KR20110093191A - 항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ｂｃｎｕ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물 - Google Patents

항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ｂｃｎｕ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20110093191A
KR20110093191A KR1020100013083A KR20100013083A KR20110093191A KR 20110093191 A KR20110093191 A KR 20110093191A KR 1020100013083 A KR1020100013083 A KR 1020100013083A KR 20100013083 A KR20100013083 A KR 20100013083A KR 20110093191 A KR20110093191 A KR 20110093191A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
streptomyces
bcnu
culture
medium
Prior art date
Application number
KR1020100013083A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101100716B1 (ko
Inventor
주우홍
최혜정
김동완
안철수
최연희
Original Assignee
창원대학교 산학협력단
조아제약주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 창원대학교 산학협력단, 조아제약주식회사 filed Critical 창원대학교 산학협력단
Priority to KR1020100013083A priority Critical patent/KR101100716B1/ko
Publication of KR20110093191A publication Critical patent/KR20110093191A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101100716B1 publication Critical patent/KR101100716B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 토양에서 분리한 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주는 다양한 세균 및 진균에 대하여 넓은 항균 스펙트럼을 나타내므로 항균 조성물로 널리 응용될 수 있으며, 특히 인체에 기회성 감영증을 유발하는 진균에 대하여 항균 활성을 나타내는 바, 피부 치료제 등으로 사용될 수 있다.

