CN107881216A - 一种抗衰老护肤品定制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗衰老护肤品定制方法，包含以下步骤：步骤1，采集用户细胞样本；步骤2，提取细胞样本中的mRNA；步骤3，将mRNA反转录合成cDNA；步骤4，检测cDNA中衰老相关基因的多态性及对应cDNA的表达量，衰老相关基因包含MMP9、NQO1、SOD1、FOXO4中的至少一种；步骤5，依据基因多态性及对应cDNA表达量判断抗衰老能力，并针对抗衰老能力选择抗衰老护肤品成分及用量，配制合适的抗衰老护肤品。该方法通过测量衰老相关基因的表达量获得不同用户的抗衰老能力，并依据用户具体抗衰老能力配制适合的抗衰老护肤品。
Description
技术领域
本发明涉及一种护肤品技术领域，特别涉及一种抗衰老护肤品定制方法。
背景技术
随着科学技术的发展，人类的全基因谱图已经可以通过测序获得。当前大量的研究表明，人类皮肤的状态与基因有着密切的关系。这些衰老相关基因中特定位点的基因型(或基因单核苷酸多态性，SNPs，简称基因多态性)可以很大程度上影响着皮肤的状态，不同的基因型是导致皮肤出现问题的关键因素。人们可以通过检测不同基因型，发现或预测皮肤的问题，并以此作为指导选择合适的抗衰老护肤品。进一步研究发现，除基因型外，由基因型导致的表达蛋白才是导致皮肤问题的关键因素。
目前市场上存在着大量具有不同功能的护肤和美容产品供人们选择。但是每个个体的皮肤都具有其独特性，例如，不同人皮肤的衰老水平以及抗衰老能力均不相同。如何选择适合自己的抗衰老护肤品就是人们面临的一个重要问题。当前消费者普遍选用的方法就是采用选择-购买-尝试的方式验证抗衰老护肤品是否适合自己，在此过程中消费者不仅浪费了大量的时间和财力，而且还可能会造成皮肤的不适。因此如何选择适合消费者个体的抗衰老护肤品，成为亟待解决的一个重要问题。
发明内容
本发明提供抗衰老护肤品定制方法，该方法通过测量衰老相关基因的多态性及对应cDNA的表达量获得不同用户的抗衰老能力，并依据用户具体抗衰老能力配制适合的抗衰老护肤品。
依据本发明的一种抗衰老护肤品定制方法，包含以下步骤：
步骤1，采集用户细胞样本；
步骤2，提取细胞样本中的mRNA；
步骤3，将mRNA反转录合成cDNA；
步骤4，检测cDNA中衰老相关基因的多态性及对应cDNA的表达量，其中，衰老相关基因包含MMP9、NQO1、SOD1、FOXO4中的至少一种；
步骤5，依据基因多态性及对应cDNA的表达量判断抗衰老能力，并针对抗衰老能力选择成分及用量，配制合适的抗衰老护肤品。
进一步地，步骤4包含：
步骤4a)，在NCBI上查找衰老相关基因的mRNA序列，并设计相应引物；
步骤4b)，采用delta-deltaCt法，以基因GAPDH为内参，通过引物检测衰老相关基因的多态性及对应cDNA的相对表达量。
3.如权利要求2的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，引物包含：
GAPDH Forword：5’-CGGGAAACTGTGGCGTGATG-3’
Reverse：5’-ATGACCTTGCCCACAGCCTT-3’
MMP9 Forword：5’-CGGCCACTACTGTGCCTTTG-3’
Reverse：5’-GGTTCCCAATCTCCGCGATG-3’
NQO1 Forword：5’-GGACGTCCTTCAACTATGCCATGA-3’
Reverse：5’-CGACTCCACCACCTCCCATC-3’
SOD1 Forword：5’-GTCCTCGGAACCAGGACCTC-3’
Reverse：5’-AATTGATGATGCCCTGCACTGG-3’
FOXO4 Forword：5’-GTCAGCAGGAGAAGGGTGCT-3’
Reverse：5’-TGGCGTATCAGAGGTGAGCAG-3’。
进一步地，抗衰老护肤品的成分包含抗氧化剂、多肽以及助剂。
进一步地，抗氧化剂包含褐藻提取物、人参提取物、人参皂甙、五倍子提取物、茶多酚、灵芝多糖、海藻多糖、树莓提取物、白藜芦醇、鳄梨油，葡萄籽油、虾青素、阿魏酸、辅酶Q10、N-乙酰半胱氨酸、姜黄素、丹参酮IIA、光甘草定、硫辛酸的一种或多种。
进一步地，多肽包含丙氨酸/组氨酸/赖氨酸多肽铜HCl、大豆(GLYCINEMAX)多肽、二肽-1、二肽-2、二肽-4、寡肽-1、寡肽-2、寡肽-3、寡肽-4、寡肽-5、寡肽-6、寡肽-29、寡肽-34、肌肽、酵母菌多肽类、精氨酸/赖氨酸多肽、九肽-1，聚(三肽-6)、抗坏血酸多肽、枯草菌脂肽钠、六肽-1，2，3，5，9，11、七肽-6、肉豆蔻酰六肽-5、肉豆蔻酰五肽-4、三肽-1，2，3，10，32、三肽-1铜、十肽-4、四肽-1，3，4、五肽-1，3，34、燕麦肽、野大豆肽、乙酰基八肽-3、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基六肽1，7，8、乙酰基七肽-4、乙酰基四肽2，3，5，9，11、棕榈酰二肽-7、棕榈酰六肽-12，14，15、棕榈酰三肽-1，5，8、棕榈酰四肽-5，7，10、棕榈酰五肽-4，5中的一种或几种的组合。
