CN105779332A - 一种液体复合乳酸菌发酵剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵剂技术领域，具体涉及一种乳酸菌复合发酵剂、制备方法及其在降低发酵鱼制品中生物胺积累方面的应用。本发明一种液体复合乳酸菌发酵剂，包括植物乳杆菌、戊糖片球菌、乳双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌中的两种或三种。本发明液体复合乳酸菌发酵剂的制备过程，包括如下步骤：制备发酵培养基、乳酸菌的液体培养以及液体复合乳酸菌发酵剂的制备等。本发明液体复合乳酸菌发酵剂可在待发酵鱼体进行发酵前涂抹，再进行常规条件发酵，得到低生物胺积累的发酵鱼。本发明可以将发酵鱼终产品中组胺、酪胺、精胺、腐胺和尸胺等生物胺的浓度降低50％以上，改善了鱼类发酵制品的安全性；本发明工艺简单，适用于工业生产应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵剂技术领域，具体涉及一种乳酸菌复合发酵剂、制备方法及其在降低发酵鱼制品中生物胺积累方面的应用。
背景技术
发酵鱼类是我国历史悠久的鱼类加工制品，新鲜鱼类经由微生物发酵后品质稳定，货架期延长；营养价值得到保存，还可以产生风味独特的物质，是沿海地区饮食的主要组成部分，发酵整鱼、鱼酱和鱼露等均属于发酵鱼制品。自然发酵鱼中的微生物种类庞大，其中很多种类的微生物含有的氨基酸脱羧酶或者精氨酸脱亚胺酶，这类酶会分解游离氨基酸产生组胺、酪胺、精胺、腐胺等生物胺，给这类食品带来安全隐患。组胺和酪胺为引起水产品食物中毒的主要生物胺，而尸胺、腐胺的存在可以增强组胺的毒性作用，因此控制发酵过程生物胺的积累对食品安全非常重要。化学法、酶法、微生物法被认为是潜在的降低生物胺积累的有效方式。集美大学2014年申请了“一种鱼肉组胺抑制剂制备方法及使用方法”(申请号：201410376438.X)，集美大学2013年申请了“一种降低鲭鱼罐头中组胺的加工方法”(申请号：201310645504.4)，浙江省海洋开发研究院等在2009年申请了“一种金枪鱼红肉中组胺的降解方法”(申请号：200910154517.5)。
乳酸菌是广泛应用于食品工业中的一类重要的发酵剂。除了对产品的风味有提升作用，乳酸菌在抑制有害微生物中发挥独特的作用，乳酸菌可以使环境酸化、分泌抗菌物质，从而能够有效抑制一些病原菌及腐败菌。此外，多数乳酸菌安全、健康、无毒害作用。
目前，通过接种乳酸菌抑制的有害微生物的技术仍存在一些缺陷，如：采用单一乳酸菌对有害微生物进行抑制，能够抑制的有害微生物种类有限，很难达到广泛抑制有害微生物、控制各类生物胺积累的的效果；此外，目前的乳酸菌接种条件对于固态发酵的鱼类制品中很难迅速建立种群优势。
发明内容
本发明的目的在于，解决上述问题，使乳酸菌迅速在发酵鱼制品中建立种群优势、减少发酵鱼制品中组胺、酪胺等生物胺的积累，更有效的抑制鱼类在发酵过程中产生的多种有害生物胺。
为了达到上述目的，本发明提供了一种液体复合乳酸菌发酵剂，包括植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳双岐杆菌(Bifidobacteriumlactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)中的两种或三种；
