CN106282073B - 一种溶藻巴西弧菌h115的培养方法 - Google Patents

一种溶藻巴西弧菌h115的培养方法 Download PDF

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Abstract

一种溶藻巴西弧菌H115的培养方法，涉及一种溶藻巴西弧菌的培养方法。是要解决现有溶藻巴西弧菌H115的培养方法获得的菌株的溶藻效果差的问题。方法：一、菌株活化：将保存的巴西弧菌H115菌种涂布到培养基平板上培养，用接种环转接至液体培养基中进行活化；二、将活化获得的菌种稀释至OD600值为1，接种至装有100mL扩增培养基的250mL三角瓶中培养。培养得到的巴西弧菌H115，其溶藻率可达到100％，扩大培养后在4h时溶藻率即达到100％，与摇瓶培养相比溶藻所需时间大大缩短，产生了预料不到的技术效果。本发明用于培养巴西弧菌H115。

Description

一种溶藻巴西弧菌H115的培养方法
技术领域
本发明涉及一种溶藻巴西弧菌的培养方法。
背景技术
赤潮是由近海海域发生富营养化造成的海洋微藻、原生动物或细菌在水体中过度繁殖或聚集而令海水变色的现象。近年来能产生毒素和其他有害影响的赤潮(HarmfulAlgal Bloom，HAB)频繁发生，规模不断扩大，成为全球性的海洋灾害，正严重干扰着沿海国家的经济发展并危害人类生存环境。
赤潮会对海洋生物及人类造成极大的危害。赤潮藻类死亡后，会消耗海水中的氧，造成海洋鱼类等缺氧或者赤潮藻体堵塞海洋生物的呼吸器官，造成大量的鱼贝类死亡。赤潮藻类能产毒素，释放到水体后导致鱼类生物的死亡，有些通过食物链的传递导致了更大型海洋生物死亡或者人类食物中毒。赤潮藻类的大量繁殖会打破海洋生态系统的平衡，使海域内的生物多样性递减。
海洋生态系统是物质循环和能量流动都处于相对稳定的动态平衡的生态系统。当赤潮藻类大量繁殖时，藻的光合作用消耗了大量的CO2，导致水体的酸碱度发生改变，影响了海洋生物的正常生命活动，同时，由于赤潮生物覆盖在水上层，使阳光很难到达水体深处，降低水体的透明度，导致底层的水草、珊瑚礁及以水草为主食的海洋动物死亡，生物多样性锐减。因此，海域一旦发生富营养化，海洋生态系统的生物种群会发生大变化，生态平衡便被打乱。
目前，赤潮防治方法主要包括物理、化学和生物防治，但是物理和化学的方法并不能有效解决赤潮问题，成本低、安全性好的生物防治技术引起越来越多研究人员的关注。溶藻细菌作为水生生态系统生物种群结构和功能的重要组成部分，对防治赤潮和水华及维持生态平衡都具有非常重要的意义。
发明内容
本发明是要解决现有溶藻巴西弧菌H115的培养方法获得的菌株的溶藻效果差的问题，提供一种溶藻巴西弧菌H115的培养方法。
本发明溶藻巴西弧菌H115的培养方法，包括以下步骤：
一、菌株活化：将-80℃保存的溶藻巴西弧菌H115菌种涂布到2216E培养基平板上，放置25℃恒温培养箱中培养22～26h，然后用接种环转接至2216E液体培养基中进行活化，活化的具体条件是于25℃、150～170r/min条件下摇床培养22～26h。
二、将活化获得的菌种稀释至OD600值为1，按2％～3％的接种量接种至装有100mL扩增培养基的250mL三角瓶中，于32～40℃、pH7～8条件下摇床培养50～60h，摇床转速为200～220r/min。
步骤一所述2216E培养基平板配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，琼脂15g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
步骤一所述2216E液体培养基配方：蛋白胨5g/L；酵母提取物1g/L；磷酸高铁0.1g/L；用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
步骤二所述扩增培养基的配方为：山梨醇10g/L；蛋白胨20g/L；酵母提取物1g/L；磷酸高铁0.1g/L；用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
本发明所述巴西弧菌H115(Vibrio brasiliensis LMG 20546)保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015093。该菌株已经于2015年7月13日在专利CN105349447A中公开。
本发明的有益效果：
巴西弧菌H115是现有的菌株，具有溶藻的功能。其培养条件在该菌株最初筛选时已经获得优化。再加上菌株的特性是已经确定的，理论上进行培养条件的微调是不会导致菌种特性的改变的，即不会导致分泌物质的剧烈增加。
本发明为了获得菌体生长的最佳状态，选择了最适宜培养条件，结果发现选择的条件培养得到的巴西弧菌H115，其培养16h溶藻率可达到100％，产生了预料不到的技术效果。
本发明将巴西弧菌H115发酵体积由250mL放大至5L，即将摇瓶培养放大到发酵罐培养，通常扩大培养是要改变培养条件才能够获得较好的效果的，而本发明将摇瓶培养的条件原封不动的用于发酵罐培养，在4h时溶藻率即达到100％，与摇瓶培养相比溶藻所需时间大大缩短，巴西菌H115发酵液溶藻效果提高10倍以上，菌体浓度显著增加，产生了预料不到的技术效果。
本发明的培养方法提高了菌体浓度，显著提升了溶藻效果，为进一步研究溶藻物质的高效提取及溶藻机制研究奠定基础。
附图说明
图1为优化前与优化后的条件在250mL摇瓶培养的培养时间随溶藻率变化的曲线；
图2为优化前与优化后的条件在5L发酵罐培养的培养时间随溶藻率变化的曲线。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式溶藻巴西弧菌H115的培养方法，包括以下步骤：