进一步地，助剂包含第一组保湿剂，第二组保湿剂，油脂，机溶剂，防腐剂，增溶剂，增稠剂，皮肤调理剂，螯合剂，芳香剂，抗敏剂以及水。
进一步地，步骤5包含：
步骤5a)针对用户皮肤状态选择护肤品适当质量比的第一组保湿剂，第二组保湿剂，油脂，有机溶剂，防腐剂，增溶剂，增稠剂，皮肤调理剂，螯合剂，抗氧化剂，多肽类，芳香剂，抗敏剂以及水；
步骤5b)将增溶剂、抗氧化剂、油脂、有机溶剂和芳香剂在乳化机内超速搅拌混合，制的混合物A；
步骤5c)将第一组保湿剂放入搅拌锅内搅拌溶解，制的混合物B；
步骤5d)将第二组保湿剂、螯合剂、增稠剂加入搅拌锅内，边搅拌边升温至85-95℃，使其充分溶解，保温15-20分钟，制的混合物C；
步骤5e)将混合物C降温至40-45℃，依次加皮肤调理剂、抗敏剂和多肽，搅拌溶解，制的混合物D；
步骤5f)在保持温度40-45℃下，向混合物D内加入防腐剂，混合物A、混合物B、充分搅拌，降至室温，出料、静置。
进一步地，抗衰老护肤品的成分及质量比为：第一组保湿剂2-5重量份，第二组保湿剂3-10重量份，油脂3-12重量份，有机溶剂2-6重量份，防腐剂0.2-0.6重量份，增溶剂3-8重量份，增稠剂0.5-3重量份，皮肤调理剂4-5重量份，螯合剂0.1-0.5重量份，抗氧化剂3-5重量份，多肽类0.3-2.5重量份，芳香剂0.01-0.03重量份，抗敏剂0.1-4重量份，水50-70重量份。
进一步地，抗衰老护肤品的成分及质量比为：第一组保湿剂2重量份份，第二组保湿剂4重量份，油脂3重量份，有机溶剂2重量份，防腐剂0.2重量份，增溶剂8重量份，增稠剂0.5重量份，皮肤调理剂5重量份，螯合剂0.15重量份，抗氧化剂5重量份，多肽类2.4重量份，芳香剂0.02重量份，抗敏剂0.4重量份，水67重量份。
由于采用于上技术方案，本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)依据本发明的定制方法实现一人一配方，针对不同用户的具体抗衰老能力配制具有个人专属配方的抗衰老护肤品。
(2)衰老相关基因多态性及其对应的cDNA的表达量作为导致皮肤呈现不同衰老状态的根本原因能够更精确的表征抗衰老能力，本发明依据衰老相关基因多态性及其对应的cDNA的表达量来判断抗衰老能力，相比于现有技术中的图像分析、面部扫描等检测方法获得的检测结果更精确。
(3)依据本发明的定制方法选用口腔黏膜细胞或面部皮肤脱落细胞作为样本检测衰老相关基因多态性及其对应的cDNA的表达量，可以保证皮肤免受激光或药物导致的外界刺激，安全可靠。
(4)依据本发明的定制方法制备的抗衰老护肤品多采用天然动植物提取物及多肽为原料，对皮肤温和无刺激，并且抗衰老护肤品可以具有其他功效的护肤品配合使用，护肤效果佳。
(5)依据本发明的定制方法制备的护肤品致力于改善用户自身的抗衰老敏能力，相比于依赖外部补水、增色等现有护肤品而言，能够从根本上解决用户的皮肤问题。
(6)本发明实现了MMP9、NQO1、SOD1、FOXO4等基因在护肤品领域内的新应用。
附图说明
于附图所示的具体实施例，其目的用于阐述本发明。然而，应明了的是，本发明并不局限于所示的较佳具体实施例。
于图式中：
图1是依据本发明的抗衰老护肤品定制方法一实施例的示意图。
具体实施方式
除非另有定义，所有于此处所使用的技术性及科学性术语具有的意义，对于属于本发明的技术领域中技术人员为常识。当于此处使用时，以下术语具有其所属的意义，除非另有特别定义。
基因表达(geneexpression)”是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。同一基因在不同组织能生成不同的基因产物来源于不同组织的类似蛋白，可以由同一基因编码产生，这种现象首先是由于基因中的增强子等有组织特异性，它能与不同组织中的组织特异因子结合，故在不同组织中同一基因会产生不同的转录物与转录后加工作用。
“基因多态性”是指以适当频率在一个群体的某个特定遗传位点(基因序列或非基因序列)发生两种或两种以上变异的现象，可通过直接分析DNA或基因产物来确定。从本质上讲，多态性的产生在于基因水平上的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。
“聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)”是将RNA的反转录(reversetranscription)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。该方法利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。实时PCR(real-timePCR)，属于定量PCR(Q-PCR)的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
如图1所示，依据本发明的抗衰老护肤品定制方法主要包含以下步骤：
步骤1，采集用户细胞样本。该细胞样本可以使口腔黏膜上皮细胞、面部皮肤脱落细胞或者其他能够提取到用户基因的细胞。
