CN111534436A - 一种控制赤潮藻类生物量的方法 - Google Patents

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陈建明
林玉雲
吴思仪
魏书蓉
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Minjiang University
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Abstract

本发明公开了一种控制赤潮藻类生物量的方法。包括如下步骤，在福建沿岸的不同地区采取表层海水水样，将显微镜下分离到的不同种类原生动物，置于过滤后的灭菌海水中，投放少量灭菌的大米或虾饲料，置于20‑25℃培养箱恒温培养，将不同种类原生动物，分别按1：1500、1：3000、1:4500的细胞个数比例与剧毒卡尔藻进行共培养，选取共培养后培养基中原生动物数量最多的原生动物种类；将选取的原生动物培养；共培养:将受藻类污染的水与上述培养后的原生动物进行共培养即可。本发明所述方法对受赤潮藻类污染的水中的赤潮藻类有明显抑制作用，持续抑藻时间可达72小时以上，未见藻细胞数量的明显反弹。

Description

一种控制赤潮藻类生物量的方法
技术领域
本发明涉及环境微生物领域，尤其涉及一种控制赤潮藻类生物量的方法。
背景技术
赤潮是一种严重的全球性海洋自然灾害之一,已经引起世界各地的高度关注。近年来我国近海海域污染加剧，局部海域富营养化问题突出，赤潮爆发日益频繁，给近岸水域带来了严重的生态、资源和环境问题，并造成巨大的经济损失，是滨海生态安全和沿海经济可持续发展的重大威胁。因此，研究新型高效环保的赤潮调控方法，是当前赤潮防控领域中亟待解决的重大问题之一。
卡尔藻是世界广温性的温带微小裸甲藻，隶属于裸甲藻目凯伦藻科，广泛存在于海洋和河口地区，于20世纪50年代在南非首次被发现。由卡尔藻引发的赤潮首次报道于南非，随后在欧洲、北美、澳大利亚和中国香港等地爆发，引起了鱼类的大量死亡。2019年5月，福建平潭养殖区爆发卡尔藻赤潮，密度约106cells/L,并伴有米氏凯伦、斯克里普藻、血红哈卡等赤潮种类，引发养殖区大量鱼类死亡，造成极大经济损失。
对于赤潮的防控目前主要有物理学、化学以及生物学方法。物理方法机械耗能高并且极有可能对底栖生物造成负面影响，并且无法从根本上治理赤潮。化学方法，包括改良黏土方法，以及铜制剂、除草剂等化学杀藻剂，在杀灭藻类的同时，也给其它生物带来了直接或间接的危害，对海洋环境存在破坏作用。生物法对环境无二次污染，是最有发展前途的一种方法，也是目前研究最为热门的一种赤潮的治理方法。
自然海区中浮游动物的存在起了控制或延缓浮游植物水华或赤潮发生的作用。因此可以发展以浮游生物为主食的贝类、鱼类等海洋生物，捕食或遏制赤潮生物的大量繁殖。比较各种控藻生物因子的环境适应力、繁殖能力、控藻效力、宿主范围、对宿主改变的适应能力以及不利环境下的抗逆性等多种因素，人们认为原生动物是一种很有实用前景的控藻因子。沉降、病原性裂解和被浮游动物摄食是浮游植物消亡的主要方式，尤其是小型浮游动物(原生动物)的摄食在其中起重要作用。小型浮游动物因具有生长速率快，生物量大等特点，在一定条件下可以大量摄取浮游植物。原生动物通过摄食作用在一定程度上可以影响赤潮的发生及藻种的类型。
发明内容
本发明的目的在于提供一种控制赤潮藻类生物量的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，包括如下步骤，
分离：在福建沿岸的不同地区采取表层海水水样，将显微镜下分离到的不同种类原生动物，置于过滤后的灭菌海水中，投放灭菌的大米和/或虾饲料，置于培养箱恒温培养，将培养后的不同种类原生动物与剧毒卡尔藻进行共培养，选取共培养后培养基中原生动物数量最多的原生动物种类；
培养：将选取的原生动物培养；
共培养:将受藻类污染的水与上述培养后的原生动物进行共培养。
进一步，所述分离步骤中，福建沿岸的不同地区为厦门、连江或平潭。
进一步，所述分离步骤中，所述大米或虾饲料的喂养量为每周每50只原生动物喂养25-75mg大米或虾饲料；更优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养50mg大米或虾饲料。
进一步，所述分离步骤中，所述恒温培养的温度为20-25℃，时间为一周；所述共培养的条件为20℃恒温培养箱，光暗周期为12:12。
进一步，所述分离步骤中，所述培养后的不同种类原生动物的细胞数量与剧毒卡尔藻的数量之比为1：(1500-4500)；优选的，比例为1：1500，1：3000，1:4500。