Description

항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ＢＣＮＵ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물 {Antibiotics-producing a novel strain of Streptomyces sp. BCNU 1001 and composition using the same}
본 발명은 토양에서 분리한 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물에 관한 것이다.
인체에 여러가지 감염을 일으키는 감염증 치료를 포함한 항생물질과 관련하여 미생물 유리 천연 생리활성 물질의 연구가 활발하게 진행되고 있다. 특히 진균류는 인체의 면역 기능이 약화되었거나, 항생물질, 호르몬류 또한 항암제 등의 과용으로 인하여 항생물질에 대한 내성이 생겼을 때 여러 가지 진균증을 일으키는데, 칸디다 속(Candida sp.) 진균에 의한 칸디다증(candidiasis), 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) 진균에 의한 국균증(aspegillosis), 크립토코커스 네오포르만스(Crytococcus neoformans)에 의한 효모균증, 뮤코 속(Mucor sp.)과 리조푸스 속 (Rhizopus sp.) 등의 진균에 의한 접합균류증(zygomycosis), 에피더모피톤 플로코섬(Epidermophyton floccosum)과 트리코피톤 속(Trichophyton sp.) 진균에 의한 피부사상균증(dermatophytosis) 등이 대표적으로 알려진 진균증이다.
다양한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)의 미생물이 생산하는 발견된 폴리엔(polyene)계 화합물은 에르고스테롤(ergosterol)과 복합체를 형성하여 곰팡이 세포막을 약화시킬 수 있으며, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에서 분리한 시스펜타신(cispentacin)은도 항균활성이 있는 것으로 알려져 있다. 그밖에도 암포테리신(amphotericin) B, 플루시토신(flucytosine) 및 그리세오풀빈(griseofulvin) 등이 천연항진균제로 널리 사용되고 있다. 그러나 암포테리신 B를 비롯한 몇몇 항진균제들은 인체독성을 야기하며, 그리세오풀빈은 항진균 스펙트럼이 좁아, 내성 균주 출현 등으로 인해 기존의 항진균제의 부작용을 대체할 수 있는 신규 천연 항진균 물질의 연구가 절실히 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 다양한 진균에 대하여 항진균 활성이 우수한 미생물을 제공하고자 연구, 노력한 결과, 토양에서 분리, 동정된 스트렙토마이세스 속 BCNU 1001 균주가 우수한 항진균 활성을 가지는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 항균 활성을 갖는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주 및 이를 포함하는 항균 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 항균 활성을 갖는 신규의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주(수탁번호: KCTC 18186P)를 그 특징으로 한다.
또한 본 발명은 균주, 균주 현탁액, 균주 배양액 또는 균주의 배양 상등액을 포함하는 항균 조성물을 또 다른 특징으로 한다.
또한 본 발명은,
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주를 pH 6.0 ~ 7.0의 복합 배지에서, 25 ~ 30℃, 5 ~ 15일간 배양하여 배양액을 얻는 단계;
상기 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 얻는 단계; 및
상기 배양 상등액을 유기 용매로 추출하는 단계
를 포함하는 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 배양 상등액 추출물의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주는 다양한 세균 및 진균에 대하여 넓은 항균 스펙트럼을 나타내므로 항균 조성물로 널리 응용될 수 있으며, 특히 인체에 기회성 감영증을 유발하는 진균에 대하여 항균 활성을 나타내는 바, 피부 치료제 등으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 16S rRNA 분석을 토대로 한 계통도이다.
도 2는 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 항균 활성을 측정하기 위하여 평판 배지 확산법에 의한 저해환의 크기를 확인한 사진이다.
A: B. subtilis KACC 10111 B: M. luteus KACC 10488
C: Sta . aureus IMSNU 11088 D: E. coli KACC 10080
E: P. aeruginosa IMSNU 10191 F: P. fluorescens KACC 10071
G: C. albicans KACC 30062 H: Filobasidium neoformans KCTC 7902
I: Sa . cerevisiae KCTC 7968.
도 3은 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 인체병원성 진균의 항진균 효과를 나타낸 사진이다.
a : A. niger b : T. mentagrophytes
c : T. rubrum
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 토양에서 분래된 신규의 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주를 제공하며, 상기 균주는 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2010 년 01 월 27 일자로 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 18186P).
본 발명에 의한 상기 균주, 균주 현탁액, 균주 배양액 또는 균주의 배양 상등액은 다양한 세균 및 진균에 대하여 넓은 항균 스펙트럼을 나타내며, 상기 균주, 균주 현탁액, 균주 배양액 또는 균주의 배양 상등액을 포함하는 항균 조성물을 권리범위로 포함한다. 상기 항균 조성물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코코스 루테우스(Micrococcus luteus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 애어로지노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플로레센스(Pseudomonas fluorescens), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 에피더모파이톤 플로코섬(Epidermophyton floccosum), 필로바시디움 네오포만스(Filobasidium neoformans), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 트리코피톤 멘타그로파이트(Trichophyton mentagrophytes) 및 트리코피톤 루브럼(Trichophyton rubrum) 중에서 선택된 균주에 대하여 항균 활성을 나타낸다.
