CN115521385B - 一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和在抗肿瘤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和在抗肿瘤中的应用，其中亮菌菌丝体多糖的总糖含量为89％以上，单糖组成摩尔百分比为甘露糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：岩藻糖＝25.6：14.2：54.1：6.1。本发明亮菌菌丝体多糖能够作为抗肿瘤化疗药物的增效剂，与化疗药物卡铂、紫杉醇、5‑FU、吉西他滨等化疗药物联合使用可以增强这些化疗药物对癌症治疗的效果，如肺癌、宫颈癌、结肠癌及肝癌等。亮菌菌丝体多糖对化疗药物的增效效果呈剂量依赖性。
Description
技术领域
本发明涉及一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和在抗肿瘤中的应用，属于中药对肿瘤化疗药增效的技术领域。
背景技术
亮菌(Armillariella tabescens)，又名假蜜环菌，是一种医食两用的真菌，广泛分布在江苏、浙江、安徽、福建等地区，目前较为所知的功效主要是治疗各种炎症之类的疾病，比如肝炎，胃炎，胆囊炎。
超滤是一种膜分离技术，具有不损害糖活性、无污染、分离效率高、能耗低和适合工业化生产等优点，选择不同孔径的超滤膜可以将不同大小的多糖分离。通过研究超滤膜分离亮菌多糖，希望为亮菌多糖的分离纯化提供新的思路。
据世界卫生组织发布的《2020世界癌症报告》数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，仅中国新发癌症就有457万人，占全球23.7％，中国癌症新发人数远超世界其他国家，意味着全球每死亡100个癌症患者中，中国人占将近24个。平均每天都有6000多人死于癌症，每分钟就有将近5人死于癌症。
化疗是治疗癌症的主要手段，但是化疗也会对自身正常细胞造成损伤，所以减少化疗药物的剂量，降低化疗药物的毒副作用，对肿瘤患者而言是十分必要的。多糖是一种结构和分子量具有多样性的高分子化合物，具有非常广泛的药理作用，例如参与机体的代谢、免疫调节、降血糖、抗肿瘤等功能。当前亮菌菌丝体多糖具有抗肿瘤的功效已经有文献报道，但还没有文献报道过亮菌菌丝体多糖作为化疗药物增效剂增强化疗药。
由于亮菌菌丝体多糖具有无毒高效、易于制备、药源丰富的特点，能够提高肿瘤病人生活质量，抵抗大剂量放化疗药物的副作用，因此可作为抗肿瘤化疗药的理想增效剂，并将在临床抗肿瘤治疗中发挥重要作用。
发明内容
本发明提供了一种亮菌菌丝体多糖及其制备方法和在抗肿瘤中的应用。本发明亮菌菌丝体多糖可以作为化疗药物的增效剂以增强化疗药物抗肿瘤的效果，与化疗药物联合运用，可显著降低化疗药物的剂量与毒副作用。
本发明通过以下技术方案实现的：
本发明亮菌菌丝体多糖，其总糖含量≥89％，单糖组成按摩尔百分比计为甘露糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：岩藻糖＝25.6：14.2：54.1：6.1。
本发明亮菌菌丝体多糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：亮菌进行液体发酵后，收集菌体进行烘干，研磨成粉末状；
步骤2：采用沸水提取法对亮菌胞内多糖进行多次提取，然后进行醇沉，除醇后冻干；
步骤3：使用Sevag法去除冻干粉末所含的蛋白，然后加入氯仿和正丁醇的混合溶液(体积比4:1)，充分振摇后静置，离心，收集上清液，重复上述步骤，直到液体里面的蛋白含量肉眼可见较少时结束；
步骤4：将上清液装入透析袋中，在流动的自来水中透析，再用蒸馏水透析，将透析后的溶液进行醇沉、离心，收集沉淀，沉淀干燥；