在本发明的实施例中，采集口腔黏膜上皮细胞的具体步骤包含(1)采集前准备：清水漱口，需要注意的是，为了保证细胞样品不受污染，采集口腔黏膜细胞前的半个小时，尽量不要饮用含有咖啡因的饮品、含有碳酸的饮料或者果汁等；(2)采集口腔黏膜上皮细胞：打开口腔拭子包装，先做吞咽动作，之后将口腔拭子伸进口腔，紧靠脸颊内侧来回刮试20次，取出口腔拭子，并做好标记，立即提取基因组DNA或者放于已经加有0.5ml口腔拭子基因组DNA保存液(百奥莱博，货号：BTN80802)的1.5ml离心管中保存。
在本发明的另一实施例中，采集面部皮肤脱落细胞的具体步骤包含(1)采集前准备：清水洗脸，需要注意的是，为了保证细胞样品不受污染，被测试者用卸妆油卸去所有使用的化妆品残留；(2)采集面部脱落皮肤细胞：等待面部干燥后，用细胞粘取器在面部反复的粘取面部的皮肤细胞(若采集的细胞过少，可以多用几个粘取器采集细胞)。粘取完毕后妥善保存，避免污染。注意做好标记，防止混淆样本。
步骤2，提取细胞样本中的mRNA。本发明的实施例采用QIAGEN公司的RNeasyPlusMicroKit(货号：74034)进行总RNA提取，具体步骤如下：
a)针对口腔黏膜上皮细胞样品，将口腔拭子放入RNase-free的1.5ml离心管中，剪去口腔拭子柄部，留药棉头于离心管中；针对面部皮肤脱落细胞样品，用镊子将细胞粘取器上已粘有皮肤细胞的胶膜撕下，放入RNase-free的1.5ml离心管中(注意：每个样本使用一个镊子，避免样本之间的污染)。加入350μl的RLT缓冲液裂解细胞，涡旋1min混匀。
b)将上一步中的细胞裂解液加到试剂盒提供的去除gDNA的离心柱中，>10，000rpm离心30s。丢掉离心柱，保留滤过液。
c)在滤过液中加入等体积(通常为350μl)的70％乙醇混匀。
d)将上一步的样品(包括形成的沉淀)转移到试剂盒中提供的RNeasyMinElute离心柱中，>10，000rpm离心15s，弃滤过液。
e)向RNeasyMinElute离心柱中加入700μl缓冲液RW1，>10，000rpm离心15s，弃滤过液。
f)向RNeasyMinElute离心柱中加入500μl缓冲液RPE，>10，000rpm离心15s，弃滤过液。
g)向RNeasyMinElute离心柱中加入500μl80％乙醇，>10，000rpm离心2min，弃滤过液。
h)将RNeasyMinElute离心柱转移到试剂盒提供的新的2ml收集管中，开盖最大转速离心5min。弃收集管及其中的滤过液。
i)将RNeasyMinElute离心柱转移到试剂盒提供的新的1.5ml离心管中，向离心柱中央加入14μl的RNase-freewater，静置2min后，最高转速离心1min，离心管内即为提取的RNA。
j)采用NanoDrop(Thermo)分光光度计测定RNA的浓度和质量(A260/A280)，立即取1μgRNA进行反转录或者将提取的RNA于-80℃保存。
步骤3，将mRNA反转录合成cDNA。本发明的实施例采用TOYOBO公司的ReverTraAceqPCRRTMasterMixwithgDNARemover(货号：FSQ-301)进行cDNA的合成。具体操作步骤如下：
a)4xDNMasterMix与gDNARemover的混合：在整管4xDNMasterMix(440μl)中添加8.8μl(1/50量)的gDNARemover，颠倒混匀。添加gDNARemover后的4xDNMasterMix在-20℃条件下至少可保持3个月的稳定。
b)RNA的变性：把1μgRNA在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。
c)去除基因组DNA反应(DNase反应)：其中，在冰上配制如下反应液。
将反应液轻轻地搅拌均匀后，在37℃条件下温育5分钟。
d)逆转录反应：其中，在冰上配制如下反应液。
将反应液轻轻地搅拌均匀后，按以下温度进行反应。
反应结束后，-20℃条件下保存。Real-timeRTPCR时，作为模板稀释10倍后添加。
步骤4，检测cDNA中衰老相关基因的多态性及对应cDNA的表达量。
在本发明的实施例中，衰老相关基因可以包含MMP9、NQO1、SOD1、FOXO4、等基因中的一种或几种的组合。
MMP9(matrixmetallopeptidase9，基质金属蛋白酶9)为衰老相关基因，其位于染色体20q13.12位置，基因全长7.65kb，具有13个外显子，属于基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotein，MMP)家族。MMP9的mRNA全长2336nt，共有13个外显子，编码由707个氨基酸残基组成的蛋白。基因功能：MMP9是一类由Zn2+依赖性的内肽酶组成的酶家族，对细胞外基质成分有特异的降解作用，可降解I、II、III、VII、X型胶原蛋白及蛋白多糖。通过对人体皮肤内胶原蛋白含量的检测发现，MMP9高表达的人皮肤内胶原蛋白的含量明显低于MMP9低表达的人，该基因的表达蛋白量增加则标志着皮肤进入了衰老阶段。
