CN113831419B - 一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途，亮菌菌丝体多糖PAT总糖含量为93.41％，糖醛酸含量为12.24％；单糖组成及摩尔比为甘露糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:阿拉伯糖＝2.87:6.41::9.56:2.53:0.81。本发明制备的亮菌菌丝体多糖PAT对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌生长过程均具有显著的抑制作用。亮菌菌丝体多糖PAT可作为新型天然抑菌剂，在日化和医药领域有着广泛应用前景。

Description

一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途
技术领域
本发明属于功能产品领域，具体涉及一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途。
背景技术
亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing，又称假蜜环菌，是我国特有的一种珍贵药食两用菌，因其菌丝体在暗处发出浅蓝色荧光而得名。植物学分类归属于伞菌目、白蘑科、杯伞属，其含有亮菌甲素、亮菌乙素等活性成分，已被广泛用于治疗急慢性肝炎、阑尾炎、中耳炎和胆囊炎。多糖作为亮菌生长过程中产生的重要次级代谢产物，研究发现其具有抗肿瘤、降血糖、降血脂和改善胰岛素抵抗等多种药理作用。目前关于亮菌多糖的抗菌作用，鲜有文献报道。
发明内容
本发明旨在提供一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和抑菌用途。本发明设计并优化了发酵技术，聚酰胺法制备具有特定化学组成的亮菌多糖，发现其对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有显著的抑制作用。本发明制备的亮菌多糖，可广泛应用在日化和医药领域，例如抗菌牙膏、沐浴露和抑菌喷雾剂等天然抑菌产品的开发，具有重要的市场应用价值和开发前景。
本发明亮菌菌丝体多糖，简记为PAT，其总糖含量为93.41％，糖醛酸含量为12.24％；单糖组成及摩尔比为甘露糖:鼠李糖:半乳糖醛酸:葡萄糖:阿拉伯糖＝2.87:6.41:9.56:2.53:0.81；其分子量分布范围为2.95×104-1.07×106Da。
本发明亮菌菌丝体多糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：150g土豆去皮切碎，煮沸30min，6层纱布过滤，加入25g葡萄糖和5gMgSO4，加水至1000mL，121℃灭菌20min制得葡萄糖-土豆-MgSO4培养基；将4-6g亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种(该菌种由合肥诚志生物制药有限公司提供)接种于1000mL葡萄糖-土豆-MgSO4培养基中，28℃静置培养15天，制得人工液体静置发酵亮菌菌丝体；
步骤2：将步骤1获得的亮菌菌丝体(2000g)粉碎，按照液料比1:10(g/mL)加入蒸馏水，然后90℃浸提3h，重复浸提3次，过80目筛，合并提取液；
步骤3：将步骤2所得提取液浓缩至原体积的1/250，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h，4500rpm离心10-15min，收集沉淀物；
步骤4：将步骤3得到的沉淀物加蒸馏水溶解，采用聚酰胺法除蛋白脱色制备亮菌菌丝体多糖。条件为：80g的100-120目聚酰胺和300mL的沉淀物溶液在500mL摇瓶中混匀，室温条件下，摇床200rpm振摇30min，使其充分吸附蛋白质和色素，然后过滤液体，收集滤液、浓缩，冻干为PAT。
本发明亮菌菌丝体多糖的用途，是用于制备抑菌制剂，所述抑菌制剂对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的生长具有显著的抑制效果。
本发明通过亮菌菌丝体多糖PAT分别干预大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌的生长，测定干预后的抑菌圈直径、最小抑制浓度和生长曲线来评价其抗菌功效。
本发明1mg/mL亮菌菌丝体多糖PAT对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径分别为25.4mm±0.5，18.2mm±0.9，15.23mm±0.4，13.71mm±0.4，同浓度氯霉素的抑菌直径为29.5mm±0.5。
本发明亮菌菌丝体多糖PAT对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌最小抑制浓度(Minimum inhibition concentration)分别为：0.5mg/mL，-1.0mg/mL，4.0mg/mL，4.0mg/mL。
本发明的有益效果体现在：1、采用控制变量法优化液态静置发酵技术，通过筛选特定培养基，28℃静置15天培养，获得生物产量高的菌丝体；2、聚酰胺法取代传统Sevag试剂快速有效除去蛋白和色素纯化活性多糖，得到富含半乳糖醛酸、鼠李糖等特定单糖组成亮菌菌丝体多糖PAT，其操作简便、绿色高效，适用于规模化制备。
附图说明
图1是标准单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，3-葡萄糖醛酸，4-半乳糖醛酸，5-葡萄糖，6-半乳糖，7-阿拉伯糖，8-岩藻糖)。