步骤5：采用丙酮和乙醚溶液对沉淀进行连续多次洗涤，冻干碾磨后得到白色亮菌菌丝体多糖粉末；
步骤6：将得到的白色亮菌菌丝体多糖溶于蒸馏水中，选择合适的料液浓度以及压力依次通过1×105Da大小的超滤膜和5×104Da大小的超滤膜，得到大小在1×105Da-5×104Da的亮菌菌丝体多糖。
本发明亮菌菌丝体多糖的应用，是将所述亮菌菌丝体多糖作为增效剂，与抗肿瘤化疗药物复配使用，以提高抗肿瘤的治疗效果。
所述化疗药物包括卡铂、紫杉醇、5-FU、宾西他滨等药物中的至少一种。
所述亮菌菌丝体多糖与所述化疗药物的有效成分比为(100～200:1)。该比例是在细胞实验中采用的比例，具体应用于人肿瘤时以实际情况为主。
所述肿瘤包括人肺癌、人结肠癌、人肝癌、人宫颈癌等。
本发明提供的含有亮菌菌丝体多糖的抗肿瘤药物，包括亮菌菌丝体多糖、抗肿瘤活性成分以及药学上可接受的辅料。
本发明实验结果显示，亮菌菌丝体多糖可以增强化疗药物对不同来源的肿瘤细胞抑制它们增殖和活性效果，肿瘤细胞可以是肺癌、结肠癌、肝癌，宫颈癌等。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明首次发现亮菌菌丝体多糖与化疗药物卡铂、紫杉醇、5-FU、宾西他滨等化疗药物联合使用可以增强这些化疗药物对癌症治疗的效果，如肺癌、结肠癌、肝癌、宫颈癌。亮菌菌丝体多糖对化疗药物的增效效果呈剂量依赖性。
附图说明
图1为亮菌菌丝体多糖联合5-FU化疗药物对结肠癌细胞SW620的作用结果图。
图2为亮菌菌丝体多糖联合卡铂化疗药物对肺癌细胞A549的作用结果图。
图3为亮菌菌丝体多糖联合紫杉醇化疗药物对宫颈癌细胞HeLa的作用结果图。
图4为亮菌菌丝体多糖联合吉西他滨化疗药物对肝癌细胞HepG2的作用结果图。
图5为单糖混合标准品高效液相色谱图(*表示溶剂峰，1-甘露糖，2-鼠李糖，3-葡萄糖,4-半乳糖醛酸，5-葡萄糖醛酸，6-半乳糖，7-阿拉伯糖，8-木糖，9-岩藻糖)。
图6为亮菌菌丝体多糖单糖组成高效液相色谱图(*表示溶剂峰，1-甘露糖：5-葡萄糖醛酸：6-半乳糖：9-岩藻糖)。
图7为亮菌菌丝体多糖联合5-FU化疗药物对荷瘤小鼠治疗21天后肿瘤实物图。第一行为对照组，第二行为5FU组，第三行为5-FU加亮菌菌丝体多糖低浓度组，第四行为5-FU加亮菌菌丝体多糖高浓度组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。
实施例1：亮菌菌丝体多糖的制备
本发明实验所用的亮菌购自国家菌种资源库-中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号ACCC 51415。
具体操作如下：
1、亮菌进行液体发酵后(葡萄糖-土豆液体培养基上方放入铝丝，经高压蒸汽灭菌后将黄豆大小的亮菌菌体置于400-450ml葡萄糖-土豆液体培养基铝丝上保证菌体浸润到培养基中，28℃培养18天得到亮菌菌丝体)，收集菌体进行烘干，得到亮菌烘干体，将亮菌烘干体用粉碎机研磨成粉末状；
2、采用沸水提取法对亮菌胞内多糖进行3次提取，每次按固液比1：15加蒸馏水，提取2小时；6小时后取上清，旋蒸浓缩液体后进行醇沉，将得到的上清液按照1：4的比例加入乙醇，过夜，第二天4500转8分钟进行分离取沉淀，将沉淀加水溶解进行旋蒸，彻底旋出里面的乙醇，除去乙醇后进行冻干2到3天；
3、得到冻干粉末之后使用Sevag法去除里面的蛋白。将氯仿：正丁醇＝4：1(V∶V)混合溶液加入冻干后的水溶液中，充分振摇后静置5分钟，4000r/min离心6分钟，收集上清液，重复上述步骤，直到液体里面的蛋白含量肉眼可见较少时结束。
4、将上清液装入透析袋中，在流动的自来水中透析48小时后，再用蒸馏水透析24小时。将透析后的溶液加入1/3体积的75％乙醇静置12小时后离心，收集沉淀，沉淀干燥；用丙酮和乙醚溶液对沉淀进行连续多次洗涤，将得到的亮菌菌丝体多糖沉淀于80℃干燥，碾磨后得到亮菌菌丝体多糖粉末。
