CN111018945A - 一种石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，包括步骤：(1)原位获取厌氧氨氧化菌生物膜，均一化处理，冲洗并过滤，得湿泥；(2)将湿泥与石英砂、质量百分比浓度为0.01％～0.1％的非离子型表面活性剂混合，温度为0℃～4℃，低速搅拌，得到泥砂混合液；(3)将泥砂混合液，温度为0℃～4℃、高速进行离心处理，取上清液，过滤，弃渣；(4)对步骤(3)收集的上清液，温度为0℃～4℃，中速超滤离心多次，浓缩至一定体积，得到厌氧氨氧化菌胞外蛋白。可得到含量较多的胞外蛋白，蛋白质的生物活性高，细胞溶解率低，细胞破裂小，结构组成未被破坏，可直接用于后续深度蛋白组学分析检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物膜胞外蛋白的提取技术领域，更具体的涉及一种石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法。
背景技术
厌氧氨氧化菌(Anammox)是一类严苛在厌氧、避光生境下生长的化能自养型微生物，隶属于浮霉菌门(Planctomycetes)。此类“红菌”可直接将氨氮(NH4+-N)和亚硝酸盐(NO2--N)转化为氮气(N2)，大大缩短氮循环途径。因此，以厌氧氨氧化菌(Anammox)为基础的废水脱氮工艺，俨然已经成为当下最节能的环境生物技术。
厌氧氨氧化菌(Anammox)形态多样，但大都以生物膜形式存在。厌氧氨氧化菌(Anammox)生物膜胞外蛋白是其胞外聚合物(EPS)中最主要的活性物质，其含量是反映厌氧氨氧化菌(Anammox)生长代谢的重要指标，更直接关系到菌体表面的电负性和亲疏水特性，这些特性又是利于生物膜形成的关键因素。近些年来，厌氧氨氧化菌(Anammox)生物膜胞外蛋白的提取受到越来越多的关注和重视。由于胞外蛋白质的得率、生物活性很大程度上取决于提取方式，因此，其提取手段十分重要。
目前，厌氧氨氧化菌(Anammox)生物膜胞外蛋白的提取方法主要有离心、加热、超声、酸碱提、生物酶解、离子交换树脂(CER)等。物理方式(如：离心、加热、超声)尽管提取量低，操作时间较长，但作用条件大都温和，基本无其它物质的干扰掩蔽。化学提取(如：酸碱提、CER)简单高效，提取量大，但极易造成细胞裂解，破坏胞外蛋白的活性结构，对下游分析造成干扰；即使后续通过透析沉淀等纯化操作，也会不可避免地造成胞外蛋白的二次损失。生物酶解，反应快速温和、易于操控，但其提取成本较高，不利于大规模工业应用生产。因此，在经济成本、胞外蛋白天然活性、工业化扩大生产方面，物理提取仍具备其固有优势。
有鉴于此，有必要提供一种石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法以解决现有的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，既可以得到的含量较多的胞外蛋白，且细胞溶解率低，蛋白质的生物活性高，细胞破裂小，结构组成未被破坏，还可直接用于后续深度蛋白组学分析检测。
为实现上述目的，本发明提供了一种石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，包括步骤：
(1)原位获取厌氧氨氧化菌生物膜，均一化处理，冲洗并过滤后，得湿泥；
(2)将步骤(1)得到的湿泥与石英砂、质量百分比浓度为0.01％～0.1％的非离子型表面活性剂混合，温度为0℃～4℃，低速搅拌，得到泥砂混合液；
(3)将步骤(2)得到的泥砂混合液，温度为0℃～4℃、高速进行离心处理，取上清液，过滤，弃渣；
(4)对步骤(3)收集的上清液，温度为0℃～4℃，中速超滤离心多次，浓缩至一定体积，得到厌氧氨氧化菌胞外蛋白。
与现有技术相比，本申请采取石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法中，利用石英砂和低剂量(质量百分比浓度为0.01％～0.1％)的非离子型表面活性剂协同作用，提高疏水性膜蛋白的溶解度，以进一步达到疏水提取效应。其中，提取温度为0～4℃，可有效保证蛋白质生物大分子天然活性。该提取方法具有生物活性高、胞外蛋白活性有保障、含量大、细胞破裂小的优势、疏水提取效果明显的优势。
其中，步骤(1)中，可采用去离子水或质量分数为0.05％NaCl溶液进行冲洗，优选为采用质量分数为0.05％NaCl溶液进行冲洗。
步骤(2)中，石英砂粒径为0.4mm～1.0mm，比如，石英砂粒径为0.4mm、0.6mm、0.8mm、1.0mm。