所述液体复合乳酸菌发酵剂的制备过程为：
S1、制备发酵培养基：将鱼肉浸提液、氯化钠、糖类按比例混合，制得发酵培养基；
所述混合比例为：每100毫升发酵培养基含有鱼肉浸提液20～40克、氯化钠5～10克、糖类1～30克、水余量；所述鱼肉浸提液为鱼肉组织匀浆离心后所得到的上清液；
优选方式下，所述糖类为单糖或者双糖；最优方式下，所述糖类为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或木糖。
S2、乳酸菌的液体培养：取MRS固体培养基平板在25℃活化低温保存的上述乳酸菌，挑取一个单克隆菌落接种于10毫升步骤S1制备的发酵培养基中，在10～25℃、转速为100～220rpm条件下培养12小时后，全部接种至500毫升步骤S1制备的发酵培养基中，调节所述发酵培养基pH至6.5，继续培养至所述发酵培养基实际pH降至3.0～5.0，得到上述乳酸菌液体；
S3、液体复合乳酸菌发酵剂的制备：取步骤S2制得的乳酸菌液体，分别稀释或浓缩至106～108cfu/mL后，等体积混合均匀，即为液体复合乳酸菌发酵剂。
本发明还提供了上述液体复合乳酸菌发酵剂的制备过程，包括如下步骤：
S1、制备发酵培养基：将鱼肉浸提液、氯化钠、糖类按比例混合，制得发酵培养基；
所述混合比例为：每100毫升发酵培养基含有鱼肉浸提液20～40克、氯化钠5～10克、糖类1～30克、水余量；所述鱼肉浸提液为鱼肉组织匀浆离心后所得到的上清液；
优选方式下，所述糖类为单糖或者双糖；最优方式下，所述糖类为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或木糖。
S2、乳酸菌的液体培养：取MRS固体培养基平板在25℃活化低温保存的乳酸菌，挑取一个单克隆菌落接种于10毫升步骤S1制备的发酵培养基中，在10～25℃、转速为100～220rpm条件下，培养12小时后，全部接种至500毫升步骤S1制备的发酵培养基中，调节所述发酵培养基pH至6.5，继续培养至所述发酵培养基实际pH降至3.0～5.0，得到乳酸菌液体；
所述乳酸菌为植物乳杆菌、戊糖片球菌、乳双岐杆菌、嗜酸乳杆菌或德氏乳杆菌；
S3、液体复合乳酸菌发酵剂的制备：取步骤S2制得的五种乳酸菌液体中的2～3种，分别稀释或浓缩至106～108cfu/mL后，等体积混合均匀，即为液体复合乳酸菌发酵剂。
优选方式下，步骤S3中采用步骤S1制得的发酵培养基对所述乳酸菌液体进行稀释处理。
本发明提供了上述液体复合乳酸菌发酵剂的应用，在待发酵鱼体进行发酵前，涂抹所述液体复合乳酸菌发酵剂，再进行常规条件发酵，得到低生物胺积累的发酵鱼。
应用所述液体复合乳酸菌发酵剂可达到降低发酵鱼制品中生物胺积累的效果。
优选方式下，上述液体复合乳酸菌发酵剂的应用，具体步骤为：
T1、鱼类预处理：取鱼类(鱼原料不限)去内脏、洗净、沥干，备用；
T2、发酵鱼类：将所述液体复合乳酸菌发酵剂均匀涂抹在经过步骤1预处理的鱼体上，常规条件发酵，得到低生物胺积累的发酵鱼；
所述液体复合乳酸菌发酵剂与所述鱼体的质量比为1～30:100。
本发明的优点在于：
1、本发明在常规条件发酵，定期检测产品中的组胺、酪胺等生物胺，添加复合发酵剂后其终产品的生物胺的含量明显降低。低于未添加发酵剂的对照组。与现有技术相比，本发明中预培养方式、接种方式以及接种组合可以使乳酸菌发酵剂在鱼类发酵终产品的总菌群中显著确立优势。
