CN107011410A - 一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种石英砂提取污泥胞外聚合物的方法及应用。所述方法包括以下步骤：S1.原位获取污泥样品，冲洗干净，吸干水分，均一化处理；S2.处理后的污泥加入石英砂和盐溶液混合，所述污泥测量其VSS，石英砂和VSS重量比为70~140:1，石英砂尺寸为32目~150目，在温度0~4℃、转速600~900rpm条件下，搅拌1~3h，得到泥砂混合液；S3.对泥砂混合液离心取上清，过滤除去杂质获得胞外聚合物粗品；S4.将胞外聚合物粗品超滤浓缩获得胞外聚合物样品。本发明获得的污泥胞外聚合物在最大程度上保持了其生物活性，基本不造成细胞破裂，无其他强酸强碱有机试剂的干扰与掩蔽，能更完整的提取胞外聚合物，同时有利于后续蛋白质组学鉴定等工作。

Description

一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法及其应用
技术领域
本发明涉及污水生物处理中污泥胞外聚合物的提取和分析领域，尤其涉及厌氧氨氧化污泥三种不同形态菌群胞外聚合物的提取和蛋白质组学相关分析，更具体地，涉及一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法及其应用。
背景技术
胞外聚合物(EPS)是微生物在一定环境条件下分泌于胞外的复杂非均相高分子聚合物，主要组成为蛋白质、多糖、核酸和脂质，是菌胶团、颗粒污泥和生物膜的重要组分，是维持污泥三维网络空间的重要骨架。
EPS在污水生物处理过程中发挥重要作用：可以促进细胞的粘附；维持微生物聚集体的稳定性；减小生物毒物和非生物毒物对细胞的侵害；从环境中吸附和积累营养物质，必要时为微生物补充碳源和能源；积累、保留和稳定细胞分泌的胞外酶等。
EPS的提取是对其进行成分和功能分析的重要前提，标准方法尚未确立。同一方法对不同样品EPS提取效率不同，不同方法提取同一样品EPS效率也相差很大。不存在一种方法可将样品EPS全部提取，所有方法在一定程度上都会造成细胞破裂。而评价一个提取方法是否合适，不仅要考虑EPS产量高低，也要考虑提取方法对细胞和EPS中大分子物质的破坏程度以及是否干扰后续测定等相关研究。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种不破坏微生物活性、无化学试剂掩蔽干扰、菌体细胞无破损的污泥胞外聚合物的物理提取方法。
本发明的另一个目的在于所述提取方法在蛋白质组学SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中的应用。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，包括如下步骤：
S1.原位获取污泥样品，冲洗干净，吸干水分，均一化处理；
S2.处理后的污泥加入石英砂和盐溶液混合，在温度0~4℃、转速600~900rpm条件下，搅拌1~3h，得到泥砂混合液；
S3.对泥砂混合液离心取上清，过滤除去杂质获得胞外聚合物粗品；
S4.将胞外聚合物粗品超滤浓缩获得胞外聚合物样品；
其中，步骤S2所述污泥测量其VSS，石英砂和VSS重量比为70~140:1，石英砂尺寸为32目~150目。
本发明利用石英砂低温中速摩擦剪切作用实现胞外聚合物与菌体的高效分离，通过控制温度、转速和时间使这种物理作用缓和不强烈。石英砂与污泥的重量配比以及石英砂尺寸对所述摩擦剪切作用具有影响：石英砂重量过小，不能与全部的污泥进行作用，过大则搅拌不均匀使得作用不充分，导致胞外聚合物与菌体不能有效分离；石英砂尺寸过小，颗粒过细很难对污泥产生剪切作用，过大则不能充分与污泥接触作用，导致胞外聚合物与菌体不能有效分离。本发明合理地选用石英砂的重量和尺寸，达到有效的摩擦剪切作用，提取的胞外聚合物的胞外生物大分子活性高、菌体细胞基本无破裂。而现有的甲醛-NaOH法、加热法等提取方法，提取的胞外聚合物易造成细胞破裂、胞外生物大分子活性降低。
步骤S1所述污泥样品为含絮体形态厌氧氨氧化菌群、含颗粒形态厌氧氨氧化菌群、含生物膜形态厌氧氨氧化菌群中的一种。
步骤S1所述冲洗可采用本领域现有技术常用溶液，如去离子水、质量分数0.05%NaCl溶液等。
优选地，步骤S2所述盐溶液为质量分数0.05%NaCl溶液，以维持细胞的渗透压。
步骤S3所述离心，离心温度为0~4℃，离心力为10000~17000g，离心时间为20~30min；所述过滤采用0.22~0.45um聚醚砜灭菌过滤器。
步骤S4所述超滤浓缩操作为采用超滤离心管在0~4℃，3000~5000g离心力下作用45~60min，浓缩至蛋白质浓度为1ug/uL以上。
所述超滤离心管型号为15mL 10KD超滤离心管。
所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法得到的污泥胞外聚合物。
