CN105670954A - 一种内生枯草芽孢杆菌及其作用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内生枯草芽孢杆菌及其应用。该枯草芽孢杆菌保藏名称为<i>Bacillus？subtilis？</i>MS1；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2014年5月5日，保藏编号为CCTCC？NO：M？2014182。本发明经实验证明，该内生枯草芽孢杆菌发酵液对植物病害魔芋软腐病、水稻白叶枯病病原菌有较强的抑制作用，可用于制备防治魔芋软腐病、水稻白叶枯病的生物菌剂，为开发新的生物农药品种、植物生物防治菌剂提供了新选择，具有一定的经济和社会效益。

Description

一种内生枯草芽孢杆菌及其作用

技术领域

本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用，主要应用于植物病害的生物防治方面，该枯草芽孢杆菌可以用于拮抗魔芋软腐病、水稻白叶枯病。

背景技术

软腐病俗称“半边疯”，是魔芋生产上危害最严重的病害。魔芋软腐病属软腐欧文氏菌属(Erwinia)，是一种革兰氏阴性细菌，胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜软腐亚种(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)，栽培期及贮藏期可发病，影响产量和品质。魔芋种植业每年因软腐病损失巨大。

水稻白叶枯病又称白叶瘟、茅草瘟、地火烧等是水稻主要病害病原菌为水稻白叶枯黄单胞杆菌(Xanthomanasoryzaepv.oryzalDye)，属黄单胞杆菌属细菌。主要特征为病株叶尖及边缘初生黄绿色斑点，后沿叶脉发展成苍白色、黄褐色长条斑，最后变灰白色而枯死，造成秕谷和碎米，导致减产甚至绝收，对产量影响较大。

几个世纪以来，化学农药在植物病虫害的防治中发挥了巨大作用，为农业的增产、稳产和提高品质做出了重要贡献。但是由于过量施用和滥用农药导致地力衰退和环境污染。尤其近几年来由于农药残留超标，严重影响了人们的生活质量。在当前农作物无公害栽培中，微生物农药越来越受到重视。因为它们不仅防治病虫害的效果好，而且对环境友好、对农作物无污染，病虫对其不易产生抗药性。因此，在生物农药中，以微生物农药用途多、应用前景最为广阔。

芽孢杆菌属的细菌为好氧或兼性厌氧的杆菌，广泛分布在水、空气和土壤中。芽孢杆菌在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃温度下能存活20分钟；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，是饲料微生物中可100％直达大小肠的活菌。同时本品具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗生素药物的使用，增强免疫力的优点，因而在生物防止病虫害中起着重要作用。目前芽孢杆菌属用于防止病虫害主要有：枯草芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。

本发明从疏花水柏枝(MyricariaLaxiflora)的健康的叶中分离得到一株内生枯草芽孢杆菌，它对魔芋软腐病原菌和水稻白叶枯病原菌有很好的抑制作用，为开发新的植物生防制剂提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1菌株，该枯草芽孢杆菌对魔芋软腐病原、水稻白叶枯病原有很好的抑制作用，为开发新的生物农药品种、植物生物防治菌剂提供了新选择。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1是从疏花水柏枝中获得的，于2014年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014182，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1在LB培养基上具有以下微生物学特性：菌落近圆形、表面光滑，污白色，菌体杆状，单生或成短链，革兰氏阴性，具芽孢。

本发明目的是提供一种用于生物防治植物病害的菌剂和生物农药，其活性成分为枯草芽孢杆菌MS1或其发酵液。其中所述植物病害为魔芋软腐病、水稻白叶枯病。抑菌试验表明，枯草芽孢杆菌MS1对魔芋软腐病、水稻白叶枯病原菌具有抑制效果。故可将菌株的发酵液或菌悬液作为农药的有效成分用于植物病害的生物防治，或者将本菌株制备成菌剂用于植物病害的生物防治。因而，本发明还包括含有所述菌株或者其发酵液的生物农药，以及含有所述菌株的微生物菌剂。

所述的枯草芽孢杆菌发酵液，制备方法如下：

1)菌种活化：取保存于-86℃冰箱的枯草芽孢杆菌菌株菌种接种于LB液体培养基中，30℃下，200rpm振荡培养12小时，作为种子培养液；

2)菌株发酵：将上述种子液以5％(V/V)浓度接种于LB液体培养基中，30℃下，200rpm振荡培养18小时，获得发酵液，离心获得上清液，即为发酵液。

本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1单菌落为模板，使用通用上游引物27f：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和通用下游引物1492r：5′-GGTTACCTTGTTTACGACTT-3′进行菌落PCR扩增获得1000bp的16srDNA部分序列(SEQIDNO：1)。通过Blast与GenBank收录的序列进行比对，发现MS1与枯草芽孢杆菌的同源性为99％。用MEGA4.1进化树(图)，鉴定菌株(MS1)与一株枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisKJ469796)的同源性达97％。