较佳地，非离子型表面活性剂为吐温80，其质量百分比浓度为0.1％。
较佳地，步骤(2)中还可加入0.05％NaCl盐溶液与非离子型表面活性剂混合。
较佳地，测试步骤(2)中泥砂混合液的VSS，石英砂和VSS重量比为20～200：1。优选为，石英砂和VSS重量比为100：1。
较佳地，采用旋涡搅拌，低速转速为200rpm～800rpm，搅拌时间为1h～4h。
步骤(3)中，采用0.22um～0.45um聚醚砜灭菌过滤器进行过滤。
较佳地，离心力为8000g～12000g，离心时间为20～30min。
步骤(4)中，离心力为4000g～6000g，超滤离心时间每次0.5～1h。
较佳地，一定体积为100uL～200uL。
较佳地，超滤离心采用超滤离心管进行，超滤离心管型号为15mL 10KD的超滤离心管，蛋白浓度浓缩至1ug/ul以上。
本申请还提供了一种采用上述石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法提取的生物膜胞外蛋白。
本申请还提供了一种采用上述石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法在蛋白质组学聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中的应用。
通过大量的试验研究发现，本申请的有益效果有：
1.石英砂经济成本低廉，具有亲水表面。采用旋涡研磨，利用旋涡过程中的颗粒与污泥间的相互摩擦剪切作用，实现对胞外蛋白的有效剥离，剥离得的厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白生物活性高、含量大、细胞破裂小。
2.以溶有低剂量非离子型表面活性剂吐温80的0.05％NaCl盐溶液为提取液，无污染、无毒害，协同石英砂提取显著提高溶解性差的厌氧氨氧化菌生物膜胞外疏水蛋白含量，高效、节能和环保。
3.石英砂协同表面活性剂吐温80提取的厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白粗品可直接进行凝胶基础的蛋白质组学深度分析，无需过多提纯造成蛋白损失。
4.废水处理中污泥胞外蛋白，副产值潜力巨大，该提取方式经济、环保、市场前景广阔，值得工业推广应用。
附图说明
图1为对照组及实施例1-4中胞外蛋白提取的效果图。
图2为对比例1-9中胞外蛋白提取的效果图。
图3为实施例1、对照组、对比例5及对比例6-9中提取的胞外蛋白进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步解释说明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应包括在本发明权利要求的保护范围之内。
以下实施例和对比例中，所用原料均为市售商品。
测试与表征方法
VSS的测定，按照《水和废水监测分析方法》；
测试蛋白质、多糖、DNA 的含量，测试方法分别为BCA蛋白浓度检测、苯酚-硫酸法、二苯胺法；
建立SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，检测提取的胞外蛋白的电泳结果。
实施例1
一种石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，包括步骤：
(1)原位获取厌氧氨氧化菌生物膜，采用玻璃棒进行均一化处理，采用质量分数为0.05％NaCl溶液进行冲洗，冲洗2～3次，通过滤纸进行过滤，得湿泥；
(2)将步骤(1)得到的湿泥，称取3g，置于50mL的烧杯中，加入石英砂、质量百分比浓度为0.1％吐温80和0.05％NaCl水溶液，温度为0℃～4℃，石英砂粒径为1.0mm，石英砂和VSS重量比为100：1，转速400rpm，搅拌2h，得到泥砂混合液；
(3)将步骤(2)得到的泥砂混合液，温度为0℃～4℃、离心力为10000g进行离心处理，离心时间为20min，取上清液，采用0.22um聚醚砜灭菌过滤器进行过滤，弃渣；
(4)对步骤(3)收集的上清液，温度为0℃～4℃，离心力为6000g，采用15mL 10KD的超滤离心管进行超滤离心多次，每次0.5～1h，浓缩至体积为100uL，得到厌氧氨氧化菌胞外蛋白。
其中，通过湿泥测量其VSS，确定石英砂对厌氧氨氧化菌生物质比例在100:1条件下，称取石英砂的质量。