所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法在蛋白质组学聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测步骤中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公布的采用石英砂提取污泥胞外聚合物的物理方法，通过均一化、石英砂分离、离心过滤、浓缩等操作步骤，基本实现了对三种不同形态生物污泥EPS的提取。通过石英砂低温中速摩擦剪切作用实现胞外聚合物与菌体的高效分离，相比甲醛-NaOH法、加热法等提取方法，无其它试剂干扰掩蔽，胞外生物大分子活性高，细胞基本无破裂，为后续蛋白质组学鉴定等相关实验奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为实施例1提取污泥胞外聚合物的操作示意图。
图2为实施例1胞外聚合物的提取效果图。
图3为实施例1、对比例1、对比例2提取的胞外聚合物进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步解释说明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应包括在本发明权利要求的保护范围之内。
以下实施例和对比例中，所用原料均为市售商品。
测试与表征方法
VSS的测定，按照《水和废水监测分析方法》；
对絮体、生物膜、颗粒态厌氧氨氧化污泥提取的胞外聚合物分别测定蛋白质、多糖、DNA的含量，测试方法为建立Folin酚法蛋白质标线测定蛋白质含量、建立苯酚-浓硫酸法标线测定多糖的含量、建立二苯胺法标线测定DNA的含量；
建立SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，检测提取的絮体与颗粒态厌氧氨氧化菌胞外聚合物的电泳结果。
实施例1
一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，操作如图1所示。具体步骤如下：
S1.取絮体、生物膜、颗粒三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥；用质量分数0.05%NaCl溶液清洗污泥2~3次，然后用分析滤纸吸干污泥表面水分，再用玻璃棒轻轻碾压均一化处理污泥样品。上述均一化处理的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥的VSS分别为0.0517g、0.0502g、0.0558g。
S2.各取2g上述均一化处理的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥、7g尺寸为32目的石英砂、30mL 质量分数0.05%NaCl溶液于50mL烧杯中，烧杯型号的上下外径分别为5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每种形态的污泥设置3个重复。然后在4℃条件下，用3cm的C型搅拌子，600rpm搅拌3h，得到泥砂混合液。
S3.将上述泥砂混合液转移至50mL离心管中，4℃、10000g离心力下高速离心，20min后取上清，并用0.22um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤，获得胞外聚合物粗品。检测提取的胞外聚合物粗品蛋白质、多糖、DNA的含量，测试结果如图2所示，絮体厌氧氨氧化原位污泥提取的胞外聚合物中蛋白质、多糖、DNA含量分别为：38.1652mg/g、6.0537mg/g、1.9645mg/g；生物膜厌氧氨氧化原位污泥提取的胞外聚合物中蛋白质、多糖、DNA含量分别为：16.3015mg/g、9.6261mg/g、4.0774mg/g；颗粒态厌氧氨氧化原位污泥提取的胞外聚合物中蛋白质、多糖、DNA含量分别为：29.9695mg/g、7.5523mg/g、1.6521mg/g。提取的这三种不同形态原位污泥的蛋白质平均含量高达73.2%。特别地，提取的絮体与颗粒态原位污泥DNA含量均在4.2%左右，说明细胞并未出现严重破裂，胞外聚合物的提取效果良好，而生物膜中虽蛋白质相对含量较低，但DNA绝对含量并未出现严重超标，可基本认定满足实验预期要求。
S4.最后将胞外聚合物粗品滤液装入超滤离心管，在4℃、4000g离心力作用下，浓缩45min使最终蛋白质浓度为1ug/uL以上。
实施例2
S1.取实施例1中的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥；用去离子水清洗污泥4次，然后用分析滤纸吸干污泥表面水分，再用玻璃棒轻轻碾压均一化处理污泥样品。
S2.准确称取各形态2g上述均一化处理的污泥、4.0g尺寸为150目的石英砂、30mL质量分数0.05%NaCl溶液于50mL烧杯中，烧杯型号的上下外径分别为5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每组3个重复。然后在0℃条件下，用3cm的C型搅拌子，900rpm搅拌1h，得到泥砂混合液。
S3.将上述泥砂混合液转移至50mL离心管中，0℃、17000g离心力下高速离心，30min后取上清，并用0.45um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。
S4.将滤液装入超滤离心管，在0℃、3000g离心力作用下，浓缩50 min使最终蛋白质浓度为1ug/uL以上。
实施例3