附图说明

图1为本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1的菌落形态。

图2为本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1的显微形态。

图3为本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1发酵液对水稻白叶枯病原菌拮抗作用效果。

图4为本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1发酵液对魔芋软腐病病原菌拮抗作用效果。

图5为本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1菌株的16SrDNA系统发育树。

具体实施方式

实施例一：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1的分离和保存

2012年在三峡流域湖北宜昌境内胭脂坝采集疏花水柏枝叶片，采用稀释平板法从中获得细菌；

制备稀释液：取疏花水柏枝叶10g，加入100mL无菌水中，将组织研磨捣碎。无菌操作吸取捣碎组织液1.0mL加入9.0mL无菌水中，在用无菌水稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7共7个浓度梯度。

培养：取各浓度梯度稀释液100μL分别涂布于LB培养基平板(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH7.2-7.4，121℃灭菌20min)中，倒置恒温箱内30℃培养。

取单菌落：待平板上长出菌落后，根据形态挑取单菌落于10mL灭菌的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，其余为水，pH7.2-7.4，121℃灭菌20min)中，恒温30℃振荡培养24小时；得到细菌培养液。

采用甘油保藏法，在灭菌的菌种管中，加入1.0mL细菌培养液，0.5ml50％(体积浓度)的甘油，混匀后于-86℃冰箱保存。

将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2014年5月5日，保藏编号为CCTCCNO：M2014182。

实施例二：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1鉴定

菌株的形态特征形态特征见图1。

菌株的显微形态特征见图2。

16SrDNA序列分析：采用通用引物进行菌落PCR扩增16SrDNA序列。上游引物27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492r：5′-GGTTACCTTGTTTACGACTT-3′。反应体系如下：

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，33个循环，最后72℃延伸8min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑取1500bp左右的条带进行凝胶回收，送上海生工测序。

将测得的序列在GenBank中进行Blast比对，并选取同源性较高的菌株的序列用MEGA4.1软件构建16SrDNA系统发育树。

实施例三：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1发酵液的制备

菌种活化：取保存-86℃冰箱的枯草芽孢杆菌菌株菌种接种于LB液体培养基中，30℃下，200rpm振荡培养12小时，作为种子培养液。

菌株发酵：将上述种子液以5％(V/V)浓度接种于LB液体培养基中，30℃下，200rpm振荡培养18小时，获得发酵液，离心获得发酵液上清液。

实施例四：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1发酵液对水稻叶白枯病原菌拮抗作用

滤纸片法检测发酵液的对水稻叶白枯病原菌抑菌活性。将水稻叶白枯病原菌接种LB斜面，37℃培养24小时，加入2mL无菌水制成菌悬液，取1mL菌悬液加入100mLLB固体培养基(45℃左右)混匀，倒入培养皿，在无菌条件下取出各200μL发酵液、无菌水和氨苄青霉素(浓度为50μg/mL)滴加于直径10mm的无菌滤纸，用无菌镊子在每个培养皿放四个滤纸片，无菌水为空白对照，氨苄青霉素为阳性对照，发酵液设置两个平行，每个平板做3个重复，放入培养箱恒温倒置37℃培养24h。观察抑菌作用，测量抑菌圈直径大小。

结果见图3。

实施例五：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MS1发酵液对魔芋软腐病原菌拮抗作用

滤纸片法检测发酵液的对魔芋软腐病原菌抑菌活性。将魔芋软腐病原菌接种LB斜面，37℃培养24小时，加入2mL无菌水制成菌悬液，取1mL菌悬液加入100mLLB固体培养基(45℃左右)混匀，倒入培养皿，在无菌条件下取出各200μL发酵液、无菌水和氨苄青霉素(浓度为50μg/mL)滴加于直径10mm的无菌滤纸，用无菌镊子在每个培养皿放四个滤纸片，无菌水为空白对照，氨苄青霉素为阳性对照，发酵液设置两个平行，每个平板做3个重复，放入培养箱恒温倒置37℃培养24h。观察抑菌作用，测量抑菌圈直径大小。

结果见图4。

序列表

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序列表

SEQIDNO：1

ATGGGGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCT

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）MS1，于2014年5月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2014182，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

2.一种生物防治植物病害的菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌或其发酵液。

3.权利要求2所述的生物防治植物病害的菌剂在防治魔芋软腐病或水稻白叶枯病上的应用。

4.一种生物农药，其含有权利要求1的枯草芽孢杆菌或其发酵液或权利要求2所述的菌剂。

5.权利要求4所述的生物农药在拮抗魔芋软腐病上的应用。

6.权利要求4所述的生物农药在防治水稻白叶枯病病原菌上的应用。

7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌、权利要求2所述的菌剂或权利要求4所述的生物农药在植物病害生物防治中的应用，其中所述的植物病害是魔芋软腐病、水稻白叶枯病。

8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌或权利要求2所述的菌剂在制备生物农药中的应用，其中所述的生物农药抑制魔芋软腐病、水稻白叶枯病。

9.权利要求2-8任一项所述的枯草芽孢杆菌发酵液，其特征在于，制备方法如下：

1）菌种活化：取保存于-86℃冰箱的枯草芽孢杆菌菌株菌种接种于LB液体培养基中，30℃下，200rpm振荡培养12小时，作为种子培养液；

2）菌株发酵：将上述种子液以5%（V/V）浓度接种于LB液体培养基中，30℃下，200rpm振荡培养18小时，获得发酵液，离心获得上清液，即为发酵液。

10.权利要求1-9任一项所述的枯草芽孢杆菌是从疏花水柏枝的根中获得的内生真菌。