CN101830996B - 一种蓝藻多糖的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种蓝藻多糖的分离纯化方法，属于生化分离技术领域。本发明步骤为：蓝藻多糖粗提取液的制备；絮凝剂处理蓝藻多糖粗提液；减压浓缩；乙醇沉淀蓝藻多糖；沉淀进行洗脱，而后真空干燥，获得一定纯度的蓝藻多糖。本发明涉及以絮凝剂絮凝杂质，不采用通常的等电点法、sevage法等去除蛋白质等杂质。采用本发明简化了纯化过程的步骤，操作简单，而且降低了制备过程中化学试剂使用量，节约了资源，所得多糖纯度最高可达91.18％。原料采用鲜藻或干藻粉，甚至是野外的太湖水华蓝藻，从而提供了一种解决藻类资源规模化利用的技术方法。
Description
技术领域
本发明提供一种从蓝藻中提取分离蓝藻多糖的简单、快捷的方法。属于生化分离技术领域。
背景技术
国内外人员研究表明，藻类具有抗疲劳、抗辐射、抗病毒、抑制肿瘤、抗过敏、增强免疫力等多种功能，这决定了藻类及其活性成分在功能性食品研究与开发方面有着广阔的应用前景。海藻多糖的生物活性主要表现在抗凝血、抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等作用，其生物活性与多糖的化学组成及糖苷键构型、多糖的取代基特别是硫酸基的存在及含量、多糖的空间结构、多糖的分子量大小等有关。
关于红藻、褐藻及绿藻的多糖及其生物活性的研究报道已经较多，但对蓝藻多糖的研究较少。随着近几年环境污染的加剧，大规模蓝藻爆发事件也时有报道，尤其是2007年夏季太湖蓝藻的大爆发更是引起全国乃至全世界的关注。加强环境治理的同时，如果能从蓝藻中开发出有利用价值的多糖物质，将其应用于食品、医药等领域，就会达到变废为宝的目的。
我国目前的经济微藻的开发和利用处于初级加工阶段，海藻多糖的提取及分离纯化多停留在实验室研究阶段，已报道的有关藻类多糖的专利技术，例如中国专利CN1297948A、CN1397567A、CN101445565A等采用等电点法、sevage法、三氯乙酸法等去蛋白质，离子交换柱纯化多糖，虽然使得多糖的纯度得到一定程度的提高，但生产成本增加，过程繁琐；CN1392360A、CN101037483A运用具有活性氨基与羟基的阳离子生物絮凝剂壳聚糖或改性淀粉、或溶于水时电离出磺酸根的阴离子型絮凝剂提取海藻多糖，加入量为50ppm～500ppm，且价格相对无机高分子或聚丙烯酰胺类絮凝剂较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种蓝藻多糖的分离纯化方法，通过聚铁或聚丙烯酰胺类絮凝剂处理蓝藻多糖粗提液，从而简化蓝藻多糖的分离纯化步骤，降低生产成本，提高生产强度，获得纯度较高的蓝藻多糖，应用于保健食品、新药等的研究开发。
本发明的技术方案：一种蓝藻多糖的分离纯化方法，步骤为：
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备；(2)絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液；(3)减压浓缩；(4)乙醇沉淀蓝藻多糖；(5)沉淀进行洗脱、真空干燥，最终获得纯度84％以上的蓝藻多糖。
所述的方案，步骤(1)中，蓝藻多糖粗提取液的制备，采用水作提取剂，藻粉或鲜藻与水的固液质量比为1∶20～30，搅拌均匀后浸泡1h，置于80～100℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液3800～6000r/min离心10-15min，所得离心后清液，即为蓝藻多糖粗提取液；
所述的方案，步骤(2)中，在容器中加入蓝藻多糖粗提取液，添加絮凝剂工作液，絮凝剂在蓝藻多糖粗提取液中的含量为5ppm～50ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5～24h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；所述的絮凝剂为聚铁或聚丙烯酰胺类絮凝剂；
所述的方案，步骤(3)中，将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10；
所述的方案，步骤(4)中，将步骤(3)中获得的浓缩液加入1～10倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min，得到沉淀；
所述的方案，步骤(5)中，将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，洗脱后的沉淀真空干燥，得到纯度84％以上的蓝藻多糖。
蓝藻的种类为蓝藻或螺旋藻干粉，或取自野外的由多种微藻组成的太湖水华蓝藻。
絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液，配置的聚铁絮凝剂的工作液为质量浓度5％的水溶液，相对分子质量高达1×105；聚丙烯酰胺类絮凝剂选用阳离子聚丙烯酰胺FO4240SH、阴离子聚丙烯酰胺AN926SHu或非离子聚丙烯酰胺FA920VHM，其工作液浓度均为质量浓度0.1％的水溶液。以上几种聚丙烯酰胺类絮凝剂均是由江苏特麦高科环境技术有限公司提供。
本发明的有益效果：本发明与现有技术相比，主要具有以下优点：1.采用本发明的方法所得的多糖纯度最高可达91.18％。2.本发明所采用的方法操作简单，简化了纯化过程的步骤，减少了对化学试剂的使用量，节约了资源，适用于大规模工业化应用。3.本发明从蓝藻中提取多糖，对资源的综合利用具有重要意义，有效地解决藻类资源的利用和高值化问题。
具体实施方式
实施实例1
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备
取产于江苏东台的钝顶螺旋藻干粉，采用水作提取剂，藻粉与水的固液质量比为1∶20，搅拌均匀后浸泡1h，置于80℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液3800r/min离心15min，得到提取液中糖含量为2.22mg/mL。
(2)聚铁絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液
在容器中加入螺旋藻多糖粗提取液(原始pH＝7.25)，添加聚铁絮凝剂工作液，聚铁絮凝剂在螺旋藻多糖粗提取液中的含量为50ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；液体中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为47.22％、21.79％、7.74％和60.00％。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10。
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤(3)中获得的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min，得到沉淀。沉淀中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为27.11％、32.31％、36.56％和83.21％。
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，真空干燥，所得多糖的纯度为91.18％。
实施例2
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备