进一步，所述培养步骤中，培养时用到的海水盐度为3.0％，培养的条件为20℃光照培养箱中，光照强度100μmol photons·m-2·s-1，光暗周期12h:12h；喂养大米和/或虾饲料；优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养25-75mg大米或虾饲料；更优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养50mg大米或虾饲料。
进一步，所述共培养步骤中，受藻类污染的水为受赤潮藻类污染的水；更优选的，所述受藻类污染的水为受剧毒卡尔藻，和/或赤潮异弯藻污染的水。
进一步，所述共培养步骤中，受藻类污染的水中的藻类：原生动物的数量比＝(1-5000)：1。
进一步，所述共培养步骤中，共培养的条件是在海水中15-25度温度培养，喂养大米和/或虾饲料；优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养25-75mg大米或虾饲料；更优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养50mg大米或虾饲料。
所述分离到的厚游仆虫，其生物学特征如下：体长45-75μm，体宽25-40μm，身体坚实，不会弯曲或改变形状，系宽阔的椭圆形，背面常有凸出，腹面扁平，后半部比前半部少狭一些，后部浑圆，口缘区大而长，前触毛有7根，臀触毛5根，尾触毛4根，伸缩炮位于后半部右侧，大核呈很长的带形。
所述的具有毒素耐受能力的厚游仆虫的培养方法，包括以下步骤：
(1)种类：采用所述的厚游仆虫W125R；
(2)培养条件：将步骤(1)中的株系接种于盐度为3.0％的无菌海水中，在20-25℃条件下在培养箱中恒温培养；
(3)在步骤(2)所述的海水培养基中，定期投放灭菌的大米和/或虾饲料，每隔3天用新鲜海水置换1/3体积的培养基。
所述待处理藻液中的藻类具体为有毒赤潮藻——剧毒卡尔藻(Karlodiniumveneficum)、赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)。
为3.0％的灭菌海水中，添加L1营养盐，放置于20℃恒温培养箱中，光暗周期为12:12。
厚游仆虫W125R来源于海洋环境，对环境友好，使用过程中不会造成二次污染，在控制卡尔藻赤潮方面具有很好的应用前景。
实验数据表明：厚游仆虫加入到对数生长期的剧毒卡尔藻后，对藻细胞数量有明显抑制作用，持续抑藻时间可达72小时以上，未见藻细胞数量的明显反弹。
附图说明
图1是厚游仆虫对剧毒卡尔藻的毒素耐受性结果图。
图2是不同卡尔藻浓度下厚游仆虫的增长率图。
图3是厚游仆虫对不同浓度剧毒卡尔藻细胞的藻浓度的影响图。
图4是厚游仆虫对不同浓度剧毒卡尔藻的抑制率图。
图5是厚游仆虫对剧毒卡尔藻的摄食图。
图6是厚游仆虫对有毒赤潮藻类-赤潮异湾藻的毒素耐受性结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：原生动物的筛选
在福建沿岸的不同地区(厦门、连江、平潭等地)采取表层海水水样，将显微镜下分离到的不同种类原生动物，置于0.22um过滤后的灭菌海水中，投放少量灭菌的大米和/或虾饲料，置于20-25℃培养箱恒温培养一周。显微镜检确定每种原生动物培养基中的种类单一、活性较好、生物量充足。将不同种类原生动物，分别按1：1500、1：3000、1:4500(细胞个数比例)的比例与剧毒卡尔藻进行共培养(20℃恒温培养箱，光暗周期为12:12)，并在72小时内对原生动物进行显微镜观察与计数，原生动物数量不变或增加明显的为毒素耐受型原生动物。对共培养后培养基中的剧毒卡尔藻进行细胞计数，选取了对剧毒卡尔藻细胞数抑制效果最好的一株原生动物，进行分子及形态鉴定，并将该株系命名为W125R。
剧毒卡尔藻培养条件：剧毒卡尔藻(Karlodinium veneficum)用L1培养基(http://www.leadingtec.cn/l1-medium.html)进行培养，盐度3.0％，培养于20℃光照培养箱中，光照强度100μmol photons·m-2·s-1，光暗周期12h:12h。
原生动物实际增长率计算方法：增长率(％)＝(实验组个体数-对照组个体数)/对照组个体数×100％。对照组为只含有游仆虫不含有藻液的处理。
藻细胞抑制率计算方法：抑制效率(％)＝1-(对照组藻细胞浓度-实验组藻细胞浓度)/对照组藻细胞浓度×100％。其中剧毒卡尔藻的细胞浓度用1mL浮游生物计数板进行显微镜计数。对照组藻细胞浓度是只有藻细胞没有原生动物时的藻细胞浓度。