본 발명의 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주가 생산하는 항균 활성 물질은 균주 현탁액, 균주 배양액 또는 균주의 배양 상등액에서 추출될 수 있으나, 바람직하게는 균주의 배양 상등액에서 추출될 수 있다.
본 발명은 상기 스트렙토마이세스 속 (Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 배양 상등액에서 항균 활성 물질을 추출하는 방법을 권리범위로 포함한다.
먼저, 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주를 pH 6.0 ~ 7.0의 복합 배지에서, 25 ~ 30℃, 5 ~ 15일간 배양하여 배양액을 얻는다. 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주를 배양하는 복합 배지로는 ISP (International Streptomyces Project) 배지, NA(nutrient agar) 배지, BHI(brain heart infusion agar) 배지, SDA (sabouroud dextrose agar), PDA(potato dextrose agar) 배지, NB(nutrient broth) 배지 등이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 ISP 배지, BHI 배지, SDA 배지, NB 배지를 사용하는 것이 좋다.
상기 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 얻은 뒤, 배양 상등액을 유기 용매로 추출하고, 이를 여과, 농축하면 항균 물질을 최적으로 추출한 배양 상등액 추출물을 얻을 수 있다. 이때 상기 유기 용매로는 극성에 따라 핵산, 디클로로메탄 및 에틸 아세테이트 중에서 선택된 유기 용매를 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 에틸 아세테이트를 사용한다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 하나의 예일 뿐, 이에 의하여 본 발명의 기술적 사상의 범위가 변경되거나 축소되는 것은 아니다.
실시예 1 : 균주의 분리, 생리, 생화학적 특징 및 16S rRNA 염기서열 분석을 통한 균주의 동정
본 발명의 균주는 강원도 평창군 개방산 일대의 토양시료에서 분리하였다.
채집한 토양시료를 음건한 후, 4 ℃에서 냉장보관하였다. 상기 토양 시료 1g을 10 ml의 NB(nutrient broth) 배지에 넣고 28℃에서 3주간 전배양한 후, 녹말 카제인 한천(starch casein agar), 오트밀 한천(oatmeal agar), PDA(potato dextrose agar) 및 NA(nutrient agar) 배지에 각각 100 μl씩 도말하여 28℃에서 3 주간 배양하여 방선균을 순수 분리하였다.
상기 분리된 균주의 동정을 위해 Bergey's manual of systematic bacteriology를 참고하여 생리, 생화학적 특성을 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
시험항목 특성(＋: 양성반응, －: 음성반응)
혐기성 조건에서의 배양 －
그람염색 양성
형태 긴 필라멘트, 대기(aerial) 생장
운동성 －
확산성 색소의 생산
(Production of diffusible pigment) 		＋
멜라닌 형성(Melanin formation) ＋
배양 온도 범위 25-35
배양 최적 온도 28
배양 pH pH 6.0-8.2
배양 최적 pH pH 6.4
NaCl 내성 0.025M-0.7M
배양 최적 NaCl 농도 0.05M
아밀라아제(Amylase) ＋
프로테아제(Protease) －
셀룰라아제(Cellulase) －
리파아제(Lipase) －
키티나제(Chitinase) －
겔라티나아제(Gelatinase) ＋
카탈라아제(Catalase) ＋
옥시다아제(Oxidase) －
우레아제(Urease) ＋
H2S 생산 ＋
니트레이트 리덕타아제(Nitrate reductase) －
페놀(0.01%) 존재하의 배양 ＋
소디움 아자이드(0.01%) 존재하의 배양 －
아라비노즈의 활용 ＋
프럭토오스(Fructose) ±
칼락토오스(Galactose) ±
글루코오스(Glucose) ＋＋
글리세롤(Glycerol) ＋
락토오스(Lactose) ±
말토오스(Maltose) ＋＋
만니톨(Mannitol) ±
만노오스(Mannose) ±
람노오스(Rhamnose) ±
녹말(Starch) ＋＋
수크로오스(Sucrose) ±
자일로오스(Xylose) ＋
스트렙토마이신(Streptomycin) 10 ug 에 대한 민감성 민감
암피실린(Ampicillin) 10 ug 에 대한 민감성 내성
테트라마이신(Tetramycin) 10 ug 에 대한 민감성 내성
겐타마이신(Gentamicin) 10 ug 에 대한 민감성 민감
클로람페니콜(Chlorampenicol) 5 ug 에 대한 민감성 내성
상기 표 1에서 보는 바와 같이 상기 균주는 25 ~ 35℃의 온도범위에서 배양 가능하며, pH 6.0 ~ 8.2, 염분 농도 0.025 M ~ 0.7 M에서 배양이 가능한 것으로 나타났다. 또한 아밀라아제(amylase), 겔라티나아제(gelatinase), 카탈라아제(catalase) 및 우레아제(urease)를 생성하며, 자화능 조사에서는 다양한 탄소원을 이용하는 것으로 나타났으며 특히 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose), 녹말(starch)에서 생육이 좋은 것으로 나타났다. 그리고 10 ug의 암피실린(ampicillin)과 테트라사이클린(tetracycline) 및 5 ug의 클로람페니콜(chlorampenicol)에 대해 내성이 있는 것으로 확인되었다.
또한 상기 균주의 16S rRNA 염기서열 분석을 실시하였으며, 16S rRNA의 PCR 분석은 16F (5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)와 1492R (5’-ACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3’) 프라이머를 사용하여 이루어졌다.