取产于江苏无锡太湖的新鲜微藻，采用水作提取剂，鲜藻与水的固液质量比为1∶30，置于80℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液6000r/min离心10min，得上层液体，得到提取液中糖含量为1.80mg/mL。
(2)聚铁絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液
在容器中加入蓝藻多糖粗提取液(原始pH＝7.25)，添加聚铁絮凝剂工作液，聚铁絮凝剂在蓝藻多糖粗提取液中的含量为50ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；液体中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为38.38％、13.39％、4.03％和57.14％。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10。
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤(3)中获得的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min，得到沉淀。沉淀中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为25.12％、34.52％、32.56％和85.10％。
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，真空干燥，所得多糖的纯度为89.92％。
实施例3
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备
取产于江苏东台的钝顶螺旋藻干粉，采用水作提取剂，藻粉与水的固液质量比为1∶20，搅拌均匀后浸泡1h，置于80℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液3800r/min离心15min，得到提取液中糖含量为2.22mg/mL。
(2)聚丙烯酰胺类阴离子絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液
在容器中加入蓝藻多糖粗提取液(原始pH＝7.25)，添加阴离子聚丙烯酰胺AN926SHu絮凝剂工作液，絮凝剂在蓝藻多糖粗提取液中的含量为10ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；液体中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为40.88％、18.23％、4.03％和55.71％。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10。
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤(3)中获得的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min得到沉淀。沉淀中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为30.12％、34.51％、40.32％和85.71％。
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，真空干燥，所得多糖的纯度为87.99％。
实施例4
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备
取产于江苏无锡太湖的新鲜微藻，采用水作提取剂，鲜藻与水的固液质量比为1∶30，置于80℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液6000r/min离心10min，得上层液体，得到提取液中糖含量为1.80mg/mL。
(2)聚丙烯酰胺类阴离子絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液
在容器中加入蓝藻多糖粗提取液(原始pH＝7.25)，添加阴离子聚丙烯酰胺AN926SHu絮凝剂工作液，絮凝剂在蓝藻多糖粗提取液中的含量为10ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；液体中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为36.45％、16.45％、9.29％和62.86％。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10。
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤(3)中获得的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min得到沉淀。沉淀中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为33.76％、16.34％、12.14％和83.60％。
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，真空干燥，所得多糖的纯度为85.80％。
实施例5
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备
取产于江苏东台的钝顶螺旋藻干粉，采用水作提取剂，藻粉与水的固液质量比为1∶20，搅拌均匀后浸泡1h，置于80℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液3800r/min离心15min，得到提取液中糖含量为2.22mg/mL。
(2)聚丙烯酰胺类非离子絮凝剂处理蓝藻粗多糖提取液
在容器中加入蓝藻多糖粗提取液(原始pH＝7.25)，添加非离子聚丙烯酰胺FA920VHM絮凝剂工作液，絮凝剂在蓝藻粗多糖提取液中的含量为5ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；液体中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为33.68％、16.36％、29.98％和62.80％。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10。
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤(3)中获得的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min得到沉淀。沉淀中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为36.24％、19.63％、26.98％和78.80％。
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，真空干燥，所得多糖的纯度为86.00％。
实施例6
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备
取产于江苏无锡太湖的新鲜微藻，采用水作提取剂，鲜藻与水的固液质量比为1∶30，置于80℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液6000r/min离心10min，得上层液体，得到提取液中糖含量为1.80mg/mL。
