CN112666346A - 一种多重标志物液态芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多重标志物液态芯片及其制备方法，所述液态芯片包括一抗‑微球复合物和二抗‑生物素复合物。所述液态芯片的制备方法包括一抗、二抗的脱盐处理、微球的活化、活化微球与脱盐一抗的交联以及生物素与脱盐二抗的交联四个部分。其中，对于涉及微球的操作步骤种增加了表面活性剂处理，以获得分散均匀的微球。本发明提供的液态芯片微球具有较高的分散度，不易聚集黏结，提高了所述液态芯的检测准确度。
Description
技术领域
本发明涉及生物与新医药技术领域，具体涉及一种多重标志物液态芯片、一种多重标志物液态芯片的制备方法。
背景技术
液态芯片技术也称为悬浮式点阵技术，主要是以美国Luminex公司开发的液态芯片为首，它结合了编码微球、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，具有高通量、高速度、低成本、高灵敏度、高精密度、线性范围广、操作简便等优势，在免疫分析、核酸分析、酶学分析、受体和配体识别等分析中有广泛应用。
液态芯片（Luminex xMap）技术的实现原理是通过把聚苯乙烯微球用荧光染色编码，通过调节两种不同荧光染料的配比来获得高达100多种具有不同荧光特征的荧光光谱微球矩阵，每种微球可以共价交联上特定检测物，在检测时，带有不同特异性检测物的编码微球混合，对微量样本检测，在悬液中靶物质特异性结合后，用特定的流式荧光仪器进行检测，可获得多重检测物质的含量结果。
现有技术中，微球之间非常容易黏结，比如常用的聚苯乙烯微球，因为其粒径小、比表面积大、吸附性强、易于改性和修饰等特点，能够应用于流式荧光法，但是因为聚苯乙烯微球具有很强的吸附性，容易形成大颗粒团，同时也会降低标记在微球上的靶物质含量。
微球功能基团的活化通常需要使用NHS和EDC等酯缩反应试剂，由于基团活化本身就是一个不稳定的过程，各种化学势能都有增加，环境的pH值、盐浓度都会降低活化基团后续的反应活性，此时微球功能基团的均一性会存在不稳定性。
发明内容
针对上述问题，本发明提出一种一抗-微球复合物的制备方法，包括以下步骤：
S10：对一抗进行脱盐处理，得到脱盐一抗；
S20：对微球进行活化操作，得到活化微球；在所述活化操作的过程中，使用含有表面活性剂的缓冲溶液对所述微球进行梯度清洗；
S30：将所述脱盐一抗与所述活化微球混合，并且震荡避温包被得到包被好的复合物，使用TBST磁珠保存液对所述包被好的复合物进行清洗，得到所述一抗-微球复合物。
进一步地，步骤S10中所述对一抗进行脱盐处理，具体包括以下步骤：
S11：使用PBS缓冲溶液对脱盐柱进行清洗；
S12：在所述脱盐柱中加入所述一抗，离心处理得到所述脱盐一抗。
进一步地，所述离心处理为：在1500g的条件下离心1-2min。
进一步地，步骤S20中所述对微球进行活化操作包括以下步骤：
S21：使用MES缓冲液对所述微球进行梯度清洗，得到清洗后的微球；
S22：将NHS和EDC与所述清洗后的微球充分混合，得到待清洗的活化微球；
S23：使用连接缓冲液对所述待清洗的活化微球进行清洗操作，得到所述活化微球。
进一步地，所述微球与NHS和EDC混合的质量比为2000:(18-22):(9-11)。
进一步地，所述MES缓冲液和/或所述连接缓冲液中含有质量浓度为2-5%的表面活性剂。
进一步地，所述微球标记有磁性，更进一步地，所述微球含有荧光标记。
进一步地，所述步骤S30具体包括以下步骤：
S31：将所述脱盐一抗与所述活化微球混合，使用MES缓冲液将所述活化微球稀释至8-12mg/ml，然后用漩涡混合器充分混合，震荡避光包被16-20h，得到包被好的复合物；
S32：使用TBST磁珠保存液将所述包被好的复合物清洗3-5次，得到一抗-微球复合物。
进一步地，所述脱盐一抗与所述活化微球混合的质量比为(0.5-0.7):2。
进一步地，所述TBST磁珠保存液中含有质量分数为2-5%的表面活性剂。
本发明还提供一种多重标志物液态芯片的制备方法，包括以下步骤：
S10：对一抗进行脱盐处理，得到脱盐一抗；
S20：对微球进行活化操作，得到活化微球；
S30：将所述脱盐一抗与所述活化微球进行交联，得到一抗-微球复合物；
S40：对二抗进行脱盐处理，得到脱盐二抗；
S50：将NHS-biotin溶液与所述脱盐二抗混合，室温避光震荡反应4-6h，得到二抗-生物素复合物。
进一步地，所述NHS-biotin溶液的溶剂为DMSO；所述NHS-biotin溶液的浓度为45-55μg/μL；所述NHS-biotin溶液与所述脱盐二抗混合的质量比为(16-18):(0.7-0.8)。
其中，一抗和二抗的选择根据待测蛋白的种类进行挑选。
本发明还提供一种多重标志物液态芯片，由上述方法制备得到，包含一抗-微球复合物和二抗-生物素复合物。
综上所述，本申请上述各个实施例可以具有如下一个或多个优点或有益效果：
1.本发明提供的制备方法在每一个涉及微球的操作中都增加了表面活性剂处理，以获得分散均匀的微球状态，防止微球之间的聚集黏附。