상기 염기서열을 Blast search를 통해 비교 분석한 결과, S. nojiriensis , S. cinnamonensis와 98% 상동성이 있는 것으로 나타났으며, 계통적으로는 S. virginiae, S. lavendulae 그리고 S. spororaveus의 서브클러스터(subcluster)에 속하는 균주로 확인된 바, 이를 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 2010 년 01 월 27 일자로 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 18186P).
상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 계통수는 neighbor joining 법과 bootstrap 분석을 통하여 이루어졌으며, 이에 따른 계통도를 도 1에 나타내었다.
또한, 상기 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 배양학적 특성을 ISP (International Streptomyces Project) 배지, NA 배지, BHI(brain heart infusion agar) 배지, SDA (sabouroud dextrose agar), 및 PDA 배지에서 28℃, 14일간 배양하면서 확인하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
배지 생장 기중균사체
(Aerial
mycelium) 		기질균사체
(Substrate
mycelium) 		포자(Spores) 기질균사의 색소
(Pigmentation of
substrate
mycelium) 		가용 색소
(Soluble
pigment)
ISP-1 중간 중간, 약간 하얀
크림색 		존재 불량, 보라색 옅은 회색 없음
ISP-2 양호 풍부, 붉은 갈색 존재 중간, 보라색 노란 갈색 없음
ISP-3 양호 풍부, 옅은 붉은
갈색		 존재 중간, 보라색 노란 갈색 없음
ISP-4 양호 풍부, 핑크 크림색 존재 중간, 보라색 노란 갈색 없음
ISP-5 중간 불량 존재 불량, 보라색 붉은 오렌지 없음
ISP-6 양호 불량 존재 불량, 보라색 붉은 오렌지 푸르스름한
보라색
ISP-7 양호 중간, 옅은 갈빛
회색 		존재 양호, 보라색 붉은 오렌지 없음
NA 양호 불량, 옅은 노란
갈색 		존재 없음 갈색 없음
BHI 양호 불량 존재 불량, 보라색 붉은 오렌지 없음
SDA 양호 풍부, 옅은 붉은
갈색 		존재 양호, 보라색 갈색 없음
PDA 중간 풍부, 회검정색 존재 중간, 보라색 노란 갈색 없음
ISP 2, ISP 3, ISP 4 및 SDA 배지에서 기질균사와 포자를 형성하며 생육이 좋은 것으로 나타났으며, ISP 6 배지에서 푸르스름한 보라색(Bluish Violet) 색소를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 2 : 항균활성의 조사
스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 항균 활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 실험하였다.
먼저 항균 활성을 측정하기 위하여, 그람 양성균인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KACC 10111(ATCC 465), 마이크로코코스 루테우스 (Micrococcus luteus) KACC 10488(ATCC 4698) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) IMSNU 11088(ATCC 6538)와, 그람 음성균인 대장균(Escherichia coli) IMSNU 10080(ATCC 10798), 슈도모나스 애어로지노사(Pseudomonas aeruginosa) IMSNU 10191(ATCC 10145) 및 슈도모나스 플로레센스(Pseudomonas fluorescens) KACC 10071 (ATCC 13525), 인체 병원성 진균로서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KACC 40280(ATCC 4695), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) KACC 30062(ATCC 10231), 에피더모파이톤 플로코섬(Epidermophyton floccosum) KCTC 6921, 필로바시디움 네오포만스(Filobasidium neoformans) KCTC 7902, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7968, 트리코피톤 멘타그로파이트(Trichophyton mentagrophytes) KCTC 6077(IFO 6202) 및 트리코피톤 루브럼 (Trichophyton rubrum) KCTC 6375을 한국농업미생물자원센터, 한국생물자원센터, 서울대학교 미생물연구소로부터 분양받았다.
상기 균주에 대한 항균활성은 평판 배지 확산법(agar diffusion method)을 이용하여 측정하였다. 상기 균주를 NB 배지 또는 LB 배지를 이용하여 최적 배양조건에서 Mcfaland 0.5 (1.5× 108)가 될 때까지 배양하였다. 그리고 ISP 1, ISP 2, BHI, SDA 및 NA 배지에 Mcfaland 0.5로 맞춘 상기 균주 배양액 100 μl를 골고루 도말하고 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 ISP 2 배지 배양액 10 μl를 각각 점적하였다. 18 ~ 24 시간 배양한 후 저해환(clear zone)의 크기를 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 3 및 도 2에 나타내었다.
배지 저해환 크기(mm)
ISP1 ISP2 BHI SDA NA
B. subtilis 11.80±1.93 15.20±1.06 10.87±1.21 15.33±1.51 13.60±0.53
M. luteus 17.80±1.93 27.33±3.06 11.87±0.23 28.00±6.08 15.20±1.06
Sta . aureus 9.27±0.64 8.22±0.03 - - 9.33±1.45
E. coli - - - - -
P. aerusinosa - - - - -
P. fluorescens - - - - -
C. albicans 11.87±0.23 12.53±2.20 9.87±1.03 13.47±1.29 12.53±2.20
F. neoformans 10.10±0.21 11.80±0.14 8.50±0.35 9.00±0.42 8.80±0.14
Sa . cerevisiae 12.13±2.50 13.87±1.80 10.33±0.58 15.33±1.50 13.53±0.50
상기 표 3에서 보는 바와 같이 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주는 그람 양성균과 인체병원성 진균에 대해 넓은 항균스펙트럼을 가지고 있었으며, 특히 ISP 2 배지에서 M. luteus에 대해서 27.33 mm의 높은 활성을 보였으며, 병원성 진균인 C. albicans와 S. cerevisiae에 대해서도 각각 12.53 mm와 13.87 mm 의 저해환을 나타내는 것을 확인하였다. 다만 그람 음성균에서는 항균활성이 나타나지 않았다.