对步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图1所示，其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为29.49mg/g-VSS，比例高达76.54％，细胞溶解率为9.72％，细胞破裂可忽略不计(胞外DNA占生物质总DNA含量的10％以下，都可认定细胞未出现严重破裂)。
对照组中，其与实施例1基本相同，仅无表面活性剂吐温80，其厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为23.35mg/g-VSS。
实施例2-4
实施例2-4与实施例1的提取方法基本相同，不同点在于加入吐温80的质量百分比浓度不相同。
实施例2中加入吐温80的质量百分比浓度为0.03％；
实施例3中加入吐温80的质量百分比浓度为0.05％；
实施例4中加入吐温80的质量百分比浓度为0.07％；
对实施例2-4中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图1所示。
其中，对于实施例2中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为25.61mg/g-VSS，比例高达75.55％，细胞溶解率为8.80％，细胞破裂可忽略不计。
对于实施例3中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为26.05mg/g-VSS，比例高达74.82％，细胞溶解率为8.95％，细胞破裂可忽略不计。
对于实施例4中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为27.81mg/g-VSS，比例高达75.69％，细胞溶解率为9.67％，细胞破裂可忽略不计。
对比例1
对比例1与实施例1的提取方法基本相同，不同点在于：对比例1中加入的表面活性剂是阴离子型表面活性剂，十二烷基硫酸钠(SDS)；而实施例1加入的表面活性剂是非离子型表面活性剂，吐温80(Tween 80)。
对对比例1中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图2所示，其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为139.28mg/g-VSS，比例高达85.08％，细胞溶解率为42.3％，远高于10％，细胞破裂严重。
对比例2
对比例2与实施例1的提取方法基本相同，不同点在于：对比例2中加入的表面活性剂是阳离子型表面活性剂，十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)；而实施例1加入的表面活性剂是非离子型表面活性剂，吐温80(Tween 80)。
对对比例2中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图2所示，其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为40.1mg/g-VSS，比例高达84.94％，细胞溶解率为5.78％，远低于10％，细胞破裂可忽略不计。
对比例3
对比例3与实施例1的提取方法基本相同，不同点在于加入吐温80的质量百分比浓度不相同。实施例1加入吐温80的质量百分比浓度为0.1％，而对比例3加入吐温80的质量百分比浓度为1％。
对对比例3中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图2所示。其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为44.67mg/g-VSS，比例高达68.17％，细胞溶解率为17.13％，细胞破裂较为严重。
对比例4
对比例4与对比例3的提取方法基本相同，不同点在于：对比例3中加入吐温80的质量百分比浓度为1％；而对比例4中加入十二烷基硫酸钠(SDS)的质量百分比浓度为1％。
对对比例4中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图2所示。其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为219.16mg/g-VSS，比例高达86.46％，细胞溶解率为60.53％，细胞破裂极为严重。
对比例5
对比例5与对比例3的提取方法基本相同，不同点在于：对比例3中加入吐温80的质量百分比浓度为1％；而对比例5中加入十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)的质量百分比浓度为1％。