5、将得到的白色亮菌菌丝体多糖溶于蒸馏水中，选择合适的料液浓度以及压力(200mg溶于1-1.5L的蒸馏水中，流速为1分钟俩毫升，根据流速调节压力)依次通过1×105Da大小的超滤膜和5×104Da大小的超滤膜，得到大小在1×105Da-5×104Da的亮菌菌丝体多糖。
实施例2：亮菌菌丝体多糖对三种肿瘤细胞的抑制增殖作用
实验材料：亮菌菌丝体多糖是从本实验室液体发酵得到的亮菌菌丝体通过水提醇沉的方法提取得到。人结肠癌细胞株SW620，人肺癌细胞株A549,人宫颈癌细胞株HeLa,人肝癌细胞株HepG2均购自中国科学院细胞库。实验方法：将纯化干燥的亮菌菌丝体多糖溶于ddH2O配置成10mg/ml浓度的溶液，过滤除菌存放与-20℃冰箱冻存。人结肠癌细胞SW620，人肺癌细胞A549，人宫颈癌细胞HeLa常规培养于新鲜的1640培养液中(含10％的胎牛血清(FBS)、1％的双抗(青霉素-链霉素混合液)、1％的谷氨酰胺(Gln))，人肝癌细胞HePG2常规培养与DMEM培养液中，置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞长到适量的时候进行传代，用胰消化酶消化3分钟，俩倍体积的完全培养液中和胰酶，然后将所得溶液1000转3分钟离心，吸取上清用新鲜的RPMI1640培养液或者DMEM培养液进行悬浮，将细胞浓度调整为5×104个/ml，接种于96孔板中，每个孔接种100μl，即每孔细胞数为5000个，设置3个平行复孔，同时设置不加细胞的空白对照用于校正。将上述96孔板置于37℃，5％CO2,饱和湿度的细胞培养箱中培养，24小时后加入不同浓度的亮菌菌丝体多糖进行处理(0，200，400μg/ml)。24小时后每个孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl，然后用酶标仪测量其在490nm的吸光度，与只加培养液的细胞OD值相比较，测量亮菌菌丝体多糖对肿瘤细胞活力的作用。
计算公式：肿瘤细胞增殖抑制率＝(1-(对照OD值-空白OD值)/(用药组OD-空白OD值))×100％
结果：当亮菌菌丝体多糖浓度为200μg/ml时，A549细胞的增长活性为81.32％，SW620细胞无明显变化，HeLa细胞无明显变化，HepG2细胞增长活性为85.21％。当亮菌浓度为400μg/ml，A549细胞的增长活性为48.97％，SW620细胞无明显变化，HeLa细胞增长活性为83.28％，HepG2细胞增长活性为74.37％。
由此可得，单独的亮菌菌丝体多糖对某癌症些具有一定的抗肿瘤作用，其对肺癌细胞A549作用效果最好，低浓度的亮菌菌丝体多糖对宫颈癌肝作用不明显，高浓度时具有一定的作用效果，对于结肠癌症细胞作用效果较低，没有明显的变化。
实施例3：亮菌菌丝体多糖对5-FU的体外抑瘤增效作用研究
实验材料：亮菌菌丝体多糖是从本实验室液体发酵得到的亮菌菌丝体通过水提醇沉的方法提取得到。人结肠癌细胞株SW620来源于中国科学院细胞库，常规培养于新鲜的1640培养液中(含10％的胎牛血清(FBS)、1％的双抗(青霉素-链霉素混合液)、1％的谷氨酰胺(Gln))。5-FU购自麦克林公司。
实验内容：将纯化干燥的亮菌菌丝体多糖溶于ddH2O配置成10mg/ml浓度的溶液，过滤除菌存放与-20℃冰箱冻存。人结肠癌细胞SW620，培养于新鲜的1640培养液中(含10％的胎牛血清(FBS)、1％的双抗(青霉素-链霉素混合液)、1％的谷氨酰胺(Gln))，置于37℃，5％CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞长到适量的时候进行传代，将传代后生长情况良好的细胞进行悬浮，将细胞浓度调整为5×104个/ml，接种于96孔板中，每个孔接种100μl，即每孔细胞数为5000个，设置3个平行复孔，同时设置不加细胞的新鲜培养液100μl三个复孔，和空白对照，用于校正。