또한, 주요 인체병원성 진균인 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 트리코피톤 멘타그로파이트(Trichophyton mentagrophytes) 및 트리코피톤 루브럼 (Trichophyton rubrum)에 대하여, 28℃에서 3 ~ 10일간 PDA 배지에서 배양한 후 Whipps(Whipps, J. M (1987), Effect of media on growth and interactions between a range of soil-borne glasshouse pathogens and antagonistic fungi. New Phytol. 107, 127-142.)에 개시된 대치배양법을 통하여 항균스펙트럼을 조사하였으며, 저해능은 증식저해율(growth inhibition: GI)로 나타내었다(수학식 1). 그 결과는 하기 표 4 및 도 3에 나타내었다.
Figure pat00001
GI: growth inhibition(%)
R1: 배양 후 균 사이의 거리, R2: 배양 전 접종 거리
A. niger T. rubrum T. mentagrophytes
GI(%) 46.97±0.13 46.10±1.09 45.59±1.01
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주는 아스퍼질러스 나이거, 트리코피톤 멘타그로파이트 및 트리코피톤 루브럼에 대하여 45 ~ 46%의 높은 저해효과를 나타낸 바, 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주는 인체병원성 진균에 대해서도 우수한 항균 활성이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3 : 항균 활성물질의 추출 및 이의 최소 저해농도(Minimum Inhibitory Concentration; MIC) 측정
ISP 2 배지에서 28℃, pH 6.4의 조건에서 7일간 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주를 배양하여 배양액을 얻었다.
(항균 물질의 최적 생산 조건을 조사하기 위한 기본배지로 ISP 1, ISP 2, BHI, SDA 그리고 NB를 사용하였으며, 각종 pH, 온도조건, NaCl 농도 등을 달리하여 7~14일 동안 배양하였다. 24시간 간격으로 배양액을 회수하여, 항균활성 조사를 위한 시료로 사용하였다. 항균활성 물질의 생산 조건에 대한 기초 조사 결과, 항균활성 스펙트럼이 넓고 경제적인 ISP 2 배지를 기본배지로 선정하였으며, 28, pH 6.4로 7일간 배양했을 때가 가장 최적 생산 조건이었다)
상기 배양액 1 L를 회수하여 원심분리(7,500 × g, 10분, 4℃)하여 배양 상등액을 얻었으며, 99.5 중량% 에틸아세테이트 2 L를 가하여 25℃에서 약 24시간 동안 추출하였다. 상기 추출물을 와트만(whatman no. 2) 여과지를 이용하여 여과하고, 회전 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 37℃에서 감압, 농축하여 배양 상등액 추출물 0.123 g을 얻었다.
상기 배양 추출물 시료를 이용하여 상기 실시예 1에서 열거된 그람 양성균 3종, 그람 음성균 3종 및 인체병원성 진균 7종에 대하여 최소 저해 농도를 측정하였다.
그람 양성균과 그람 음성균의 최소 저해 농도의 측정하기 위하여, 96 well plate에 ISP 2 배지를 이용하여 Mcfaland 0.5로 맞춘 대상 균주 배양액 100 μl를 분주하고, 상기 에틸아세테이트에 의한 배양 상등액 추출물을 2배씩 단계적으로 희석하여 농도별로 제조하여 10 μl씩 가하였다(National Committee for Clinical Laboratory Standards. (2004), Methods for antimicrobial susceptibility testing of anaerobic acteria: Approved Standard. 6th ed., Vol. 24, NCCLS Document M11-A6. Pennsylvania, U.S.A.). 각 균의 최적온도(P. fluorescens: 26℃ / B. subtilis , M. lutes: 30℃ / S. aureus , E. coli: 35℃)에서 24 시간 배양한 후에, 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 최소 저해 농도를 측정하였고, 대조군으로 Streptomycin과 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
균주
Streptomycin
(㎍/disc) 		배양 상등액 추출물의 최소 저해 농도(MIC)
(mg/disc)
B. subtilis 1.25 0.25
M. luteus 0.625 0.125
Sta. aureus 0.625 0.125
E. coli 0.625 0.25
P. aeruginosa 5 0.25
P. fluorescens 1.25 0.125
상기 표 5에서 보는 바와 같이, 0.125 mg/ml의 저농도에서 그람 양성균인 M. luteus, S. aureus와 그람 음성균인 P. fluorescens의 생육을 저해하였으며, B. subtilis, E. coli 및 P. aeruginosa에 대해서도 0.25 mg/ml 농도에서 생육을 저해하였다.
또한 인체병원성 진균의 최소 저해 농도는 PDA 배지에 대상 진균을 접종하고 상기 에틸아세테이트에 의한 배양 상등액 추출물을 2배씩 단계적으로 희석하여 농도별로 제조하여 10 μl씩 멸균한 paper disc에 점적하였다. 28℃에서 7일 동안 배양한 후 570 nm에서 흡광도를 측정함으로써 최소 저해 농도를 측정하였고, 대조군으로는 Itraconazol과 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
균주 Itraconazol
(㎍/disc) 		배양 상등액 추출물의 최소 저해 농도(MIC)
(mg/disc)
A. niger 0.0199 0.5
C. albicans 0.0796 0.125
Ep. floccosum 1.274 >1
F. neoformans 0.0398 >1
Sa. cerevisiae 0.159 0.25
T. mentagrophytes 2.548 0.5
T. rubrum 2.548 >1
상기 표 6에서 보는 바와 같이 0.125 mg/ml의 저농도에서 C. albicans의 생육을 저해하였으며, 0.25 mg/ml에서 Sa . cerevisiae, 0.5 mg/ml 농도에서 A. niger와 T. mentagrophytes의 생육을 저해하였다.
결국 본 발명의 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주는 다양한 세균 및 진균에 대하여 넓은 항균 스펙트럼을 나타낼 수 있음을 확인할 수있었다.
한국생명공학연구원 KCTC18186 20100127