一、菌株活化：将-80℃保存的溶藻巴西弧菌H115菌种涂布到2216E培养基平板上，放置25℃恒温培养箱中培养22～26h，然后用接种环转接至2216E液体培养基中进行活化，活化的具体条件是于25℃、150～170r/min条件下摇床培养22～26h；
二、将活化获得的菌种稀释至OD600值为1，按2％～3％的接种量接种至装有100mL扩增培养基的250mL三角瓶中，于32～40℃、pH7～8条件下摇床培养50～60h，摇床转速为200～220r/min。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中放置25℃恒温培养箱中培养24h。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中活化的具体条件是于25℃、150r/min条件下摇床培养24h。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一所述2216E培养基平板配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，琼脂15g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一所述2216E液体培养基配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二所述扩增培养基的配方为：山梨醇10g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中于40℃、pH7.5条件下摇床培养54h。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二中摇床转速为200r/min。其它与具体实施方式一至七之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一：巴西弧菌H115单因素实验
1.菌株活化：将-80℃保存的巴西弧菌H115涂布到2216E培养基平板，放置25℃恒温培养箱培养24h。用接种环转接至2216E液体培养基的试管中进行活化，将活化获得的菌种稀释至OD600值为1，按2％接种量接种至装有100mL培养基的250mL三角瓶中，25℃、150r/min条件下摇床培养24h。
2168E培养基配方：蛋白胨5g/L；酵母提取物1g/L；磷酸高铁0.1g/L；用1mol/L盐酸调PH值为7.6-7.8，陈海水定容。
2.菌株培养最佳碳源、氮源
以2216E为基础培养基，选取果糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖作为供试碳源；玉米粉、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏作为供试氮源；分别加入单一碳源和氮源，其他成分不变，将预先活化的菌种加入上述培养基中，于25℃、200rpm、发酵培养24h，以比生长速率和最大菌体浓度为指标检测菌体活性得出巴西弧菌H115的最佳碳、氮源分别为山梨醇和蛋白胨。
3.最佳发酵温度
分别设定20、25、30、35和40℃的温度，200rpm恒温培养摇床发酵培养24h，以比生长速率和最大菌体浓度为指标检测菌体活性得出巴西弧菌H115最佳生长温度为40℃。
4.最佳发酵时间
分别培养12、24、36、48、60、72、84、96、108h，以比生长速率和最大菌体浓度为指标检测菌体活性，得出巴西弧菌H115最佳发酵时间为60h。
5.最佳发酵pH值
分别设定pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,于25℃，200rpm恒温培养摇床发酵培养24h，得出巴西弧菌H115最适发酵pH值为7.5。
6.最佳转速
分别设定摇床振荡速度50、100、150、200、250、300r/min，25℃发酵培养24h，测定溶藻效果可得：最利于巴西弧菌H115发酵的转速为200r/min。
通过单因素实验确定了巴西弧菌H115发酵的主要影响因素为：培养基碳源、培养基氮源、培养温度和培养时间。
实施例二：巴西弧菌H115的溶藻效果
1、本实施例溶藻巴西弧菌H115的培养方法，包括以下步骤：
一、菌株活化：将-80℃保存的溶藻巴西弧菌H115菌种涂布到2216E培养基平板上，放置25℃恒温培养箱中培养24h，然后用接种环转接至2216E液体培养基中进行活化，活化的具体条件是于25℃、150r/min条件下摇床培养24h。
二、将活化获得的菌种稀释至OD600值为1，按2％的接种量接种至装有100mL扩增培养基的250mL三角瓶中，于40℃、pH7.5条件下摇床培养54h，摇床转速为200r/min。
步骤一所述2216E液体培养基配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
步骤一所述2216E培养基平板配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，琼脂15g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
步骤二所述扩增培养基的配方为：山梨醇10g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
步骤一所述巴西弧菌H115(Vibrio brasiliensis LMG 20546)保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015093。
对比例：优化前的巴西弧菌H115培养方法，包括以下步骤：