图2是亮菌菌丝体多糖PAT单糖组成高效液相色谱图(*-溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，4-半乳糖醛酸，5-葡萄糖，7-阿拉伯糖)。
图3是亮菌菌丝体多糖PAT相对分子质量检测色谱图，色谱条件为安捷伦1260HPLC-ELSD，TSKgel-G6000-PWxL(7.8mm×30cm，13μm)。
图4亮菌菌丝体多糖对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌图。
图5是亮菌菌丝体多糖对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例描述本发明的制备和抑制细菌生长，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。
实施例1：亮菌菌丝体的发酵技术
步骤1：150g土豆去皮切碎，煮沸30min，6层纱布过滤，加入25g葡萄糖和5gMgSO4，加水至1000mL，121℃灭菌20min制得葡萄糖-土豆-MgSO4培养基，将4-6g亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种接种于1000mL培养基上，28℃静置培养15天，制到人工液体静置发酵亮菌菌丝体，其生物量为19.3g/L。
步骤2：步骤1得到的葡萄糖-土豆-MgSO4培养基加入15g琼脂，得到固态培养基，将4-6g亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种接种于该固体培养基上，28℃静置培养15天，制到人工固态静置发酵亮菌菌丝体，其生物量为13.2g/L。
步骤3：步骤1得到的葡萄糖-土豆-MgSO4液态培养基，28℃以180rpm摇床振动培养15天，制到人工液体摇床发酵亮菌菌丝体，其生物量为17.5g/L。
实施例2：亮菌菌丝体多糖的制备
步骤1：150g土豆去皮切碎，煮沸30min，6层纱布过滤，加入25g葡萄糖和5gMgSO4，加水至1000mL，121℃灭菌20min制得葡萄糖-土豆-MgSO4培养基，将4-6g亮菌Armillariella tabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种接种于1000mL培养基上，28℃静置培养15天，制到人工液体静置发酵亮菌菌丝体；
步骤2：将步骤1得到的亮菌菌丝体用中药粉碎机粉碎后按照1:10的液料比加入蒸馏水，90℃浸提3h，重复浸提3次，过80目筛，合并提取液；
步骤3：将步骤2提取液浓缩至原先体积的1/250，加入4倍体积的95％，4℃静置沉淀12h，4500rpm/min下离心10-15min，收集沉淀；
步骤4：将步骤3得到的沉淀(CAT)称取3g加蒸馏水溶解，用聚酰胺法、Sevag法和酶法分别制备亮菌菌丝体多糖。聚酰胺法：80g的100-120目聚酰胺和300mL沉淀溶液在500mL摇瓶中混匀；室温条件下，摇床200rpm振摇30min，使其充分吸附蛋白质和色素，然后过滤液体，收集滤液、浓缩，冻干为PAT；Sevag(正丁醇:三氯甲烷v/v＝1:4)，重复操作3次，取上清离心，旋转蒸发除去有机试剂，冷冻干燥为AT；酶法：沉淀溶解后的溶液中加入木瓜蛋白酶，60℃水浴2h，然后100℃灭活10min，冷却至室温，离心，冻干为EAT。
步骤5：PAT，AT，EAT和CAT的化学组成测定。总糖含量以葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定；蛋白质含量以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，考马斯亮蓝G-250法测定；咔唑–硫酸法测定糖醛酸含量；焦没食子酸法测定多酚含量，之后分别在490nm、595nm、520nm、540nm处测量吸光值。
结果如表1，三种制备方法得到的多糖化学组成相比，PAT的总糖和糖醛酸含量显著高于AT和EAT；而蛋白质和酚含量显著低于AT和EAT，表明聚酰胺法相比于传统的Sevag法和酶法，其制备的多糖纯度高，杂质少。
表1多糖化学组成
Figure BDA0003283772710000041
实施例3：PAT单糖组成和分子量测定
步骤3：PAT的单糖组成分析采用酸水解-柱前PMP衍生化方法处理样品，高效液相色谱法分析测定。称取PAT(5mg)溶于5mL的2mol/L的三氟乙酸中，氮气封管，110℃油浴8h使充分水解。旋转蒸发仪旋出水分，加适量的去离子水，如此反复旋蒸至溶液pH显示中性为止，加入1mL蒸馏水，备用。
步骤4：标准单糖和已水解的样品溶液中加入50μL，0.5mol/LPMP甲醇溶液和50μL，0.3mol/LNaOH溶液，在70℃的水浴锅中反应30min进行PMP柱前衍生化，然后用50μL0.3mol/LHCl中和至中性。所得产物使用高效液相色谱检测，选用DAD检测器。HPLC柱温为30℃，色谱柱为Zorbox Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)，波长为245nm下检测。检测流动相A为乙腈，流动相B为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液。时间梯度洗脱0-60min，初始设置为流动相A：流动相B＝17％：83％，最终洗脱到比例为流动相A:流动相B＝20％：80％，进样量为10μL。