2、本发明可以将发酵鱼终产品中组胺、酪胺、精胺、腐胺和尸胺等生物胺的浓度降低50％以上，改善了鱼类发酵制品的安全性。
3、本发明工艺简单，适用于工业生产应用。
具体实施方式
实施例1
乳酸菌发酵剂的制备：使用MRS固体培养基平板在25℃活化低温保存的戊糖片球菌、嗜酸乳杆菌。使用乳酸菌发酵液体培养基(每100毫升培养基含氯化钠10克、乳糖15克，20克的海鲈鱼匀浆上清，0.22微米滤膜过滤除菌)培养一级种子和二级种子，使用过滤后的培养基分别稀释两种菌的二级种子至107cfu/mL，接种前等体积混合作为复合发酵剂。
海鲈鱼发酵：5条海鲈鱼(约750克/条)洗净、去除内脏和腮洗净、沥干；10克花椒、10克大料加上200克盐炒制打粉后均匀洒在鱼体表面；将海鲈鱼放置于保鲜盒中，将200毫升复合发酵剂均匀喷洒鱼体表面；扣上保鲜盒盖，封闭，15℃环境发酵6天；同样取5条海鲈鱼(约750克/条)，作为对照组，除不添加复合发酵剂外，其他处理条件相同。
生物胺的检测：发酵第六天结束后，对照组和接种组各取从不同鱼上取鱼肉，混合匀浆后，称取2克匀浆鱼肉样品，检测组胺、精胺、酪胺等生物胺(表1，方法参照GBT20768-2006)。每组3-5个平行样品。
表1.海鲈鱼发酵过程接种/未接种复合乳酸菌中生物胺(mg/kg)含量
a,b表示对照组和接种复合发酵剂组之间的显著性差异(p<0.001)
ND表示改组未检出生物胺，其中亚精胺对照组与接种组均未检出。
本发明在常规条件发酵，定期检测产品中的组胺、酪胺等生物胺，从表1数据可以发现，添加复合发酵剂后其终产品的生物胺的含量明显低于未添加发酵剂的对照组。
实施例2
乳酸菌发酵剂的制备：使用MRS固体培养基平板在25℃活化低温保存的植物乳杆菌、德氏乳杆菌和乳双岐杆菌。使用乳酸菌发酵液体培养基(每毫升培养基含氯化钠10克、蔗糖20克，0.22微米滤膜过滤除菌)培养一级种子和二级种子，使用过滤后的培养基分别稀释三种菌的二级种子至107cfu/mL，等体积混合作为复合发酵剂。
小黄鱼发酵：5千克小黄鱼洗净、去除内脏和鱼头，洗净、沥干；加上500克盐拌匀放置于瓷罐中；盖上瓷罐盖密封，15℃环境发酵20天，不添加复合发酵剂，作为对照组；接种组1添加500毫升浓度为107cfu/mL植物乳杆菌液；接种组2添加500毫升浓度为107cfu/mL德氏乳杆菌液；接种组3添加500毫升浓度为107cfu/mL乳双岐杆菌液；接种组4添加500毫升采用植物乳杆菌、德氏乳杆菌和乳双岐杆菌所制得的复合发酵剂，接种组1-4均需将菌液均匀喷洒鱼体表面。
生物胺的检测：发酵第20天每组各取2克发酵鱼样品，检测组胺、精胺、酪胺等生物胺(表2，方法参照GBT20768-2006)。
乳酸菌检测：方法参照GB4789.35-2010。
表2.小黄鱼发酵过程接种/未接种复合乳酸菌中生物胺(mg/kg)含量
a,b,c,d表示不同组别之间的显著性差异(p<0.001)
ND表示改组未检出生物胺，其中亚精胺对照组与接种组均未检出。
本发明在常规条件发酵，定期检测产品中的组胺、酪胺等生物胺，从表2数据可以发现，与未接种相比，接种单一乳酸菌的发酵鱼五种主要生物胺的含量有所降低；而接种组1-4相比，在乳酸菌浓度、乳酸菌接种量均相同的前提下，接种复合乳酸菌发酵剂的发酵鱼产品中五种主要生物胺的含量显著降低，该结果显示使用复合乳酸菌发酵剂的抑胺作用突出。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种液体复合乳酸菌发酵剂，其特征在于，包括植物乳杆菌、戊糖片球菌、乳双岐杆菌、嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌中的两种或三种；
