72℃延伸10分钟后置4℃。
PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆送上海生工公司进行测序验证。测序成功之后提取克隆载体质粒，即为标准品。测定浓度并换算成 (拷贝数/体积)。
实施例2
荧光定量RT-PCR法检测MMP1的应用。
一、标本检测
8例经病理确诊的恶性结直肠癌肿瘤患者手术切除标本，分离手术切除标本，经PBS洗涤后离心收集用Trizol试剂提取标本总RNA，取2.5μl RNA，在50μl 逆转录聚合酶链反应体积内，用上下游引物在ABI 7500型PCR仪上进行PCR扩增，条件为45℃逆转录30分钟，95℃预变性5分钟， 95℃ 30秒、60℃ 30秒、 72℃ 30秒共40个循环，72℃延伸10分钟后置4℃。同时加标准品检测作标准曲线。测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测标本的MMP1表达量。
二、样品检测结果
标准品检测结果参见图1.标准曲线参见图2。
8例患者手术切除标本检测结果如下表
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上诉内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
GGTGCAGTGGCTCACACTTGTAATCGCAGCACTTTGGGAGGCGGAGGCGGGGGAATCATTTGAGATCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAATATGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAAGTACAAAAATTAGCTGGGCGTGTTGGCCTGTACCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCCTTGAATCTGGGAGGCAGAGGTTGCTCTGAGCCAAGATTGTACCACTACACTCCAGCC

Claims (4)

1. 一种通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人基质金属蛋白酶1的试剂盒，含有逆转录聚合酶链反应液、莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV) 逆转录酶、RNA酶抑制剂、耐热性DNA聚合酶、标准品及阴阳性对照品。
2.其特征是：逆转录聚合酶链反应液含有焦炭酸二乙酯处理的水、逆转录聚合酶链反应缓冲液、寡聚(dT)15-18、dNTPs、MgCl2、检测用上游引物、检测用下游引物、荧光探针，其中：
检测用上游引物序列为
5’—GGTGCAGTGGCTCACACTTG—3’，
检测用下游引物序列为
5’—GGCTGGAGTGTAGTGGTACAATCTT—3，
荧光探针序列为
5’—FAM—CCTGTCTCTACTAAAAGTACA—TAMRA—3’
标准品序列为
AAAAATTAAATTATAGGCCAGGTGCAGTGGCTCACACTTGTAATCGCAGCACTTTGGGAGGCGGAGGCGGGGGAATCATTTGAGATCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGCCAATATGGTGAAACCCTGTCTCTACTAAAAGTACAAAAATTAGCTGGGCGTGTTGGCCTGTACCTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCCTTGAATCTGGGAGGCAGAGGTTGCTCTGAGCCAAGATTGTACCACTACACTCCAGCCTGGGTGAGAGAGTGAGACTCTGTCTCAAAAAAGTAAATAAATAAAAAAGAGATAAAACTTAAAT。
3.如权利要求1所述的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测人基质金属蛋白酶1的试剂盒，其特征是：一、反转录和实时荧光定量PCR在同一反应体系中进行，反应过程中无需打开管盖，避免了交叉污染。
4.二、对照品分阴性对照品和阳性对照品，其中阴性对照品为无人基质金属蛋白酶1mRNA的RNA样品，阳性对照品为有人基质金属蛋白酶1 (MMP1) mRNA的RNA样品。
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