2.本发明提供的制备方法中使用的微球标记有磁性，在后续的使用过程中免去了离心操作，简化了检测步骤，使得操作更加简便。
3.本发明提供的制备方法对现有技术进行了进一步的精简和优化，适合工业化生产。
4.使用本发明实施例制备得到的液态芯片进行检测，所需样品量少，10μL血清即可；检测的精度高，回收率不低于95%。
5.使用本发明实施例制备得到的液态芯片进行批内批间实验，批内实验的变异系数不大于10％，批间实验的变异系数不大于15％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1提供的活化微球的状态。
图2为传统活化过程后微球的状态。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
【实施例1】
本实施例提供一种一抗-微球复合物的制备方法：
1.一抗脱盐处理
S11：使用PBS缓冲液对脱盐柱进行清洗，在1500g下离心1min，并移除缓冲液，重复清洗操作2次；
S12：加入一抗，在1500g下离心2min，得到脱盐一抗。
2.微球活化处理
S21：取2mg微球，使用MES缓冲液进行梯度清洗，用漩涡混合器充分混匀，分离去除上清液，清洗步骤重复2次，得到清洗后的微球；
S22：取38 μL NHS和19μL EDC与所述清洗后的微球混合，在漩涡混合器种旋转1h，得到待清洗的活化微球；其中NHS和EDC的浓度为50mg/ml；
S23：使用连接缓冲液对所述待清洗的活化微球重复清洗3次，得到活化微球。
其中，MES缓冲液和连接缓冲液中含有2%的表面活性剂NP-40。
3.脱盐一抗与活化微球的交联
S31：取640μg脱盐一抗与2mg活化微球吹打混匀，使用MES缓冲液将所述活化微球稀释至10mg/ml，然后用漩涡混合器充分混合，震荡避光包被16h，得到包被好的复合物；
S32：使用TBST磁珠保存液将所述包被好的复合物清洗4次，得到一抗-微球复合物。
S33：将所述一抗-微球复合物用TBST磁珠稀释至500 μg/mL，存放于2℃。
其中，TBST磁珠保存液中含有2%的表面活性剂NP-40。
【实施例2】
本实施例提供一种多重标志物液态芯片的制备方法：
1.通过实施例1提供的制备方法制备得到一抗-微球复合物。
2.二抗脱盐处理
S41：使用PBS缓冲液对脱盐柱进行清洗，在1500g下离心1min，并移除缓冲液，重复清洗操作2次；
S42：加入二抗，在1500g下离心2min，得到脱盐二抗。
3.脱盐二抗与生物素的交联
S51：将5mg NHS-biotin 溶于100μL DMSO，得到NHS-biotin溶液；
S52：取15μL NHS-biotin 溶液和780ug脱盐二抗室温避光震荡反应5h，得到二抗-生物素复合物。
实施例1和实施例2提供的制备方法在微球的活化过程中采用了MES缓冲溶液和连接缓冲液进行了梯度清洗，并且在缓冲液中增加了质量分数为2%的表面活性剂NP-40，进一步提高了微球的分散度，防止黏连。除此之外，对微球标记有磁性，在后续的使用过程中免去了离心操作，简化了检测步骤，使得操作更加简便。
【实施例3】
本实施例提供一种多重标志物液态芯片，由实施例2提供的方法制备得到。
使用本实施例提供的液态芯片进行批内和批间实验，步骤如下：
1.将一抗-微球复合物从冰箱取出，恢复到室温，漩涡混匀，分别吸取20μL加入到96孔板里。
2.每孔加入临床血清样本10μL和稀释液50μL。室温避光震荡反应2小时。
3.每孔加入200μL清洗液，震荡30秒，磁吸附1分钟，吸走上清。
4.每孔加入50μL二抗-生物素复合物。室温避光震荡反应2小时。
5.加入50μL的PE-SA，室温避光震荡反应30分钟。
6.每孔加入200μL清洗液，震荡30s，磁吸附3分钟，吸走上清。
7.每孔加入150μL清洗液，漩涡混匀悬浮磁珠，上机检测。
批内实验检测结果如表1所示：
表1 批内实验检测数据
批间实验检测结果如表2所示：
表2 批间实验检测数据
根据表1和表2的数据可以看出，批内实验的变异系数不超过4.9%，批间实验的变异系数不超过6.8%。
图1为实施例1提供的活化微球的状态，图2为传统活化过程后微球的状态；图中圈出的部分为黏连的微球，可见本发明实施例提供的微球具有更好的分散度，不易聚集。
【实施例4】
本实施例提供一种多重标志物液态芯片的制备方法：
1.抗体脱盐处理
S11：使用PBS缓冲液对脱盐柱进行清洗，在1500g下离心1min，并移除缓冲液，重复清洗操作3次；
S12：加入单抗，在1500g下离心2min，得到脱盐单抗。
所述单抗包括一抗和二抗，对应得到的脱盐一抗用于交联微球，脱盐二抗用于交联生物素。
2.微球活化处理
S21：取2mg微球，使用MES缓冲液进行梯度清洗，用漩涡混合器充分混匀，分离去除上清液，清洗步骤重复2次，得到清洗后的微球；
S22：取40 μL NHS和20μL EDC与所述清洗后的微球混合，在漩涡混合器种旋转1h，得到待清洗的活化微球；其中NHS和EDC的浓度为50mg/ml；