NQO1(醌氧化还原酶)为衰老相关基因，其位于第16号染色体16q22.1位置，基因全长19.96kb，共有6个外显子。NQO1的mRNA全长2912nt，编码由274个氨基酸残基组成的蛋白。基因功能：NQO1基因编码的蛋白是人体代谢的一种关键酶，该酶是细胞内的一种保护性还原酶，能够保护细胞免受外界醌类物质和氧化损伤，比如将苯醌转化为低毒性的氢醌和羟基化合物，从而避免亲和性醌类对细胞DNA的损伤，保证机体的正常生理功能。因此NQO1控制着人体内抗氧化的保护，即，该基因表达量越高其抗氧化能力越强，越不易衰老。
SOD1(超氧化物歧化酶)为衰老相关基因，其位于第21号染色体21q22.11位置，基因全长9.31kb，共有5个外显子。SOD1的mRNA全长966nt，编码由154个氨基酸残基组成的蛋白。基因功能：SOD1基因是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的大量的活性氧自由基，阻止黑色素和色斑的形成。因此SOD1控制着人体内抗氧化的保护，即，该基因的表达量越高，越不易衰老。
FOXO4(F盒蛋白)为衰老相关基因，其位于第X号染色体Xq13.1位置，基因全长7.34kb，共有3个外显子。FOXO4的mRNA全长3365nt，编码由505个氨基酸残基组成的蛋白。基因功能：FOXO4是一种E泛素连接酶，其包含有一类IIPDZ结构域，其与靶蛋白C端的特定序列相互作用，在肌肉中过表达可导致肌肉萎缩。因此FOXO4与皮肤皱纹形成有关，即，该基因的表达量越高，越容易形成皱纹。
本发明的实施例采用real-timeRTPCR检测相关基因的量，具体步骤如下：
a)NCBI上查找相关基因的mRNA序列，并设计相应引物。
本发明的实施例以基因GAPDH为内参，即，设定GAPDH基因表达量为1，采用delta-deltaCt法对上述衰老相关基因进行相对定量分析。GAPDH及衰老相关基因的引物序列如表1所示：
表1
表1所示各基因的扩增片段序列如表2所示：
表2
b)采用的是TOYOBO公司的SYBRGreenRealtimePCRMasterMix(货号：QPK-201)进行检测，采用Roche公司的96上机检测。
反应液的配制方案如表3所示：
表3
PCR的循环条件如表4所示：
表4
c)数据分析：分析溶解曲线为单峰，说明引物的特异性很好，可以用于后续实验；若溶解曲线为非单峰，说明引物的特异性不好，需要重新设计引物；每个样本，每对引物进行三次重复，减小操作过程中的误差；以GAPDH为内参，即，设定GAPDH基因表达量为1，采用delta-deltaCt法进行相对定量分析。
步骤5，依据衰老相关基因的表达量判断抗衰老能力，并针对用户抗衰老能力选择
抗衰老护肤品成分及用量，配制合适的抗衰老护肤品。
抗衰老护肤品中特定含量的效成分可以对不同种类的基因表达量进行调控，从而实现改善肤质的目的。例如，针对MMP9、NQO1、SOD1、FOXO4等衰老相关基因表达量进行调控的抗氧化剂包含灵芝多糖、人参提取物、人参皂甙、茶多酚、褐藻提取物、辅酶Q10、姜黄素、五倍子提取物中的一种或多种作为抗氧化剂。而多肽则可以通过调节皮肤中与衰老基因表达相关的信号通路实现调控蛋白表达的目的。
基于上述原理，依据本发明的抗衰老护肤品总体包含抗氧化剂、多肽以及助剂。其中，助剂可以包含第一组保湿剂，第二组保湿剂，油脂，机溶剂，防腐剂，增溶剂，增稠剂，皮肤调理剂，螯合剂，芳香剂，抗敏剂以及水。具体地，针对不同用户配制的抗衰老护肤品总体包含第一组保湿剂2-5重量份，第二组保湿剂3-10重量份，油脂3-12重量份，有机溶剂2-6重量份，防腐剂0.2-0.6重量份，增溶剂3-8重量份，增稠剂0.5-3重量份，皮肤调理剂4-5重量份，螯合剂0.1-0.5重量份，抗氧化剂3-5重量份，多肽类0.3-2.5重量份，芳香剂0.01-0.03重量份，抗敏剂0.1-4重量份，水50-70重量份。其中，
保湿剂包含透明质酸钠，聚谷氨酸，银耳多糖，人参多糖、灵芝多糖、丙二醇，二丙二醇、丁二醇，甘油的一种或多种，其中保湿剂依据制备过程中添加顺序的不同分为第一组保湿剂和第二组保湿剂；
油脂包含橄榄油，白油，凡士林，石蜡油，杏仁油，角鲨烷，坚果油，霍霍巴油，牛油果树果脂油的一种或多种；
有机溶剂包含十二烷醇，十六烷醇，十八烷醇，二十二烷醇，鲸蜡醇的一种或多种；
防腐剂包含羟苯丙酯，碘丙炔醇丁基氨甲酸酯，2-苯氧基乙醇，尼泊金甲酯的一种或多种；
增溶剂包含硬脂酸、PEG20氢化蓖麻油，PEG20甘油硬脂酸酯，PEG60氢化蓖麻油，PEG60甘油异硬脂酸酯，聚甘油-10硬脂酸酯，PEG/PPG-17/6共聚物的一种或多种；
增稠剂包含羟乙基纤维素，羧甲基纤维素，羟丙基瓜尔胶，聚合丙烯酸酯类增稠剂的一种或多种；
皮肤调理剂包含积雪草提取物、番茄红素、神经酰胺，卵磷脂，蜂胶提取物、春黄菊提取物、人参根提取物、酵母提取物、鱼腥草提取物的一种或多种；
螯合剂包含EDTA二钠；
抗氧化剂包含褐藻提取物、人参提取物、人参皂甙、五倍子提取物、茶多酚、灵芝多糖、海藻多糖、树莓提取物、白藜芦醇、鳄梨油，葡萄籽油、虾青素、阿魏酸、辅酶Q10、N-乙酰半胱氨酸、姜黄素、丹参酮IIA、光甘草定、硫辛酸的一种或多种；
抗敏剂包含甘草酸二钾、汉防己甲素、洋甘菊提取物、积雪草提取物中的一种或多种；