(2)聚丙烯酰胺类非离子絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液
在容器中加入蓝藻多糖粗提取液(原始pH＝7.25)，添加非离子聚丙烯酰胺FA920VHM絮凝剂工作液，絮凝剂在蓝藻粗多糖提取液中的含量为5ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；液体中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为35.56％、17.91％、24.14％和62.80％。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10。
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤(3)中获得的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min得到沉淀。沉淀中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为39.49％、25.65％、29.82％和78.20％。
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，真空干燥，所得多糖的纯度为86.86％。
实施例7
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备
取产于江苏东台的钝顶螺旋藻干粉，采用水作提取剂，藻粉与水的固液质量比为1∶20，搅拌均匀后浸泡1h，置于80℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液3800r/min离心15min，得到提取液中糖含量为2.22mg/mL。
(2)聚丙烯酰胺类阳离子絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液
在容器中加入蓝藻多糖粗提取液(原始pH＝7.25)，添加阳离子聚丙烯酰胺絮凝剂FO4240SH工作液，絮凝剂在蓝藻多糖粗提取液中的含量为10ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；液体中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为39.15％、26.17％、31.24％和64.30％。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10。
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤3中获得的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min，得到沉淀。沉淀中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为47.87％、27.64％、18.78％和59.98％。
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，真空干燥，所得多糖的纯度为84.32％。
实施例8
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备
取产于江苏无锡太湖的新鲜微藻，采用水作提取剂，鲜藻与水的固液质量比为1∶30，置于80℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液6000r/min离心10min，得上层液体，得到提取液中糖含量为1.80mg/mL。
(2)聚丙烯酰胺类阳离子絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液
在容器中加入蓝藻多糖粗提取液(原始pH＝7.25)，添加阳离子聚丙烯酰胺FO4240SH絮凝剂工作液，絮凝剂在蓝藻多糖粗提取液中的含量为10ppm，先快速搅拌1min(200r/min)，再慢速搅拌15min(50r/min)，室温下静置0.5h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；液体中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为36.45％、16.45％、9.29％和62.86％。
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10。
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤(3)中获得的浓缩液加入3倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min得到沉淀。沉淀中蛋白质、色素、浊度残余率和糖回收率分别为46.61％、29.36％、21.91％和76.39％。
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，真空干燥，所得多糖的纯度为84.60％。
Claims (3)
1.一种蓝藻多糖的分离纯化方法，其特征在于步骤为：蓝藻多糖粗提取液的制备；絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液；减压浓缩；乙醇沉淀蓝藻多糖；沉淀进行洗脱，真空干燥，获得纯度84％以上的蓝藻多糖；
(1)蓝藻多糖粗提取液的制备：采用水作提取剂，藻粉或鲜藻与水的固液质量比为1∶20～30，搅拌均匀后浸泡1h，置于80～100℃下加热搅拌4h后，蓝藻破壁液3800～6000r/min离心10-15min，所得离心后清液，即为蓝藻多糖粗提取液；
(2)絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液：在容器中加入蓝藻多糖粗提取液，添加絮凝剂工作液，絮凝剂在蓝藻多糖粗提取液中的含量为5ppm～50ppm，先200r/min快速搅拌1min，再50r/min慢速搅拌15min，室温下静置0.5～24h后，3800r/min离心15min，沉淀去除，得到上层液体；所述的絮凝剂为聚铁或聚丙烯酰胺类絮凝剂；
(3)减压浓缩：将步骤(2)中获得的液体旋转蒸馏得浓缩液，浓缩液体积为液体未浓缩前体积的1/10；
(4)乙醇沉淀蓝藻多糖：将步骤(3)中获得的浓缩液加入1～10倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后置于-4℃冷藏过夜，3800r/min离心15min，得到沉淀；
(5)沉淀洗脱、真空干燥：将收集的沉淀用丙酮、乙醚各洗脱两次，洗脱后的沉淀真空干燥，得到纯度84％以上的蓝藻多糖。
2.根据权利要求1所述的蓝藻多糖的分离纯化方法，其特征在于蓝藻的种类为蓝藻或螺旋藻干粉，或取自野外的由多种微藻组成的太湖水华蓝藻。
3.根据权利要求1所述的蓝藻多糖的分离纯化方法，其特征在于絮凝剂处理蓝藻多糖粗提取液，配置的聚铁絮凝剂的工作液为质量浓度5％的水溶液，相对分子质量为1×105；聚丙烯酰胺类絮凝剂选用阳离子聚丙烯酰胺FO4240SH、阴离子聚丙烯酰胺AN926SHu或非离子聚丙烯酰胺FA920VHM，其工作液浓度均为质量浓度0.1％的水溶液。
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