S23：使用连接缓冲液对所述待清洗的活化微球重复清洗3次，得到活化微球。
其中，MES缓冲液和连接缓冲液中含有5%的表面活性剂TritonX-100。
3.脱盐一抗与活化微球的交联
S31：取600μg脱盐一抗与2mg活化微球吹打混匀，使用MES缓冲液将所述活化微球稀释至10mg/ml，然后用漩涡混合器充分混合，震荡避光包被20h，得到包被好的复合物；
S32：使用TBST磁珠保存液将所述包被好的复合物清洗4次，得到一抗-微球复合物。
S33：将所述一抗-微球复合物用TBST磁珠稀释至500 μg/mL，存放于8℃。
其中，TBST磁珠保存液中含有5%的表面活性剂TritonX-100。
4.脱盐二抗与生物素的交联
S51：将5mg NHS-biotin 溶于100μL DMSO，得到NHS-biotin溶液；
S52：取15μL NHS-biotin 溶液和700ug脱盐二抗室温避光震荡反应6h，得到二抗-生物素复合物。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种一抗-微球复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：对一抗进行脱盐处理，得到脱盐一抗；
S20：对微球进行活化操作，得到活化微球；在所述活化操作的过程中，使用含有表面活性剂的缓冲溶液对所述微球进行梯度清洗；
S30：将所述脱盐一抗与所述活化微球混合，并且震荡避温包被得到包被好的复合物，使用TBST磁珠保存液对所述包被好的复合物进行清洗，得到所述一抗-微球复合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S10中所述对一抗进行脱盐处理，具体包括以下步骤：
S11：使用PBS缓冲溶液对脱盐柱进行清洗；
S12：在所述脱盐柱中加入所述一抗，离心处理得到所述脱盐一抗；
所述离心处理为：在1500g的条件下离心1-2min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S20中所述对微球进行活化操作包括以下步骤：
S21：使用MES缓冲液对所述微球进行梯度清洗，得到清洗后的微球；
S22：将NHS和EDC与所述清洗后的微球充分混合，得到待清洗的活化微球；
S23：使用连接缓冲液对所述待清洗的活化微球进行清洗操作，得到所述活化微球；
所述MES缓冲液和/或所述连接缓冲液中含有质量浓度为2-5%的表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述微球与NHS和EDC混合的质量比为2000:(18-22):(9-11)。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微球标记有磁性。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S30具体包括以下步骤：
S31：将所述脱盐一抗与所述活化微球混合，使用MES缓冲液将所述活化微球稀释至8-12mg/ml，然后用漩涡混合器充分混合，震荡避光包被16-20h，得到包被好的复合物；
S32：使用TBST磁珠保存液将所述包被好的复合物清洗3-5次，得到一抗-微球复合物；
所述TBST磁珠保存液中含有质量分数为2-5%的表面活性剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述脱盐一抗与所述活化微球混合的质量比为(0.5-0.7):2。
8.一种多重标志物液态芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10：对一抗进行脱盐处理，得到脱盐一抗；
S20：对微球进行活化操作，得到活化微球；
S30：将所述脱盐一抗与所述活化微球进行交联，得到一抗-微球复合物；
S40：对二抗进行脱盐处理，得到脱盐二抗；
S50将NHS-biotin溶液与所述脱盐二抗混合，室温避光震荡反应4-6h，得到二抗-生物素复合物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述NHS-biotin溶液的溶剂为DMSO；所述NHS-biotin溶液的浓度为45-55μg/μL；所述NHS-biotin溶液与所述脱盐二抗混合的质量比为(16-18):(0.7-0.8)。
10.一种多重标志物液态芯片，其特征在于，由如权利要求8或9所述的方法制备得到，包含一抗-微球复合物和二抗-生物素复合物。
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106409457A (zh) * | 2015-07-29 | 2017-02-15 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种单分散银壳磁性微球的制备方法及其sers应用 |