芳香剂包含玉兰水提物、芦荟水提物、玫瑰水提物中的一种或多种；
多肽，通过调节皮肤中与基因表达相关的信号通路实现调控蛋白表达的目的，包含丙氨酸/组氨酸/赖氨酸多肽铜HCl、大豆(GLYCINEMAX)多肽、二肽-1、二肽-2、二肽-4、寡肽-1、寡肽-2、寡肽-3、寡肽-4、寡肽-5、寡肽-6、寡肽-29、寡肽-34、肌肽、酵母菌多肽类、精氨酸/赖氨酸多肽、九肽-1，聚(三肽-6)、抗坏血酸多肽、枯草菌脂肽钠、六肽-1，2，3，5，9，11、七肽-6、肉豆蔻酰六肽-5、肉豆蔻酰五肽-4、三肽-1，2，3，10，32、三肽-1铜、十肽-4、四肽-1，3，4、五肽-1，3，34、燕麦肽、野大豆肽、乙酰基八肽-3、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基六肽1，7，8、乙酰基七肽-4、乙酰基四肽2，3，5，9，11、棕榈酰二肽-7、棕榈酰六肽-12，14，15、棕榈酰三肽-1，5，8、棕榈酰四肽-5，7，10、棕榈酰五肽-4，5中的一种或几种的组合。
抗衰老护肤品的制备方法总体包含以下步骤：
步骤5a)针对用户抗衰老能力选择抗衰老护肤品适当质量比的保湿剂，油脂，有机溶剂，防腐剂，增溶剂，增稠剂，皮肤调理剂，螯合剂，抗氧化剂，多肽类，芳香剂，抗敏剂以及水；
步骤5b)将增溶剂、抗氧化剂、油脂、有机溶剂和芳香剂在乳化机内超速搅拌混合，制的混合物A；
步骤5c)将第一组保湿剂放入搅拌锅内搅拌溶解，制的混合物B；
步骤5d)将第二组保湿剂、螯合剂、增稠剂加入搅拌锅内，边搅拌边升温至85-95℃，使其充分溶解，保温15-20分钟，制的混合物C；
步骤5e)将混合物C降温至40-45℃，依次加皮肤调理剂、抗敏剂和多肽，搅拌溶解，制的混合物D；
步骤5f)在保持温度40-45℃下，向混合物D内加入防腐剂，混合物A、混合物B、充分搅拌，降至室温，出料、静置。
实施例1
本发明实施例1针对38岁的志愿者1进行基因检测，所检测的基因包含：衰老相关基因MMP9、SOD1、FOXO4。依据检测结果为其配制如下配方的护肤品：其中，护肤品总质量为共50Kg，
第一组保湿剂：人参多糖0.45Kg、透明质酸钠0.05Kg、银耳多糖0.5Kg
第二组保湿剂：丙二醇1kg，丁二醇1kg
油脂：角鲨烷0.5Kg，坚果油0.5Kg，霍霍巴油0.5Kg
有机溶剂：十八烷醇0.5Kg，鲸蜡醇0.5Kg
防腐剂：羟苯丙酯0.05Kg，2-苯氧基乙醇0.05Kg
增溶剂：硬脂酸2Kg，PEG60甘油异硬脂酸酯2Kg
增稠剂：羟丙基瓜尔胶0.25Kg
皮肤调理剂：番茄红素0.5Kg、人参提取物0.5Kg、积雪草提取物0.5Kg、茶多酚1Kg
螯合剂：EDTA二钠0.075Kg
抗氧化剂：白藜芦醇1Kg，鳄梨油1Kg，葡萄籽油0.5Kg
多肽：丙氨酸/组氨酸/赖氨酸多肽铜HCl 0.2Kg，三肽-1铜0.5Kg，棕榈酰三肽-10.5Kg
抗敏剂：甘草酸二钾0.05Kg
芳香剂：玫瑰提取物0.005Kg
其他：水 余量
志愿者1持续100天使用上述配方的抗衰老护肤品后再次进行基因检测，其使用上述抗衰老护肤品前后的基因相对表达量如表5所示：
表5
其中，实施例1-4的参考例为年龄在20岁-30岁的100名志愿者各基因相对表达量的平均值。
表5所示基因的表达量表明，志愿者1在使用抗衰老护肤品之前基因MMP9表达量较高，皮肤已经开始进入衰老阶段。使用上述配方的抗衰老护肤品后，基因MMP9的表达量明显降低，基因SOD1和FOXO4的表达量也得到良性调整，相应地，皮肤衰老程度降低，且抗衰老能力有所提高。
实施例2
本发明实施例2针对43岁的志愿者2进行基因检测，所检测的基因包含：衰老相关基因MMP9、NQD1、FOXO4。依据检测结果为其配制如下配方的护肤品：其中，护肤品总质量为共50Kg，
第一组保湿剂：聚谷氨酸1Kg，银耳多糖0.5Kg
第二组保湿剂：丙二醇1Kg，丁二醇1Kg，甘油2Kg
油脂：橄榄油1Kg，杏仁油0.5Kg，角鲨烷3Kg，牛油果树果脂油1Kg
有机溶剂：十八烷醇1Kg，二十二烷醇0.5Kg，鲸蜡醇1Kg
防腐剂：碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.2Kg
增溶剂：PEG60氢化蓖麻油0.5Kg，PEG60甘油异硬脂酸酯1.5Kg，
增稠剂：聚合丙烯酸酯类增稠剂(冰晶AVC)1.2Kg
皮肤调理剂：卵磷脂1Kg，鱼腥草提取物1Kg
螯合剂：EDTA二钠0.1Kg
抗氧化剂：白藜芦醇1Kg、姜黄素1Kg、葡萄籽油0.5Kg
多肽：乙酰基四肽2 0.2Kg、寡肽-6 0.2Kg
抗敏剂：甘草酸二钾0.1Kg
芳香剂：芦荟水提物0.01Kg
其他：水 余量
志愿者2持续100天使用上述配方的抗衰老护肤品后再次进行基因检测，其使用上述抗衰老护肤品前后的基因相对表达量如表6所示：
表6
| 基因名 | MMP9 | NQD1 | FOXO4 | GAPDH |
| 使用前 | 0.831238 | 1.217004 | 0.961483 | 1 |
| 使用后 | 0.81007 | 1.244531 | 0.869705 | 1 |