对对比例5中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图2所示。其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白提取量为83.63mg/g-VSS，比例高达87.88％，细胞溶解率为7.6％，细胞破裂可忽略不计。
对比例6
采用加热法提取厌氧氨氧化菌(Anammox)生物膜胞外蛋白，步骤如下：
(1)原位获取厌氧氨氧化菌生物膜，采用玻璃棒均一化处理，采用质量分数0.05％NaCl溶液冲洗2～3次，滤纸过滤，得湿泥；
(2)对步骤(1)所得湿泥，称取3g，置于50mL烧杯中，加入质量百分比浓度0.05％NaCl水溶液。在温度60℃的条件下，水浴加热30min；
(3)对步骤(2)获得的污泥混合液，温度0～4℃，离心力为10000g进行离心处理，离心时间为20min，取上清液，采用0.22um聚醚砜灭菌过滤器进行过滤，弃渣；
(4)对步骤(3)收集的上清液，温度为0℃～4℃，离心力为6000g，采用15mL 10KD的超滤离心管进行超滤离心多次，每次0.5～1h，浓缩至体积为100uL，得到厌氧氨氧化菌胞外蛋白。
对该对比例中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图2所示，其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白的比例高达71.62％，细胞溶解率为5.03％，细胞破裂可忽略不计。
对比例7
采用离子交换树脂法(CER)提取厌氧氨氧化菌(Anammox)生物膜胞外蛋白，步骤如下：
(1)原位获取厌氧氨氧化菌生物膜，采用玻璃棒均一化处理，采用质量分数0.05％NaCl溶液冲洗2～3次，滤纸过滤，得湿泥；
(2)对步骤(1)所得湿泥，称取3g，置于50mL烧杯中，加入质量百分比浓度0.05％NaCl水溶液。温度0～4℃，加入Na+型交换树脂，树脂对污泥质量比例70g/g-VSS，转速200rpm，搅拌运行3h，得泥砂混合液；
(3)对步骤(2)获得的污泥混合液，温度0～4℃，离心力为10000g进行离心处理，离心时间为20min，取上清液，采用0.22um聚醚砜灭菌过滤器进行过滤，弃渣；
(4)对步骤(3)收集的上清液，温度为0℃～4℃，离心力为6000g，采用15mL 10KD的超滤离心管进行超滤离心多次，每次0.5～1h，浓缩至体积为100uL，得到厌氧氨氧化菌胞外蛋白。
对该对比例中步骤2获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图3所示，其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白的比例约51.45％，细胞溶解率为10.40％，细胞破裂可忽略不计。
对比例8
采用乙二胺四乙酸EDTA提取厌氧氨氧化菌(Anammox)生物膜胞外蛋白，步骤如下：
(1)原位获取厌氧氨氧化菌生物膜，采用玻璃棒均一化处理，采用质量分数0.05％NaCl溶液冲洗2～3次，滤纸过滤，得湿泥；
(2)对步骤(1)所得湿泥，称取3g，置于50mL烧杯中，加入10mM Tris，10mM EDTA，2.5％NaCl，调节pH为8.3，温度0～4℃，转速200rpm，搅拌运行15min，得泥砂混合液；
(3)对步骤(2)获得的污泥混合液，温度0～4℃，离心力为10000g进行离心处理，离心时间为20min，取上清液，采用0.22um聚醚砜灭菌过滤器进行过滤，弃渣；
(4)对步骤(3)收集的上清液，温度为0℃～4℃，离心力为6000g，采用15mL 10KD的超滤离心管进行超滤离心多次，每次0.5～1h，浓缩至体积为100uL，得到厌氧氨氧化菌胞外蛋白。
对该对比例中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图2所示，其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白的比例约82.02％，细胞溶解率为25.65％，细胞破裂较为严重。
对比例9
采用碱液NaOH提取厌氧氨氧化菌(Anammox)生物膜胞外蛋白，步骤如下：
(1)原位获取厌氧氨氧化菌生物膜，采用玻璃棒均一化处理，采用质量分数0.05％NaCl溶液冲洗2～3次，滤纸过滤，得湿泥；
(2)对步骤(1)所得湿泥，称取3g，置于50mL烧杯中，加入1mol/L NaOH提取液，温度0～4℃，转速200rpm，搅拌运行15min，得泥砂混合液；