| CN108047382A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-05-18 | 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 | 一种多孔聚苯乙烯微球、荧光微球及其制备方法 |
| CN108241052A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-07-03 | 河北国际旅行卫生保健中心 | 一种检测结核抗体的多重液相芯片 |
| CN108287235A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-17 | 常州天地人和生物科技有限公司 | 一种高效、稳定的磁性免疫微球的制备和应用 |
| CN108709993A (zh) * | 2018-04-02 | 2018-10-26 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种胶乳增强免疫比浊检测试剂盒及其制备和检测方法 |
| CN109439730A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-03-08 | 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 | 一种单链式核酸多重检测方法 |
| CN110275022A (zh) * | 2018-03-16 | 2019-09-24 | 北京协和洛克生物技术有限责任公司 | 传染病筛查及乙肝表面抗原定量的试剂盒及应用 |
| CN111077304A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-28 | 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 | 一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法 |
| CN111548444A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-08-18 | 北京化工大学 | 一种表面离子液体功能化聚合物微球的制备方法 |
-
2021
- 2021-03-15 CN CN202110273208.0A patent/CN112666346A/zh active Pending
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106409457A (zh) * | 2015-07-29 | 2017-02-15 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种单分散银壳磁性微球的制备方法及其sers应用 |
| CN108241052A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-07-03 | 河北国际旅行卫生保健中心 | 一种检测结核抗体的多重液相芯片 |
| CN108047382A (zh) * | 2018-01-23 | 2018-05-18 | 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 | 一种多孔聚苯乙烯微球、荧光微球及其制备方法 |
| CN108287235A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-07-17 | 常州天地人和生物科技有限公司 | 一种高效、稳定的磁性免疫微球的制备和应用 |
| CN110275022A (zh) * | 2018-03-16 | 2019-09-24 | 北京协和洛克生物技术有限责任公司 | 传染病筛查及乙肝表面抗原定量的试剂盒及应用 |
| CN108709993A (zh) * | 2018-04-02 | 2018-10-26 | 深圳上泰生物工程有限公司 | 一种胶乳增强免疫比浊检测试剂盒及其制备和检测方法 |
| CN109439730A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-03-08 | 中国人民解放军陆军军医大学第附属医院 | 一种单链式核酸多重检测方法 |
| CN111077304A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-28 | 深圳市瀚德标检生物工程有限公司 | 一种羧基乳胶微球与抗体的偶联方法 |
| CN111548444A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-08-18 | 北京化工大学 | 一种表面离子液体功能化聚合物微球的制备方法 |
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