CN101353364A - 一种从鼠脑组织中获得小分子rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从小鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，该方法包括以下步聚：包括以下步骤：1)研磨：加入Ezol充分研磨裂解细胞；2)去不溶物：4℃、12000×g离心10min，取上清；3)氯仿抽提：200－250μl氯仿/1ml Ezol，剧烈振荡后室温静置；4)4℃，12000×g，离心15min，取上清；5)异丙醇沉淀：加入异丙醇1－2ml，反复倒置，混匀，－20℃沉淀12h；6)4℃，12000×g，离心10min，弃上清；7)洗涤沉淀：加入75％乙醇1ml，使沉淀悬浮；8) 4℃，7500×g，离心5min，弃上清；9)干燥沉淀，溶于焦碳酸二乙酯处理水中；10)YM－100过柱分离小分子RNA。本发明有益的效果：证明该发明可以有效地获得小分子RNA，解决了传统RNA提取方法小分子RNA获取效率低难题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中提取RNA的方法，主要是一种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法。
背景技术
小分子RNA近年来已成为RNA研究的热点，已有大量的文献报道小分子RNA参与了生物体中重要生命活动的调控。小分子RNA的有效富集是研究小分子RNA的前提条件，由于小分子RNA在总RNA中所占比例较低(约5％-10％左右)加上传统的RNA提取方法的局限性，故小分子RNA的得率很低。microRNA是具有代表性的小分子RNA，它是一类长约22nt具有调节功能的非编码小分子RNA，它参与了发育时序、细胞增殖与死亡以及肿瘤发生的调控，在生物体的分化、增殖、发育以及凋亡过程中具有重要作用。
目前，常用的RNA提取方法有TriZol试剂快速提取法、十二烷基磺酸钠-醋酸钾法、苯酚法、异硫氰酸肌法、十六烷基三甲基溴化铵法、氯化锂法等。所有这些方法都是针对一般的总RNA提取建立的，没有考虑到小分子RNA富集的特殊需要，所以以这些提取方法获得的总RNA中的小分子RNA的含量极低，不足以满足小分子RNA研究的要求。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术的缺陷，而提供一种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。这种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，包括以下步骤：
1)研磨：取50mg小鼠脑组织，加入1ml Ezol，用匀浆器研磨至匀浆，于室温放置10min；
2)去不溶物：4℃，12000×g，离心10min；将上清转入无核糖核酸酶的1.5ml离心管；
3)氯仿抽提：每管加入200-250μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；
4)4℃，12000×g，离心15min；取上清至新的无RNase的1.5ml离心管中；
5)异丙醇沉淀：加入1ml-2ml异丙醇，混匀，-15℃至-20℃，沉淀12h；
6)4℃，12000×g，离心10min；弃上清；
7)加入1ml预冷的75％乙醇，洗涤沉淀；4℃，7500×g，离心5min；
8)弃上清，真空干燥，沉淀溶于30μl焦碳酸二乙酯处理水DEPC-H2O中；
9)NanoDrop分光光度计检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性胶检测总RNA的完整性；
10)YM-100柱子中加入0.1M EDTA 150μl润洗，4℃，5000×g，离心6min；按5μg上样量取出相应样品的体积，与150μl 0.1M EDTA混合均匀后转移到YM-100柱子中4℃，5000×g，离心6min。过柱所得即小分子RNA。
2、根据权利要求1所述的从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于：在步骤3)中，加入的氯仿用量为：250μl氯仿/1ml Ezol。
3、根据权利要求1所述的从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于：在步聚5)中异丙醇沉淀条件是：异丙醇的量为1ml，沉淀的温度为-20℃，沉淀的时间为12h。
本发明的有益效果：结果可用RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测小分子RNA来改方法有效获得了小分子RNA。过于短小的RNA分子可用特异性的茎环引物来作为逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的引物，该技术在miRNA扩增效率方面比传统方法高100多倍。该方法可用分离得到的小分子RNA也可直接用总RNA作为反转录模板。
附图说明
图1为用本发明的方法提取的小鼠脑组织总RNA的电泳图谱
图2为从用本发明的方法提取的总RNA中分离获得的小分子RNA的检测结果
其中，图1中1％琼脂糖MOPS电泳，60V，40min；图2中2％琼脂糖，1×TAE缓冲液，70v，45min。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步地详细描述：
这种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，包括以下步骤：：
1)取两份50mg左右小鼠脑组织，各加入1ml Ezol，用匀浆器研磨至匀浆，分别标记为MB1、MB2；于室温放置10min；
2)4℃，12000×g，离心10min；将上清转入无核糖核酸酶(RNase)的1.5ml离心管；
3)每管加入250μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；
4)4℃，12000×g，离心15min；取上清至新的无RNase的1.5ml离心管中；