| 参考例 | 1.136749 | 2.129877 | 1.523857 | 1 |
表6所示基因的表达量表明，志愿者2在使用抗衰老护肤品之前基因MMP9表达量较低，皮肤尚未开始进入衰老阶段，但基因NQD1的表达量明显低于参考例，显示为皮肤抗衰老能力减弱。使用上述配方的抗衰老护肤品后，基因NQD1的表达量提高，基因MMP9和FOXO4的表达量也得到良性调整，相应地，皮肤衰老程度降低，且抗衰老能力有所提高。
实施例3
本发明实施例3针对52岁的志愿者3进行基因检测，所检测的基因包含：衰老相关基因MMP9、NQD1、FOXO4。依据检测结果为其配制如下配方的护肤品：其中，护肤品总质量为共50Kg，
第一组保湿剂：透明质酸钠1Kg，聚谷氨酸1Kg，银耳多糖0.5Kg，
第二组保湿剂：二丙二醇1Kg、丁二醇0.5Kg
油脂：橄榄油1Kg，石蜡油0.5Kg，角鲨烷2Kg，坚果油1Kg，霍霍巴油0.1Kg
有机溶剂：十八烷醇0.7Kg，二十二烷醇0.8Kg
防腐剂：碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.1Kg
增溶剂：PEG60甘油异硬脂酸酯0.4Kg、聚甘油-10硬脂酸酯1.5Kg
增稠剂：羟丙基瓜尔胶0.5Kg
皮肤调理剂：卵磷脂1Kg，春黄菊提取物1Kg
螯合剂：EDTA二钠0.2Kg
抗氧化剂：茶多酚0.6Kg、五倍子提取物0.7Kg、灵芝多糖0.7Kg
多肽：二肽-1 0.05Kg、二肽-2 0.05Kg、六肽-1 0.08Kg，乙酰基二肽-1鲸蜡酯0.01Kg
抗敏剂：甘草酸二钾0.1Kg
芳香剂：玉兰水提取物0.015Kg
其他：水余量
志愿者3持续100天使用上述配方的抗衰老护肤品后再次进行基因检测，其使用上述抗衰老护肤品前后的基因相对表达量如表7所示：
表7
| 基因名 | MMP9 | NQD1 | FOXO4 | GAPDH |
| 使用前 | 0.911722 | 1.295342 | 1.047294 | 1 |
| 使用后 | 0.85107 | 1.364531 | 0.9589705 | 1 |
| 参考例 | 1.136749 | 2.129877 | 1.523857 | 1 |
表7所示基因的表达量表明，志愿者3在使用抗衰老护肤品之前基因MMP9表达量较低，皮肤尚未开始进入衰老阶段，但基因NQD1的表达量明显低于参考例，显示为皮肤抗衰老能力减弱。使用上述配方的抗衰老护肤品后，基因NQD1的表达量提高，基因MMP9和FOXO4的表达量也得到良性调整，相应地，皮肤衰老程度降低，且抗衰老能力有所提高。
实施例4
本发明实施例4针对40岁的志愿者4进行基因检测，所检测的基因包含：衰老相关基因MMP9、NQD1、SOD1、FOXO4。依据检测结果为其配制如下配方的护肤品：其中，护肤品总质量为共50Kg，
第一组保湿剂：聚谷氨酸1Kg，银耳多糖0.5Kg，人参多糖0.5Kg
第二组保湿剂：二丙二醇1Kg、丁二醇0.5Kg、甘油3Kg
油脂：杏仁油1Kg，角鲨烷1Kg，牛油果树果脂油2Kg
有机溶剂：二十二烷醇1Kg，鲸蜡醇2Kg
防腐剂：碘丙炔醇丁基氨甲酸酯0.3Kg
增溶剂：PEG20氢化蓖麻油1Kg、聚甘油-10硬脂酸酯1Kg
增稠剂：羧甲基纤维素1.1Kg
皮肤调理剂：蜂胶提取物1Kg，神经酰胺1Kg，酵母提取物0.3Kg
螯合剂：EDTA二钠0.1Kg
抗氧化剂：白藜芦醇0.15Kg、葡萄籽油0.15Kg、丹参酮IIA0.2Kg、光甘草定0.2Kg、硫辛酸1Kg
多肽：聚(三肽-6)0.1Kg、抗坏血酸多肽0.1Kg、枯草菌脂肽钠0.1Kg、六肽-1 0.2Kg
抗敏剂：甘草酸二钾1.4Kg、积雪草提取物0.5Kg
芳香剂：玫瑰水提物0.01Kg
其他：水 余量
志愿者4持续100天使用上述配方的抗衰老护肤品后再次进行基因检测，其使用上述抗衰老护肤品前后的基因相对表达量如表8所示：
表8
| 基因名 | MMP9 | NQD1 | SOD1 | FOXO4 | GAPDH |
| 使用前 | 1.023374 | 1.647182 | 0.443396 | 1.583738 | 1 |
| 使用后 | 0.937517 | 2.124231 | 0.55241 | 1.14415 | 1 |
| 参考例 | 1.136749 | 2.129877 | 0.840178 | 1.523857 | 1 |
表8所示基因的表达量表明，志愿者4在使用抗衰老护肤品之前基因MMP9表达量较低，皮肤尚未开始进入衰老阶段，但基因NQD1的表达量明显低于参考例，显示为皮肤抗衰老能力减弱。使用上述配方的抗衰老护肤品后，基因NQD1的表达量显著提高，基因MMP9、SOD1和FOXO4的表达量也得到良性调整，相应地，皮肤衰老程度降低，且抗衰老能力有所提高。
对于该领域技术人员可明了的是，上述具体实施例可于不背离本发明的广义概念下而修改。因此，应明了本发明并非局限于所公开的特定具体实施例，但此意欲包含属于本发明的精神及范畴内的各种变化，即如同所附的权利要求。
SEQUENCE LISTING
<110> 杜立波
<120> 一种抗衰老护肤品定制方法
<130> 1