Claims (5)

  1. 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주(수탁번호: KCTC 18186P).
  2. 제 1 항의 균주, 균주 현탁액, 균주 배양액 또는 균주의 배양 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 조성물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코코스 루테우스(Micrococcus luteus), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 애어로지노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 플로레센스(Pseudomonas fluorescens), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 필로바시디움 네오포만스(Filobasidium neoformans), 에피더모파이톤 플로코섬(Epidermophyton floccosum), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 트리코피톤 멘타그로파이트(Trichophyton mentagrophytes) 및 트리코피톤 루브럼(Trichophyton rubrum) 중에서 선택된 균주에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 조성물.
  4. 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주를 pH 6.0 ~ 7.0의 복합 배지에서, 25 ~ 30℃, 5 ~ 15일간 배양하여 배양액을 얻는 단계;
    상기 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 얻는 단계; 및
    상기 배양 상등액을 유기 용매로 추출하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 배양 상등액 추출물의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 유기 용매는 핵산, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트 중에서 선택된 용매인 것을 특징으로 하는 항균 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) BCNU 1001 균주의 배양 상등액 추출물의 제조방법.
KR1020100013083A 2010-02-12 2010-02-12 항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ｂｃｎｕ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물 KR101100716B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100013083A KR101100716B1 (ko) 2010-02-12 2010-02-12 항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ｂｃｎｕ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020100013083A KR101100716B1 (ko) 2010-02-12 2010-02-12 항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ｂｃｎｕ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110093191A true KR20110093191A (ko) 2011-08-18
KR101100716B1 KR101100716B1 (ko) 2011-12-29