步骤5：采用去离子水洗脱，安捷伦高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)检测PAT组分。配制2mg/mL的PAT和葡聚糖标准品(T5、T12、T41、T100、T200)的溶液1mL，采用TSK Gel G6000 PWXL色谱柱(300×7.0mm，13μm)，载气为N2，气体流速为2.5L/min，进样量为10μL。以标准品相对分子质量的对数(LgMw)和保留时间(Rt)做标准曲线，测得的分子量范围为2.95×104-1.07×106Da。
实施例4：亮菌菌丝体多糖抗菌能力测定
PAT、AT、EAT和CAT对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌抑制能力评价。
步骤1：大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球(菌种购自ATCC,CICC)等细菌悬液的制备。斜面培养菌种在培养箱中孵育3h，超净工作台内接种LB固体培养基，37℃恒温静置培养；12h后，在超净工作台内选取平板上的菌落接种于LB的液体培养基，相同温度以180rpm转速摇床培养8h，制得原菌悬液。
步骤2：将步骤1制得的原菌悬液用无菌水稀释到2.0×105CFU/mL。
步骤3：采用薄层琼脂糖孔穴扩散法测定样品的抗菌功效。将步骤2的菌液均匀涂布于固LB培养基表面，经过灭菌直径为6mm的滤纸片置于培养基表面，滴加10μL2.0mg/mL的样品至滤纸片，37℃培养18-20h，等量的氯霉素作为阳性对照，无菌水作为空白对照，有抑菌圈形成表明有抑菌活性。
结果如图4所示，PAT对受试菌种均存在强烈抗菌能力，观察抑菌圈直径，PAT对大肠杆菌的抑制效果最优，抑制效果与阳性药氯霉素无显著差异。
步骤4：微量肉汤法测定样品对大肠杆菌，变形杆菌，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球的MIC。无菌环境下，96孔无菌板第1孔加入2×105CFU/mL 90μLMH液体培养基，第2孔至第11孔中加入50μL LB液体培养基；10μL8.0 mg/mL的样品溶液添加到第一个孔后充分混合，吸取50μL混合液添加到第2孔，依次操作至第10孔，第10孔吸取50μL丢弃。50μL的细菌液体(没有药物)添加到11孔作为空白对照，药物与菌悬液共培养6-8h后，酶标仪600nm下平板扫描的吸光值低于对照组50％时即为该样品对该菌MIC。
结果如表1所示，PAT对大肠杆菌的抑制浓度最小，为0.5mg/mL，这与抑菌圈的结果相吻合。
表2多糖的最小抑制浓度
Figure BDA0003283772710000051
步骤5：100μL含有2×105CFU/mL的菌悬液和100μL 1/2MIC药物加入到5mL的LB液体培养基中，37℃培养箱以转速180rpm共培育24h。0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24小时取样在600nm处测定吸光值。
如图5显示PAT组的吸光度在所有被测细菌中OD值最低，且右移趋势最大，说明细菌的正常生长受到了抑制，特别是对大肠杆菌的生长曲线影响最大。而EAT、AT、CAT生长曲线右移趋势逐渐变小，与PAT相比，其存在着相对较弱的抑菌作用。

Claims (3)

1.一种亮菌菌丝体多糖，其特征在于：
所述亮菌菌丝体多糖的总糖含量为93.41％，糖醛酸含量为12.24％，分子量分布范围为2.95×104-1.07×106Da；
所述亮菌菌丝体多糖的单糖组成及摩尔比为甘露糖:鼠李糖:半乳糖醛酸::葡萄糖:阿拉伯糖＝2.87:6.41:9.56:2.53:0.81；
所述亮菌菌丝体多糖是通过包括如下步骤的方法获得：
步骤1：将4-6g亮菌Armillariellatabescens(Scop.EX.Fr)Sing菌种接种于1000mL培养基中，28℃静置培养15天，制得人工液体静置发酵亮菌菌丝体；
步骤2：将步骤1获得的亮菌菌丝体粉碎，按照液料比1g:10mL加入蒸馏水，然后90℃浸提3h，重复浸提3次，过80目筛，合并提取液；
步骤3：将步骤2所得提取液浓缩至原体积的1/250，加入4倍体积的95％乙醇，4℃静置12h，4500rpm离心10-15min，收集沉淀物；
步骤4：将步骤3得到的沉淀物加蒸馏水溶解，采用聚酰胺法除蛋白脱色制备亮菌菌丝体多糖PAT；
步骤1中，所述培养基为葡萄糖-土豆-MgSO4培养基，制备方法如下：
150g土豆去皮切碎，煮沸30min，6层纱布过滤，加入25g葡萄糖和5gMgSO4，加水至1000mL，121℃灭菌20min制得葡萄糖-土豆-MgSO4培养基；
步骤4中，采用聚酰胺法除蛋白脱色的具体条件为：80g的100-120目聚酰胺和300mL的沉淀物溶液在500mL摇瓶中混匀，室温条件下，摇床200rpm振动30min，使其充分吸附蛋白质和色素，然后过滤收集滤液，浓缩、冻干为PAT。
2.一种权利要求1所述的亮菌菌丝体多糖的用途，其特征在于：
所述亮菌菌丝体多糖用于制备抑菌制剂，所述抑菌制剂对大肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的生长具有显著的抑制效果。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：
所述亮菌菌丝体多糖对大肠杆菌菌的生长具有显著的抑制效果，最小抑制浓度为0.5mg/mL。
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