(3)对步骤(2)获得的污泥混合液，温度0～4℃，离心力为10000g进行离心处理，离心时间为20min，取上清液，采用0.22um聚醚砜灭菌过滤器进行过滤，弃渣；
(4)对步骤(3)收集的上清液，温度为0℃～4℃，离心力为6000g，采用15mL 10KD的超滤离心管进行超滤离心多次，每次0.5～1h，浓缩至体积为100uL，得到厌氧氨氧化菌胞外蛋白。
对该对比例中步骤3获取的上清液，检测其中的蛋白质、多糖、DNA的含量。测试结果如图2所示，其中，厌氧氨氧化菌生物膜胞外蛋白的比例约50.91％，细胞溶解率为24.05％，细胞破裂较为严重。
为了进行深度蛋白组学分析检测，对实施例1、对照组、对比例5及对比例6-9中获得的蛋白浓缩液进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，结果如图3所示。
从图3可知，实施例1、对比例7、对比例8及对照组中的胞外蛋白分离条带清晰，说明蛋白质的生物活性高，结构组成未被破坏。而对比例6、对比例5、对比例9中的胞外蛋白降解严重，蛋白活性遭到破坏，未显现出清晰分离条带。然而，结合图2中胞外蛋白提取效果图分析，对比例7中采用CER提取厌氧氨氧化菌(Anammox)生物膜胞外蛋白，提取含量比较低，仅51.45％。对比例8采用TE法提取，造成的细胞破裂较严重(细胞溶解率高达25.65％)不再具备后续蛋白质组学分析优势。对照组的提取率低于70％。综上可知，实施例1中，石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，既可以得到的含量较多的胞外蛋白，且细胞溶解率低，蛋白质的生物活性高，结构组成未被破坏，可直接用于后续深度蛋白组学分析检测。
应当指出，以上具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求限定的范围。
Claims (10)
1.一种石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)原位获取厌氧氨氧化菌生物膜，均一化处理，冲洗并过滤后，得湿泥；
(2)将步骤(1)得到的湿泥与石英砂、质量百分比浓度为0.01％～0.1％的非离子型表面活性剂混合，温度为0℃～4℃，低速搅拌，得到泥砂混合液；
(3)将步骤(2)得到的泥砂混合液，温度为0℃～4℃、高速进行离心处理，取上清液，过滤，弃渣；
(4)对步骤(3)收集的上清液，温度为0℃～4℃，中速超滤离心多次，浓缩至一定体积，得到厌氧氨氧化菌胞外蛋白。
2.根据权利要求1所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，其特征在于，所述石英砂粒径为0.4mm～1.0mm。
3.根据权利要求1所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂为吐温80。
4.根据权利要求3所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，其特征在于，所述吐温80的质量百分比浓度为0.1％。
5.根据权利要求1所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，其特征在于，测试步骤(2)中泥砂混合液的VSS，石英砂和VSS重量比为20～200：1。
6.根据权利要求1所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，其特征在于，低速转速为200rpm～800rpm。
7.根据权利要求1所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中采用质量分数为0.05％NaCl溶液进行冲洗。
8.根据权利要求1所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法，其特征在于，步骤(4)中，一定体积为100uL～200uL。
9.如权利要求1-8任一项所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法提取的生物膜胞外蛋白。
10.如权利要求1～8中任一项所述的石英砂协同非离子型表面活性剂提取生物膜胞外蛋白的方法在蛋白质组学聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中的应用。
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