S1.取实施例1中的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥；用质量分数0.05%NaCl溶液清洗污泥4次，然后用分析滤纸吸干污泥表面水分，再用玻璃棒轻轻碾压均一化处理污泥样品。
S2.准确称取各形态2g上述均一化处理的污泥、5g尺寸为80目的石英砂、30mL 质量分数0.05%NaCl溶液于50mL烧杯中，烧杯型号的上下外径分别为5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每组3个重复。然后在2℃条件下，用3cm的C型搅拌子，700rpm搅拌2h，得到泥砂混合液。
S3.将上述泥砂混合液转移至50mL离心管中，0℃、17000g离心力下高速离心，30min后取上清，并用0.45um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。
S4.将滤液装入超滤离心管，在0℃、3000g离心力作用下，浓缩60min使最终蛋白质浓度为1ug/uL以上。
实施例4
S1.取实施例1中的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥；用质量分数0.05%NaCl溶液清洗污泥4次，然后用分析滤纸吸干污泥表面水分，再用玻璃棒轻轻碾压均一化处理污泥样品。
S2.准确称取各形态2g上述均一化处理的污泥、6g尺寸为60目的石英砂、30mL 质量分数0.05%NaCl溶液于50mL烧杯中，烧杯型号的上下外径分别为5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每组3个重复。然后在1℃条件下，用3cm的C型搅拌子，800rpm搅拌2h，得到泥砂混合液。
S3.将上述泥砂混合液转移至50mL离心管中，0℃、17000g离心力下高速离心，30min后取上清，并用0.35um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。
S4.将滤液装入超滤离心管，在0℃、3000g离心力作用下，浓缩55min使最终蛋白质浓度为1ug/uL以上。
实施例5
S1.取实施例1中的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥；用质量分数0.05%NaCl溶液清洗污泥4次，然后用分析滤纸吸干污泥表面水分，再用玻璃棒轻轻碾压均一化处理污泥样品。
S2.准确称取各形态2g上述均一化处理的污泥、4g尺寸为120目的石英砂、30mL 质量分数0.05%NaCl溶液于50mL烧杯中，烧杯型号的上下外径分别为5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每组3个重复。然后在2℃条件下，用3cm的C型搅拌子，800rpm搅拌1h，得到泥砂混合液。
S3.将上述泥砂混合液转移至50mL离心管中，0℃、17000g离心力下高速离心，30min后取上清，并用0.30um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。
S4.将滤液装入超滤离心管，在0℃、3000g离心力作用下，浓缩60min使最终蛋白质浓度为1ug/uL以上。
实施例6
S1.取实施例1中的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥；用质量分数0.05%NaCl溶液清洗污泥4次，然后用分析滤纸吸干污泥表面水分，再用玻璃棒轻轻碾压均一化处理污泥样品。
S2.准确称取各形态2g上述均一化处理的污泥、6g尺寸为50目的石英砂、30mL 质量分数0.05%NaCl溶液于50mL烧杯中，烧杯型号的上下外径分别为5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每组3个重复。然后在0℃条件下，用3cm的C型搅拌子，900rpm搅拌1h，得到泥砂混合液。
S3.将上述泥砂混合液转移至50mL离心管中，0℃、17000g离心力下高速离心，30min后取上清，并用0.45um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。
S4.将滤液装入超滤离心管，在0℃、3000g离心力作用下，浓缩60min使最终蛋白质浓度为1ug/uL以上。
对比例1
S1.取实施例1中的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥；用质量分数0.05%NaCl溶液清洗污泥2~3次，然后用分析滤纸吸干污泥表面水分，再用玻璃棒轻轻碾压均一化处理污泥样品。
S2.准确称取各形态2g上述均一化处理的污泥、9g尺寸为32目的石英砂、30mL 质量分数0.05%NaCl溶液于50mL烧杯中，烧杯型号的上下外径分别为5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每组3个重复。然后在4℃条件下，用3cm的C型搅拌子，600rpm搅拌3h，得到泥砂混合液。