一、菌株活化：将-80℃保存的溶藻巴西弧菌H115菌种涂布到2216E培养基平板上，放置25℃恒温培养箱中培养24h，然后用接种环转接至2216E液体培养基中进行活化，活化的具体条件是于25℃、150r/min条件下摇床培养24h。
二、将活化获得的菌种稀释至OD600值为1，按1％的接种量接种至装有100mL 2216E液体培养基的250mL三角瓶中，于25℃下摇床培养24h，摇床转速为180r/min。
步骤一所述2216E培养基平板配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，琼脂15g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
所述2216E液体培养基配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
2、溶藻方法：
将本实施例获得的巴西弧菌H115发酵液离心且经过0.22μm滤膜获得无菌发酵液。然后将无菌发酵液加入到藻浓度为18860个细胞/mL的藻液中。其中藻菌比为1:600。作用10min后，藻液用鲁哥氏碘液固定染色，在光学显微镜下用浮游计数框计数，计算溶藻率。无菌发酵上清液：发酵菌液经1.0×104g离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤后制得。其中藻菌比1:600是指1个微藻细胞对应了600个细菌细胞所生产的发酵液。本试验中的藻是指血红哈卡藻。
将对比例获得的巴西弧菌H115发酵液离心且经过0.22μm滤膜获得无菌发酵液。然后将无菌发酵液加入到藻浓度为18860个细胞/mL的藻液中。其中藻菌比为1:7000。作用10min后，藻液用鲁哥氏碘液固定染色，在光学显微镜下用浮游计数框计数，计算溶藻率。无菌发酵上清液：发酵菌液经1.0×104g离心10min，取上清经0.22μm滤膜过滤后制得。其中藻菌比1:7000是指1个微藻细胞对应了7000个细菌细胞所生产的发酵液本试验中的藻是指血红哈卡藻。
3、溶藻效果评价：
溶藻率的计算公式如下：
藻细胞抑制率(％)＝(1-Nt/N0)×100％
Nt：培养时间为t时的藻细胞密度，N0：初始藻细胞密度。
优化前与优化后的条件在250mL摇瓶培养的培养时间随溶藻率变化的曲线如图1所示，其中●表示优化前的培养方法，▼表示优化后的培养方法。由图1可知本实施例优化后的方法在16h时溶藻率达到100％。而且通过培养方法优化，所需添加的无菌发酵液的用量明显减少，藻菌比由1:7000降低至1:600，即发酵效果具有显著提高。
本实施例使用最适菌体生长的培养条件，结果意外发现该条件培养得到的巴西弧菌H115，其发酵液的溶藻率可达到100％，产生了预料不到的技术效果。
实施例三：巴西弧菌H115的扩大培养
本实施例按照实施例二中优化后的摇瓶培养条件进行5L发酵罐的初步放大培养：发酵液体积为3L，加消泡剂3％，培养基初始pH为7.5，121℃灭菌30min，发酵温度40℃搅拌转速200rpm，调流量为3L/min，发酵54h放料，分别测得菌体浓度、OD600、溶藻率。
本实施例按照实施例二中优化前的摇瓶培养条件进行5L发酵罐的初步放大培养：发酵液体积为3L，加消泡剂3％，培养基初始pH为7.5，121℃灭菌30min，曝气量调整为3L/min，发酵24h放料，分别测得菌体浓度、OD600、溶藻率。
优化前与优化后的条件在5L发酵罐培养的培养时间随溶藻率变化的曲线如图2所示，其中●表示优化前的培养方法，▼表示优化后的发酵罐培养，▽表示优化后的摇瓶培养。
发酵罐实验结果验证，优化后的培养方法巴西弧菌H115菌体浓度和溶藻率均优于摇瓶发酵，在4h时溶藻率即达到100％。
理论上扩大培养时，因发酵环境如溶解氧等环境的改变，需要对其转速等培养条件进行微调，但是本发明的培养方法同样适用于扩大培养，且其发酵液的溶藻效果明显增加，使溶藻所需时间大大缩短。
本实施例将摇瓶培养放大到发酵罐培养，不改变培养条件，巴西菌H115发酵液溶藻效果提高10倍以上，菌体浓度显著增加，产生了预料不到的技术效果。其发酵液溶藻能力显著提高，与摇瓶培养相比溶藻所需时间大大缩短。

Claims (1)

1.一种溶藻巴西弧菌H115的培养方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、菌株活化：将-80℃保存的巴西弧菌H115菌种涂布到2216E培养基平板上，放置25℃恒温培养箱中培养24h，然后用接种环转接至2216E液体培养基中进行活化，活化的具体条件是于25℃、150r/min条件下摇床培养24h；
二、将活化获得的菌种稀释至OD600值为1，按2％的接种量接种至装有100mL扩增培养基的250mL三角瓶中，于40℃、pH7.5条件下摇床培养54h，摇床转速为200r/min；
于步骤一所述2216E培养基平板配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，琼脂15g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容；
步骤一所述2216E液体培养基配方：蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容；
步骤二所述扩增培养基的配方为：山梨醇10g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物1g/L，磷酸高铁0.1g/L，用1mol/L盐酸调pH值为7.6-7.8，陈海水定容。
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