Family

ID=44929919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020100013083A KR101100716B1 (ko) 2010-02-12 2010-02-12 항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ｂｃｎｕ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101100716B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101467990B1 (ko) * 2013-08-22 2014-12-02 충남대학교산학협력단 스트렙토마이세스 속 3e-1 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물
WO2023222098A1 (en) * 2022-05-18 2023-11-23 Huang Chih Hung A new streptomyces spororaveus strain and a new antibiotics against bacteria and fungi

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100604203B1 (ko) 2005-05-02 2006-07-25 고려대학교 산학협력단 식물병원균에 항균활성을 가지는 신규 스트렙토마이세스천안엔시스 브이씨-에이46 균주 및 이를 이용한 식물병방제용 살균제

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101467990B1 (ko) * 2013-08-22 2014-12-02 충남대학교산학협력단 스트렙토마이세스 속 3e-1 균주 및 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물
WO2023222098A1 (en) * 2022-05-18 2023-11-23 Huang Chih Hung A new streptomyces spororaveus strain and a new antibiotics against bacteria and fungi

Also Published As

Publication number Publication date
KR101100716B1 (ko) 2011-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Arasu et al. In vitro antimicrobial activity of Streptomyces spp. ERI-3 isolated from Western Ghats rock soil (India)
Singh et al. Optimisation of process parameters for growth and bioactive metabolite produced by a salt-tolerant and alkaliphilic actinomycete, Streptomyces tanashiensis strain A2D
Oskay Effects of some Environmental Conditions on Biomass and Antimicrobial Metabolite Production by Streptomyces Sp., KGG32.
KR101757623B1 (ko) 락토바실러스 플란타룸 kcc-10 및 이를 포함하는 조성물
McQuilken et al. Production of macrosphelide A by the mycoparasite Coniothyrium minitans
Valan et al. Characterization and phylogenetic analysis of novel polyene type antimicrobial metabolite producing actinomycetes from marine sediments: Bay of Bengal India
Lakshmipathy et al. A morphological, biochemical and biological studies of halophilic Streptomyces sp. isolated from saltpan environment
Omran et al. Production, purification, and characterization of bioactive metabolites produced from rare actinobacteria Pseudonocardia alni
GB2220657A (en) Antifungal fermentation product
Hathout et al. Novel Egyptian bacterial strains exhibiting antimicrobial and antiaflatoxigenic activity
KR101100716B1 (ko) 항균활성 물질을 생산하는 신규의 스트렙토마이세스 속 ｂｃｎｕ 1001 균주 및 이를 이용한 항균 조성물
Roshan et al. Isolation and screening of bioactive compound from actinomycetes isolated from salt pan of Marakanam district of the state Tamil Nadu, India
Choi et al. Broad-spectrum in vitro antimicrobial activities of Streptomyces sp. strain BCNU 1001
KR100485877B1 (ko) 타크롤리무스를 생산하는 미생물 및 이를 이용한타크롤리무스의 대량 생산방법
Bhosale et al. Optimization and characterization of antifungal metabolite from a soil actinomycete Streptomyces indiaensis SRT1
Alhasan et al. In Vitro Antimicrobial Activity of The Filtrate Crude Extract Produced by Aspergillus niger
KR102125358B1 (ko) 액화력 및 당화력이 높은 신규한 아스퍼질러스 오리재 if18-2 균주 및 이의 건조 방법
JP2012191899A (ja) アザ糖を生産する微生物
Allam et al. Biological activity of Streptomyces noursei against ochratoxin A producing Aspergillus niger
Chaudhuri et al. Isolation of potential antimicrobial metabolite from endophytic bacillus amyloliquefaciensDL06 of carnivorous plant Droseraburmanniivahl
Deshmukh et al. Characterization of novel antibacterial Actinomycetes strain N8 from saline soil of Vidarbha region
RU2817695C1 (ru) Штамм Streptomyces sp. YVZ014 - продуцент антибиотика лизолипина X
Biswas et al. Isolation and characterization of Streptomyces sp. ANBS-15 and antimicrobial activities of its secondary metabolites
CN107164248B (zh) 酵母菌dd12-7菌株及其应用
Anurangi et al. CELLULOLYTIC, AMYLOLYTIC ACTIVITY AND ANTIBACTERIAL PROPERTIES OF FUNGAL ENDOPHYTES ISOLATED FROM Avicennia marina

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150107

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151202

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161208

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171205

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181203

Year of fee payment: 8