所述液体复合乳酸菌发酵剂的制备过程为：
S1、制备发酵培养基：将鱼肉浸提液、氯化钠、糖类按比例混合，制得发酵培养基；
每100毫升发酵培养基含有鱼肉浸提液20～40克、氯化钠5～10克、糖类1～30克、水余量；所述鱼肉浸提液为鱼肉组织匀浆离心后所得到的上清液；
S2、乳酸菌的液体培养：取MRS固体培养基平板在25℃活化低温保存的上述乳酸菌，挑取一个单克隆菌落分别接种于10毫升步骤S1制备的发酵培养基中，在10～25℃、转速为100～220rpm条件下培养12小时后，全部接种至500毫升步骤S1制备的发酵培养基中，调节所述发酵培养基pH至6.5，继续培养至所述发酵培养基实际pH降至3.0～5.0，得到上述乳酸菌液体；
S3、液体复合乳酸菌发酵剂的制备：取步骤S2制得的乳酸菌液体，分别稀释或浓缩至106～108cfu/mL后，等体积混合均匀，即为液体复合乳酸菌发酵剂。
2.一种权利要求1所述液体复合乳酸菌发酵剂的制备过程，其特征在于，包括如下步骤：
S1、制备发酵培养基：将鱼肉浸提液、氯化钠、糖类按比例混合，制得发酵培养基；
所述混合比例为：每100毫升发酵培养基含有鱼肉浸提液20～40克、氯化钠5～10克、糖类1～30克、水余量；所述鱼肉浸提液为鱼肉组织匀浆离心后所得到的上清液；
S2、乳酸菌的液体培养：取MRS固体培养基平板在25℃活化低温保存的上述乳酸菌，挑取一个单克隆菌落接种于10毫升步骤S1制备的发酵培养基中，在10～25℃、转速为100～220rpm条件下培养12小时后，全部接种至500毫升步骤S1制备的发酵培养基中，调节所述发酵培养基pH至6.5，继续培养至所述发酵培养基实际pH降至3.0～5.0，得到上述乳酸菌液体；
所述乳酸菌为植物乳杆菌、戊糖片球菌、乳双岐杆菌、嗜酸乳杆菌或德氏乳杆菌；
S3、液体复合乳酸菌发酵剂的制备：取步骤S2制得的五种乳酸菌液体中的2～3种，分别稀释或浓缩至106～108cfu/mL后，等体积混合均匀，即为液体复合乳酸菌发酵剂。
3.根据权利要求2所述液体复合乳酸菌发酵剂的制备过程，其特征在于，所述糖类为单糖或者双糖。
4.根据权利要求2所述液体复合乳酸菌发酵剂的制备过程，其特征在于，所述糖类为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖或木糖。
5.根据权利要求2所述液体复合乳酸菌发酵剂的制备过程，其特征在于，步骤S3中采用步骤S1制得的发酵培养基对所述乳酸菌液体进行稀释处理。
6.一种权利要求1所述液体复合乳酸菌发酵剂的应用，其特征在于，在待发酵鱼体进行发酵前，涂抹所述液体复合乳酸菌发酵剂，再进行常规条件发酵，得到低生物胺积累的发酵鱼。
7.根据权利要求6所述液体复合乳酸菌发酵剂的应用，其特征在于，具体步骤为：
T1、鱼类预处理：取鱼类去内脏、洗净、沥干，备用；
T2、发酵鱼类：将所述液体复合乳酸菌发酵剂均匀涂抹在经过步骤1预处理的鱼体上，常规条件发酵，得到低生物胺积累的发酵鱼；
所述液体复合乳酸菌发酵剂与所述鱼体的质量比为1～30:100。
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