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH引物1
<400> 1
cgggaaactg tggcgtgatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH引物2
<400> 2
atgaccttgc ccacagcctt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP9引物1
<400> 3
cggccactac tgtgcctttg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP9引物2
<400> 4
ggttcccaat ctccgcgatg 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NQO1引物1
<400> 5
ggacgtcctt caactatgcc atga 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NQO1引物2
<400> 6
cgactccacc acctcccatc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOD1引物1
<400> 7
gtcctcggaa ccaggacctc 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOD1引物2
<400> 8
aattgatgat gccctgcact gg 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FOXO4引物1
<400> 9
gtcagcagga gaagggtgct 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FOXO4引物2
<400> 10
tggcgtatca gaggtgagca g 21
<210> 11
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH扩增片段
<400> 11
cgggaaactg tggcgtgatg gccgcggggc tctccagaac atcatccctg cctctactgg 60
cgctgccaag gctgtgggca aggtcat 87
<210> 12
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MMP9扩增片段
<400> 12
cggccactac tgtgcctttg agtccggtgg acgatgcctg caacgtgaac atcttcgacg 60
ccatcgcgga gattgggaac c 81
<210> 13
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NQO1扩增片段
<400> 13
ggacgtcctt caactatgcc atgaaggagg ctgctgcagc ggctttgaag aagaaaggat 60
gggaggtggt ggagtcg 77
<210> 14
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SOD1扩增片段
<400> 14
gtcctcggaa ccaggacctc ggcgtggcct agcgagttat ggcgacgaag gccgtgtgcg 60
tgctgaaggg cgacggccca gtgcagggca tcatcaatt 99
<210> 15
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FOXO4扩增片段
<400> 15
gtcagcagga gaagggtgct tctccagctc ccaggctctg gaggccctgc tcacctctga 60
ta 62
Claims (10)
1.一种抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1，采集用户细胞样本；
步骤2，提取所述细胞样本中的mRNA；
步骤3，将mRNA反转录合成cDNA；
步骤4，检测cDNA中衰老相关基因的多态性及对应cDNA的表达量，其中，所述衰老相关基因包含MMP9、NQO1、SOD1、FOXO4中的至少一种；
步骤5，依据所述基因多态性及对应cDNA的表达量判断抗衰老能力，并针对所述抗衰老能力选择成分及用量，配制合适的抗衰老护肤品。
2.如权利要求1所述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述步骤4包含：
步骤4a)，在NCBI上查找所述衰老相关基因的mRNA序列，并设计相应引物；
步骤4b)，采用delta-deltaCt法，以基因GAPDH为内参，通过所述引物检测所述衰老相关基因的多态性及对应cDNA的相对表达量。