实施例2毒素耐受型原生动物的物种鉴定
对W125R株系进行形态观察和分子生物学鉴定，结果显示原生动物W125R为厚游仆虫，有如下生物学特征：体长45-75um，体宽25-40um，身体坚实，不会弯曲或改变形状，系宽阔的椭圆形，背面常有凸出，腹面扁平，后半部比前半部少狭一些，后部浑圆，口缘区大而长，前触毛有7根，臀触毛5根，尾触毛4根，伸缩炮位于后半部右侧，大核呈很长的带形。
扩增株系W125R的18S rRNA，对基因序列进行直接测序分析，其的18S全长序列信息序列如SEQ ID NO:1所示，结果显示其与Euplotes crassus ADP2同源性为99.9％，因此鉴定为厚游仆虫Euplotes crassus，株系名称为W125R。株系W125R的18S rRNA序列在GenBank中所匹配的序列编号为LT628500。
CCTGGATATGGTTAATACAATGAAACTGCGAATGGCTCATTCAAACAGTTATAGTTTATTTGGATTTACACATTAGTtAAATGGATAACCGTAGTAATTCTAGGGCTAATACATGCGTTACGGGGGACTTCACGGAACCCCAGTATTTATTAGATTCAAACCAATATTCCGAAGGTCTACTTGAGATGATTCATGATAACTGATCGAATTGCTGGTCTACCGGCAATAAGTCATTCATGTTTCTGCTTCCCATCAGCTTGATGGTAGTGTATTGGACAACCATGGCATTCACGGGCTATCGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACTTCTACGGAAGGCAGCAGGCGCGAAAATTATCCAATCCTGATTCAGGGAGGTAGTGAAACAAATAATGAACTAGGATTTATCCTGGGGTCACAATGGGCTTGATTTGCAAACTTTATTTAGCGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGTGTATATTAATGTTCCTGCAGTTATTCGATGCTCGTAGTTGGATTTCTGGAGGCTGAGATCGGAGGGTAGCCAAGGTTACCGCTGAACTCTTCCTTCATCCACCTGTTAACGTTGTCCGGGATTCGTTTCTCGGCTTCGGGCTCAGGCATATACTTTTACCCTTTTTCAAATTTATTGTTTTGAGTAAATTATAGTGTTTCAGGCAGGCGTGCGCCGGAATACTTTAGCATGGAATAATCGAATTGGACCGTGTATTCTTATTGAATTCTTCCTTATTGTTGGTTCAAGGACACGGAAATGGTTAATAGGGATAGTGTTTTTATTATCAGGGGAGGCATTAGTATTTAATTTCCAGAGGTGAAATTCTTTGAAATATTAAAGACTAACTTATGCGAAAGCATTTATTATTGCCAATAATGTTTTCATTAATCATTGAACGAAAGTTAGGGGATCAAAGACGATCAGATACCGTCCTAGTCTTAACCATAAACGTTGCCGACTAGGGATCGGAGGGCGTGCACATTCCGCCTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTTGGGTTCTGGGGGTAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCTTGCGGCTCAATTTGACTCAACACGGGAAATCTTACCAGGTCCAGACATAGCGAGGATTGACAGATTGATATTCTCTCTTGATTCTATGGGTATTTTTATATATTTTTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAAACGAACGAGACCTCAGCCTGCTAAATAGTTACCTGTCTTTTCATTTTTATAATTACGAGACTTGATAACTTCTTAGAGGGACGTTGTGTGCAACCACAAGGAAGTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTCCTGGGCCGCACGCGTGCTACACTGATACGTACAACAAGGGGGGTATATGCATTCATGCATCGACGCTGCTCCGAGATAGACACAGCTAAATCTTCTAAAATACGTATCGTGCTGCGGATAGATCGTTGAAATTATGGATCTTGAAGGTGGAATTCCTAGTAAGCGCGGGTCATCAGCCCGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCAATTTCGAGTGGCTCGGTGAACCTCTTTGGACTGTCGAGCAATCGCGAAATTAGAG。SEQ ID NO:1。