S3.将上述泥砂混合液转移至50mL离心管中，4℃、10000g离心力下高速离心，20min后取上清，并用0.22um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。检测蛋白质，多糖，DNA的含量，提取的三种形态污泥胞外聚合物的蛋白质，多糖，DNA最低含量分别为42.37mg/g，23.13mg/g，7.33mg/g。表明DNA含量过高，细胞破裂较为严重。
对比例2
S1.取实施例1中的三种不同形态的厌氧氨氧化原位污泥；用质量分数0.05%NaCl溶液清洗污泥2~3次，然后用分析滤纸吸干污泥表面水分，再用玻璃棒轻轻碾压均一化处理污泥样品。
S2.准确称取各形态2g上述均一化处理的污泥、7g尺寸为180目的石英砂、30mL 质量分数0.05%NaCl溶液于50mL烧杯中，烧杯型号的上下外径分别为5.2cm和4.3cm，高5.9cm。每组3个重复。然后在4℃条件下，用3cm的C型搅拌子，600rpm搅拌3h，得到泥砂混合液。
S3.将上述泥砂混合液转移至50mL离心管中，4℃、10000g离心力下高速离心，20min后取上清，并用0.22um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。检测蛋白质，多糖，DNA的含量，提取的三种形态污泥胞外聚合物的蛋白质，多糖，DNA的最高含量分别为20.69mg/g，6.89mg/g，2.96mg/g。提取的物质含量过低，提取效果不好，不利于后续的研究与应用。
对比例3
准确称取实施例1中的2g絮体与颗粒态厌氧氨氧化污泥，加入20mL含0.6%甲醛（V/V）和0.9% NaCl（W/V）溶液，4℃下固定1h。然后加入8mL 1mol/L NaOH溶液，4℃解离3h。再将解离后的厌氧氨氧化菌混合液转移至50mL离心管中，4℃、10000g离心力下高速离心，20min后取上清。并用0.22um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。将滤液装入超滤离心管，在4℃、4000g离心力作用下，浓缩 45min使最终蛋白质浓度为约5ug/uL。进行SDS-PAGE凝胶电泳检测实验。
对比例4
准确称取实施例1中的2g絮体与颗粒态厌氧氨氧化污泥，转移至锥形瓶中加入质量分数0.05%NaCl溶液30mL，60℃水浴30min。之后转移至50mL离心管中，4℃、10000g高速离心，20min后取上清。并用0.22um聚醚砜（PES）针头过滤器过滤。将滤液装入超滤离心管，在4℃、4000g离心力作用下，浓缩 45min使最终蛋白质浓度为约2 ug/uL。
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图3所示，可看出仅实施例1提取的EPS中蛋白质显现清晰条带，说明蛋白质的生物活性高，结构组成未被破坏，而对比例3的甲醛-NaOH法、对比例4的加热法提取的EPS在不同程度上造成了蛋白质的生物活性降低，未显现条带。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.原位获取污泥样品，冲洗干净，吸干水分，均一化处理；
S2.处理后的污泥加入石英砂与盐溶液混合，在温度0~4℃、转速600~900rpm条件下，搅拌1~3h，得到泥砂混合液；
S3.对泥砂混合液离心取上清，过滤除去杂质获得胞外聚合物粗品；
S4.将胞外聚合物粗品超滤浓缩获得胞外聚合物；
其中，步骤S2所述污泥测量其VSS，石英砂和VSS重量比为70~140:1，石英砂尺寸为32目~150目。
2.根据权利要求1所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，步骤S1所述污泥样品为含絮体形态厌氧氨氧化菌群、含颗粒形态厌氧氨氧化菌群、含生物膜形态厌氧氨氧化菌群中的一种。
3.根据权利要求1所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，步骤S2所述盐溶液为质量分数0.05%NaCl溶液。
4.根据权利要求1所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，步骤S3所述离心，离心温度为0~4℃，离心力为10000~17000g，离心时间为20~30min；所述过滤采用0.22~0.45um聚醚砜灭菌过滤器。
5.根据权利要求1所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，步骤S4所述超滤浓缩为采用超滤离心管在0~4℃，3000~5000g离心力条件下作用45~60min，浓缩至蛋白质浓度为1ug/uL以上。
6.根据权利要求5所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法，其特征在于，所述超滤离心管型号为15mL 10KD超滤离心管。
7.权利要求1~6中任一项所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法得到的污泥胞外聚合物。
8.权利要求1~7中任一项所述采用石英砂提取污泥胞外聚合物的方法在蛋白质组学聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中的应用。
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