3.如权利要求2所述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述引物包含：
GAPDH Forword：5’-CGGGAAACTGTGGCGTGATG-3’
Reverse：5’-ATGACCTTGCCCACAGCCTT-3’
MMP9 Forword：5’-CGGCCACTACTGTGCCTTTG-3’
Reverse：5’-GGTTCCCAATCTCCGCGATG-3’
NQO1 Forword：5’-GGACGTCCTTCAACTATGCCATGA-3’
Reverse：5’-CGACTCCACCACCTCCCATC-3’
SOD1 Forword：5’-GTCCTCGGAACCAGGACCTC-3’
Reverse：5’-AATTGATGATGCCCTGCACTGG-3’
FOXO4 Forword：5’-GTCAGCAGGAGAAGGGTGCT-3’
Reverse：5’-TGGCGTATCAGAGGTGAGCAG-3’。
4.如权利要求1所述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述抗衰老护肤品的成分包含抗氧化剂、多肽以及助剂。
5.如权利要求4所述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述抗氧化剂包含褐藻提取物、人参提取物、人参皂甙、五倍子提取物、茶多酚、灵芝多糖、海藻多糖、树莓提取物、白藜芦醇、鳄梨油，葡萄籽油、虾青素、阿魏酸、辅酶Q10、N-乙酰半胱氨酸、姜黄素、丹参酮IIA、光甘草定、硫辛酸的一种或多种。
6.如权利要求4所述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述多肽包含丙氨酸/组氨酸/赖氨酸多肽铜HCl、大豆(GLYCINEMAX)多肽、二肽-1、二肽-2、二肽-4、寡肽-1、寡肽-2、寡肽-3、寡肽-4、寡肽-5、寡肽-6、寡肽-29、寡肽-34、肌肽、酵母菌多肽类、精氨酸/赖氨酸多肽、九肽-1，聚(三肽-6)、抗坏血酸多肽、枯草菌脂肽钠、六肽-1，2，3，5，9，11、七肽-6、肉豆蔻酰六肽-5、肉豆蔻酰五肽-4、三肽-1，2，3，10，32、三肽-1铜、十肽-4、四肽-1，3，4、五肽-1，3，34、燕麦肽、野大豆肽、乙酰基八肽-3、乙酰基二肽-1鲸蜡酯、乙酰基六肽1，7，8、乙酰基七肽-4、乙酰基四肽2，3，5，9，11、棕榈酰二肽-7、棕榈酰六肽-12，14，15、棕榈酰三肽-1，5，8、棕榈酰四肽-5，7，10、棕榈酰五肽-4，5中的一种或几种的组合。
7.如权利要求5所述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述助剂包含第一组保湿剂，第二组保湿剂，油脂，机溶剂，防腐剂，增溶剂，增稠剂，皮肤调理剂，螯合剂，芳香剂，抗敏剂以及水。
8.如权利要求7所述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述步骤5包含：
步骤5a)针对用户皮肤状态选择护肤品适当质量比的所述第一组保湿剂，所述第二组保湿剂，所述油脂，所述有机溶剂，所述防腐剂，所述增溶剂，所述增稠剂，所述皮肤调理剂，所述螯合剂，所述抗氧化剂，所述多肽类，所述芳香剂，所述抗敏剂以及水；
步骤5b)将所述增溶剂、所述抗氧化剂、所述油脂、所述有机溶剂和所述芳香剂在乳化机内超速搅拌混合，制的混合物A；
步骤5c)将所述第一组保湿剂放入搅拌锅内搅拌溶解，制的混合物B；
步骤5d)将所述第二组保湿剂、所述螯合剂、所述增稠剂加入搅拌锅内，边搅拌边升温至85-95℃，使其充分溶解，保温15-20分钟，制的混合物C；
步骤5e)将所述混合物C降温至40-45℃，依次加所述皮肤调理剂、所述抗敏剂和所述多肽，搅拌溶解，制的混合物D；
步骤5f)在保持温度40-45℃下，向所述混合物D内加入所述防腐剂，所述混合物A、所述混合物B、充分搅拌，降至室温，出料、静置。
9.如权利要求8所述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述抗衰老护肤品的成分及质量比为：第一组保湿剂2-5重量份，第二组保湿剂3-10重量份，油脂3-12重量份，有机溶剂2-6重量份，防腐剂0.2-0.6重量份，增溶剂3-8重量份，增稠剂0.5-3重量份，皮肤调理剂4-5重量份，螯合剂0.1-0.5重量份，抗氧化剂3-5重量份，多肽类0.3-2.5重量份，芳香剂0.01-0.03重量份，抗敏剂0.1-4重量份，水50-70重量份。
10.如权利要求9述的抗衰老护肤品定制方法，其特征在于，所述抗衰老护肤品的成分及质量比为：第一组保湿剂2重量份份，第二组保湿剂4重量份，油脂3重量份，有机溶剂2重量份，防腐剂0.2重量份，增溶剂8重量份，增稠剂0.5重量份，皮肤调理剂5重量份，螯合剂0.15重量份，抗氧化剂5重量份，多肽类2.4重量份，芳香剂0.02重量份，抗敏剂0.4重量份，水67重量份。
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