将上述处理过的96孔板置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养24小时后吸去旧的培养液换成新鲜的培养液同时加入药物(5-FU以及5-FU加上亮菌菌丝体多糖)5-FU浓度为2μg/ml，亮菌菌丝体多糖为低高俩个浓度(200、400μg/ml)，同时设置阴性对照。处理完成后继续培养48小时，每个孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl，继续培养4个小时，之后吸去培养液每孔加入DMSO150μl，避光摇晃10分钟，用酶标仪测量其在490nm的吸光度，与不加阴性对照(5-FU和亮菌菌丝体多糖)的OD值相比较，测量亮菌菌丝体多糖对5-FU抑瘤的增效作用。
亮菌菌丝体多糖对5-FU的增效效果
结肠癌细胞抑制率(％)(X±S，n＝6)
**表示与5-FU组相比较P<0.01，*表示与5-FU组相比较P<0.05
上述结果显示单独使用化疗药物5-FU时对于结肠癌细胞SW620具有一定的抑瘤效果，当5-FU与亮菌菌丝体多糖同时使用时，其对肿瘤细胞的作用效果远大于单独使用5-FU。
实施例4：亮菌菌丝体多糖对顺铂的体外抑瘤增效作用研究
实验材料：除了A549细胞代替SW620细胞，卡铂代替5-FU外，其余实验材料与实施例2的一样。
实验内容：除了A549细胞代替SW620细胞，卡铂代替5-FU外，其余实验内容与实施例2的一样。
实验结果：
肺癌细胞抑制率(％)(X±S，n＝6)
**表示与卡铂组相比较P<0.01，*表示与卡铂组相比较P<0.05
上述结果显示单独使用化疗药物卡铂时对于肺癌细胞A549具有一定的抑瘤效果，当卡铂与亮菌菌丝体多糖同时使用时，其对肿瘤细胞的作用效果远大于单独使用卡铂。
实施例5：亮菌菌丝体多糖对紫杉醇的体外抑瘤增效作用研究
实验材料：除了HeLa细胞代替SW620细胞，紫杉醇代替5-FU外，其余实验材料与实施例2的一样。
实验内容：除了HeLa细胞代替SW620细胞，紫杉醇代替5-FU，其余实验内容与实施例2的一样。
实验结果：
宫颈癌细胞抑制率(％)(X±S，n＝6)
**表示与紫杉醇组相比较P＜0.01,*表示与紫杉醇组相比较P＜0.05
上述结果显示单独使用化疗药物紫杉醇时对于宫颈癌细胞HeLa具有一定的抑瘤效果，抑制率为27.2％，当紫杉醇与亮菌菌丝体多糖同时使用时，其对肿瘤细胞的作用效果远大于单独使用紫杉醇。并且随着亮菌菌丝体多糖浓度的提高，作用效果越大，当多糖含量达到400μg/ml时对肿瘤细胞的抑制率达到47.16％，对肿瘤的抑制作用越强。
实施例6：亮菌菌丝体多糖对宾西他滨的体外抑瘤增效作用研究
实验材料：除了HepG2细胞代替SW620细胞，宾西他滨代替5-FU外，其余实验材料与实施例2的一样。
实验内容：除了HepG2细胞代替SW620细胞，宾西他滨实验结果：
肝癌细胞抑制率(％)(X±S，n＝6)
**表示与宾西他滨组相比较P＜0.01,*表示与宾西他滨组相比较P＜0.05
实施例6：亮菌菌丝体多糖联合5-FU对结肠癌细胞SW620小鼠异种移植肿瘤生长的抑制作用
实验材料：5-FU注射液以及SW620细胞与实施例2相同，实验对象为BALB/c nude雄性小鼠，四到六周鼠龄。