实施例3对不同浓度剧毒卡尔藻的毒素耐受性
将浓度为5000cell/ml、10000cell/ml、15000cell/ml的剧毒卡尔藻，分别与相同数量的厚游仆虫(10只/孔)进行共培养。设置空白对照，对照组为相同数量的游仆虫，以及不含有藻液的灭菌人工海水。实验组与对照组均设置3个重复。在12h、24h、36h、48h、60h、72h进行显微镜观察，对不同处理组中的每个生物学重复样品进行原生动物的细胞计数。其结果见图1和图2。从图1可知，卡尔藻密度为5000cell/ml、10000cell/ml、15000cell/ml时，厚游仆虫个体数均明显增加，由原来的10(只/孔)增长至约120(只/孔)，增长倍数达10-12倍。说明厚游仆虫对剧毒卡尔藻的毒素耐受性强，当卡尔藻密度高达15000cell/ml时，厚游仆虫的个体数依然增加明显。
从图2可知，厚游仆虫从24小时处开始出现明显增长，且在藻浓度为10000cell/ml的条件下，厚游仆虫增长率最明显。说明厚游仆虫对剧毒卡尔藻的毒素耐受性强，当卡尔藻密度高达10000cell/ml时，培养时间高达48小时后，厚游仆虫的个体数依然增加最明显。培养时间高达72小时时，厚游仆虫的个体数依然增加明显。
实施例4对不同浓度剧毒卡尔藻的抑制率
将浓度为5000cell/ml、10000cell/ml、15000cell/ml的剧毒卡尔藻，分别与相同数量的厚游仆虫(10只/孔)进行共培养(20℃光照培养箱，光照强度100μmol photons·m-2·s-1，光暗周期12h:12h)。在12h、24h、36h、48h、60h、72h的不同时间段，进行藻细胞浓度计数，并进一步计算藻细胞损失率，其结果见图3和图4。从图3可以看出，与厚游仆虫共培养后的藻细胞密度与对照组相比，均出现了不同程度地降低。图4显示，12h开始厚游仆虫对不同浓度的藻细胞出现抑制作用，但抑制程度各不相同。在48h之前，厚游仆虫对10000cell/ml浓度下的抑制效果较显著；在48h之后，厚游仆虫对5000cell/ml浓度下的抑制效果较显著。
实施例5对剧毒卡尔藻的摄食消化
将厚游仆虫(10只/孔)与不同浓度的剧毒卡尔藻(5000cell/ml)以1:1500，1：3000、1:4500的细胞个数比共培养，20℃恒温培养12-24小时后，使用甲醛溶液对厚游仆虫进行固定，固定后甲醛终浓度为2％。使用荧光显微镜观察厚游仆虫体内的自发荧光，荧光通道为PE通道。1:1500细胞个数比的结果见图5，分别显示存在藻液(a和b)和不存在藻液(c和d)情况下，厚游仆虫体内的藻类自发荧光情况。
由图5可知，置于人工海水中的厚游仆虫体内，未显示藻类自发荧光信号(图5的b)，而置于藻液中的厚游仆虫体内，显示较强的藻类自发荧光信号(图5的d)，说明厚游仆虫能够摄食剧毒卡尔藻并进行消化。
实施例6对其他常见赤潮藻的抑制作用
将厚游仆虫(10只/孔)分别接种于对数生长期的赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)藻液中，按1：1500、1：3000、1:4500(细胞个数比例)的比例与赤潮异弯藻进行共培养，不同藻浓度(5000cell/ml、10000cell/ml、15000cell/ml)的处理设置三个重复，在12h、24h、36h、48h、60h、72h的不同时间段，进行厚游仆虫的细胞计数。结果见图6，从图6可以看出，不同赤潮异弯藻浓度下，厚游仆虫个体数与对照组比较均明显增加。由此可见，厚游仆虫对福建沿岸的另一种典型赤潮藻-赤潮异弯藻具有一定的抑制作用。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure BDA0002473570000000071
Figure BDA0002473570000000081
Figure BDA0002473570000000091
SEQUENCE LISTING
<110> 闽江学院
中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