5)加入1ml异丙醇，混匀，-20℃沉淀12h；
6)4℃，12000×g，离心10min；弃上清；
7)加入1ml预冷的75％乙醇，洗涤沉淀；4℃，7500×g，离心5min；
8)弃上清，真空干燥，沉淀溶于30μl DEPC-H2O中；
9)NanoDrop分光光度计(ND-1000)检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性胶检测总RNA的完整性。结果如表1、图1所示。
10)YM-100柱子中加入0.1M EDTA 150μl润洗，4℃，5000×g，离心6min；按5μg上样量取出相应样品的体积，与150μl 0.1M EDTA混合均匀后转移到YM-100柱子中，4℃，5000×g，离心6min。过柱所得即小分子RNA。
RT-CR检测MicroRNA(以miR-let-7a为例)：
1)用YM-100分离得到的小分子RNA进行反转录，RT体系如下：
在无RNase的0.2ml PCR管中依次加入
| 小分子RNA溶液 | 1.00μl |
| DEPC-H2O | 3.50μl |
70℃变性5min，冰上放置3min，再依次加入
| RNase抑制剂(40U/μl) | 0.50μl |
| dNTP混合物(各10mM，RNase-free) | 1.00μl |
| 5×M-MuLV缓冲液 | 2.00μl |
| miR-let-7a特异性茎环引物(2μM) | 0.50μl |
| M-MuLV反转录酶(200U/μl) | 0.50μl |
| DEPC-H2O | 1.00μl |
总体积为10μl，混匀后稍离心在PCR仪中进行反应；反应参数设置为
| 42℃ | 60min |
| 70℃ | 10min |
2)将RT产物进行PCR扩增反应
在0.2ml PCR管中依次加入
| 10×PCR反应缓冲液 | 1.00μl |
| MgCl2 | 0.20μl |
| dNTP混合物(各10mM) | 0.22μl |
| Taq DNA聚合酶(5U/μl) | 0.16μl |
| 正向引物(Forward primer)(10μM) | 0.40μl |
| 反义引物(Reverse primer)(10μM) | 0.40μl |
| 反转录产物 | 0.80μl |
| ddH2O | 6.82μl |
总体积为10μl，混匀后稍离心在PCR仪中进行反应；反应参数设置为：
3)反应结束后取3μl反应液，进行2.0％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图2所示。
从表1可以看出用本发明的方法提取的总RNA含量高、纯度好，电泳结果(图1)显示提取的总RNA完整性好。图2中mb1、mb2所示分别为从样品MB1、MB2的总RNA分离得到的小分子RNA中以miR-let 7a为检测对象的RT-PCR结果电泳图。miR-let 7a是在小鼠脑组织中普遍表达的一种microRNA，图2说明本发明的方法有效地分离得到了小分子RNA。
| 样品 | 浓度(ng/μl) | 260/280 | 260/230 |
| MB1 | 953.93 | 2.03 | 1.21 |
| MB2 | 926.81 | 1.94 | 1.42 |
表1
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (3)
1、一种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)研磨：取50mg小鼠脑组织，加入1ml Ezol，用匀浆器研磨至匀浆，于室温放置10min；
2)去不溶物：4℃，12000×g，离心10min；将上清转入无核糖核酸酶的1.5ml离心管；
3)氯仿抽提：每管加入200-250μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；
4)4℃，12000×g，离心15min；取上清至新的无RNase的1.5ml离心管中；
5)异丙醇沉淀：加入1ml-2ml异丙醇，混匀，-15℃至-20℃，沉淀12h；
6)4℃，12000×g，离心10min；弃上清；
7)加入1ml预冷的75％乙醇，洗涤沉淀；4℃，7500×g，离心5min；
8)弃上清，真空干燥，沉淀溶于30μl焦碳酸二乙酯处理水DEPC-H2O中；
9)NanoDrop分光光度计检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性胶检测总RNA的完整性；
10)YM-100柱子中加入0.1M EDTA 150μl润洗，4℃，5000×g，离心6min；按5μg上样量取出相应样品的体积，与150μl 0.1M EDTA混合均匀后转移到YM-100柱子中，4℃，5000×g，离心6min，过柱所得即小分子RNA。
2、根据权利要求1所述的从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于：在步骤3)中，加入的氯仿用量为：250μl氯仿/1ml Ezol。
3、根据权利要求1所述的从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于：在步聚5)中异丙醇沉淀条件是：异丙醇的量为1ml，沉淀的温度为-20℃，沉淀的时间为12h。
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| CN101914526A (zh) * | 2010-08-13 | 2010-12-15 | 浙江省肿瘤医院 | 血清或血浆中微小rna的提取方法 |
| WO2012048470A1 (zh) * | 2010-10-15 | 2012-04-19 | 杨俊海 | 一种哺乳动物核糖核酸小分子复合物 |
| CN112195176A (zh) * | 2020-09-30 | 2021-01-08 | 天津大潮基因科技有限公司 | 从生物材料中分离纯化核酸固体的方法 |
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