实验方法：小鼠先系统性培养3到4天，提前培养所需数量的SW620细胞，待到细胞生长到70％～80％时将其消化下来，在无菌条件下制备成5×107/ml细胞悬液，以0.lml接种于BALB/c nude雄性小鼠右侧腋窝皮下。待到小鼠右下肢皮下长出黄豆大小肿瘤后动物随机分组。小鼠随机分为4组：①生理盐水组(阴性对照组)；②5-FU 10mg/kg组(阳性对照组)；③5-FU10mg/kg+亮菌菌丝体多糖100mg/kg组(小剂量组)；③5-FU 10mg/kg+亮菌菌丝体多糖200mg/kg组(大剂量组)。给药方式如下，生理盐水组采用皮下注射0.2ml生理盐水，每三天注射一次，生理盐水灌胃0.2ml每天一次直到实验结束。5-FU 10mg/kg组采用皮下注射顺铂，注射体积为10mg/kg的浓度计算，每三天注射一次，生理盐水灌胃0.2ml每天一次直到实验结束。5-FU 10mg/kg+亮菌菌丝体多糖100mg/kg组采用皮下注射5-FU，注射体积为10mg/kg的浓度计算，每三天注射一次，每天灌胃0.2ml亮菌菌丝体多糖，使其体内的亮菌菌丝体多糖浓度为100mg/kg。5-FU 10mg/kg+亮菌菌丝体多糖200mg/kg组采用皮下注射5-FU，注射体积为10mg/kg的浓度计算，每三天注射一次，每天灌胃0.2ml亮菌菌丝体多糖，使其体内的亮菌菌丝体多糖浓度为200mg/kg，直到实验结束。
肿瘤体积每三天记录一次，肿瘤体积估算公式为：瘤体积(cm3)＝Π/6×a×b2式中，a代表肿瘤的长径，b代表肿瘤的短径，单位cm)
抑瘤率计算公式：1-实验组体积(V实)：阴性对照体积(V阴)
实验结果：如上表所示，5-FU 10mg/kg对肿瘤的抑制率为56.25％，低剂量组即5-FU10mg/kg+亮菌菌丝体多糖100mg/kg对肿瘤的抑制率为64.81％,高剂量组即5-FU10mg/kg+亮菌菌丝体多糖200mg/kg对肿瘤的抑制率为72.24％。由此结果可以得出亮菌菌丝体多糖联合化疗药物5-FU可以增强对肿瘤细胞的作用效果，并且随着多糖浓度的提高，作用效果更明显。
以上实验都验证了亮菌菌丝体多糖可以作为化疗药物的增效剂，增强化疗药物对于肿瘤细胞活性的抑制作用，并且随着亮菌菌丝体多糖浓度的增加，增效效果越好，大大提高了化疗药物的治疗效果。
Claims (3)
1.一种亮菌菌丝体多糖的应用，其特征在于：
将所述亮菌菌丝体多糖作为增效剂，与抗肿瘤化疗药物复配使用，以提高抗肿瘤的治疗效果；
所述亮菌菌丝体多糖通过如下步骤制备获得：
步骤1：亮菌进行液体发酵后，收集菌体进行烘干，研磨成粉末状；
步骤2：采用沸水提取法对亮菌胞内多糖进行多次提取，然后进行醇沉，除醇后冻干；
步骤3：使用Sevag 法去除冻干粉末所含的蛋白，然后加入氯仿和正丁醇的混合溶液，充分振摇后静置，离心，收集上清液，重复上述步骤，直到液体里面的蛋白含量肉眼可见较少时结束；
步骤4：将上清液装入透析袋中，在流动的自来水中透析，再用蒸馏水透析，将透析后的溶液进行醇沉、离心，收集沉淀，沉淀干燥；
步骤5：采用丙酮和乙醚溶液对沉淀进行连续多次洗涤，冻干碾磨后得到白色亮菌菌丝体多糖粉末；
步骤6：将得到的白色亮菌菌丝体多糖溶于蒸馏水中，依次通过1×105Da大小的超滤膜和5×104Da大小的超滤膜，得到大小在1×105Da-5×104Da的亮菌菌丝体多糖；
所述亮菌菌丝体多糖的总糖含量≥89%，单糖组成按摩尔百分比计为甘露糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：岩藻糖=25.6：14.2：54.1：6.1；
所述化疗药物包括卡铂、紫杉醇、5-FU、宾西他滨中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述亮菌菌丝体多糖与所述化疗药物的有效成分比为(100~200:1)。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述肿瘤包括人肺癌、人结肠癌、人肝癌、人宫颈癌。
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| GR01 | Patent grant | ||
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