<120> 一种控制赤潮藻类生物量的方法
<130> MJXYQ-20001-CNI
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1755
<212> DNA
<213> 厚游仆虫Euplotes crassus
<400> 1
cctggatatg gttaatacaa tgaaactgcg aatggctcat tcaaacagtt atagtttatt 60
tggatttaca cattagttaa atggataacc gtagtaattc tagggctaat acatgcgtta 120
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accgcccgtc gctcctacca atttcgagtg gctcggtgaa cctctttgga ctgtcgagca 1740
atcgcgaaat tagag 1755

Claims (9)

1.一种控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，包括如下步骤，
分离：在福建沿岸的不同地区采取表层海水水样，将显微镜下分离到的不同种类原生动物，置于过滤后的灭菌海水中，投放灭菌的大米和/或虾饲料，置于培养箱恒温培养，将培养后的不同种类原生动物与剧毒卡尔藻进行共培养，选取共培养后培养基中原生动物数量最多的原生动物种类；
培养：将选取的原生动物培养；
共培养:将受藻类污染的水与上述培养后的原生动物进行共培养。
2.如权利要求1所述控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，所述分离步骤中，福建沿岸的不同地区为厦门、连江或平潭。
3.如权利要求1所述控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，所述分离步骤中，所述大米或虾饲料的喂养量为每周每50只原生动物喂养25-75mg大米或虾饲料；更优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养50mg大米或虾饲料。
4.如权利要求1所述控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，所述分离步骤中，所述恒温培养的温度为20-25℃，时间为一周；所述共培养的条件为20℃恒温培养箱，光暗周期为12:12。
5.如权利要求1所述控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，所述分离步骤中，所述培养后的不同种类原生动物的细胞数量与剧毒卡尔藻的数量之比为1：(1500-4500)；优选的，比例为1：1500，1：3000，1:4500。
6.如权利要求1所述控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，所述培养步骤中，培养时用到的海水盐度为3.0％，培养的条件为20℃光照培养箱中，光照强度100μmolphotons·m-2·s-1，光暗周期12h:12h；喂养大米和/或虾饲料；优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养25-75mg大米或虾饲料；更优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养50mg大米或虾饲料。
7.如权利要求1所述控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，所述共培养步骤中，受藻类污染的水为受赤潮藻类污染的水；更优选的，所述受藻类污染的水为受剧毒卡尔藻，和/或赤潮异弯藻污染的水。
8.如权利要求1所述控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，所述共培养步骤中，受藻类污染的水中的藻类：原生动物的数量比＝(1-5000)：1。
9.如权利要求1所述控制赤潮藻类生物量的方法，其特征在于，所述共培养步骤中，共培养的条件是在海水中15-25度温度培养，喂养大米和/或虾饲料；优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养25-75mg大米或虾饲料；更优选的，喂养量为每周每50只原生动物喂养50mg大米或虾饲料。
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