CN110229810A - 一种高效提取橄榄叶片核酸物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效提取橄榄叶片中高质量核酸物质的方法，其操作步骤主要包括取样、研磨、裂解、除杂、沉淀、纯化和溶解等。本发明针对橄榄富含多酚、多糖、蛋白质等杂质的特点，其在传统CTAB法的基础上，针对橄榄叶片特征进行深度优化，对样品用量、试剂种类、试剂浓度、反应时间、反应体积、操作步骤等进行系统改良，开发适用于橄榄嫩叶、成熟叶或老叶核酸物质高效率和高质量提取的方法。本方法可根据实际需求，选择提取橄榄叶片基因组DNA或总RNA，适用性广，实用性强，具有很好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物学领域，具体涉及一种高效提取橄榄叶片核酸物质的方法。
背景技术
橄榄是我国热带亚热带地区特色名贵果树，其果实是国家卫生部公布的药食同源原料。我国是橄榄原产地和遗传多样性分布中心，种质资源极为丰富。然而，由于产地之间没有统一的橄榄命名标准，加上种质资源交流频繁，同名异物和同物异名现象非常普遍，因此基于现代分子标记技术开展橄榄种质资源鉴定工作对橄榄种质资源挖掘和优新品种审认定具有重要意义。此外，由于橄榄属于小宗果树，基础研究和应用基础研究起步较晚，其农艺性状差异、品质性状形成、抗逆性特征、功效成分积累等方面的机理尚不明确，阻碍了橄榄种质资源的创新利用和目标性状定向育种进程，深入开展橄榄相关方面的分子机理研究也有助于产业进一步发展。
DNA和RNA是生物体中重要的遗传物质，如何获得高质量的基因组DNA和总RNA是开展上述一系列工作的关键。然而，橄榄中富含多糖、多酚、蛋白质以及次级代谢产物等，往往在其核酸物质的提取过程中产生强烈的干扰影响，难以高效获得高质量橄榄核酸物质。例如，橄榄中大量的多糖容易导致RNA降解从而破坏其完整性，同时多糖物质也会包裹DNA导致提取过程中无法重悬溶解；橄榄中丰富的多酚类物质容易加速组织样品氧化和褐变导致提取失败，同时多酚类物质容易结合蛋白质或核酸物质形成大分子或聚合物，影响提取效果和质量。此外，橄榄中的蛋白质和其他次级代谢产物往往难以去除，无法有效纯化，影响核酸提取产物纯度，干扰后续应用过程。通过我们大量研究也发现，传统未经改良的核酸物质提取方法在橄榄样品中无法正常使用。针对橄榄富含多糖、多酚、蛋白质和其他次级代谢产物的特性，以及橄榄组织结构特征，开发高效的核酸物质提取方法意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于高效获得高质量的橄榄叶片核酸物质的方法。针对橄榄富含多酚、多糖、蛋白质和其他次级代谢产物等杂质的特点，在传统CTAB法的基础上通过优化改良，开发适用于橄榄嫩叶、成熟叶或老叶核酸物质高效率和高质量提取的方法，本方法可根据实际应用需求，选择提取橄榄叶片基因组DNA或总RNA，适用性广，实用性强，成本低廉，具有很好的应用价值。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
所述高效提取橄榄叶片核酸物质的方法针对橄榄叶片特征，在传统CTAB法上进行优化和改良，其主要操作过程与传统CTAB法具有一定的相似度，包括取样、研磨、裂解、除杂、沉淀、纯化和溶解等。但本发明通过对样品用量、试剂种类、试剂浓度、反应时间、反应体积、操作步骤等进行系统改良，开发了适用于橄榄叶片并可同时高效率高质量提取基因组DNA和总RNA的方法。
具体步骤如下：
（1）取样：采集橄榄叶片，洗净，吸干叶表水分，摊凉，并去除叶脉。
（2）研磨：称取样品0.5-0.6g，于研钵中加入10mgPVP，液氮下研磨成匀浆，转移至新离心管中。
（3）裂解：加入10mL 65℃预热的质量体积比为3%的CTAB裂解液，加入100μLβ-巯基乙醇，置于65℃中温浴30min，期间颠倒混匀3次。
（4）除杂：裂解结束后，冷却至室温，设置离心机转速12000rcf和温度4℃，离心2min。取上清液4mL，加入苯酚氯仿异戊醇混合液（体积比为25:24:1）4mL，轻轻混匀，静置1min，设置步骤（4）离心机参数离心10min。
（5）沉淀：重复步骤（4）2-3次。取1mL上清液，加入200μL浓度为3mol/L的醋酸钠，再加入800μL无水乙醇，轻轻混匀，静置至有白色沉淀析出。
（6）纯化：转入核酸纯化柱，设置离心机转速4000rcf和温度4℃，离心2min。加入4℃预冷过的75%乙醇1mL，设置步骤（6）离心机参数离心2min。
（7）溶解：重复步骤（6）2-3次。取出纯化柱置于室温中干燥2min，加50μL高压ddH2O，静置2min，设置离心机转速12000rcf和温度4℃，离心2min，收集橄榄核酸提取产物，加入1μL核酸水解酶。
在本发明中，作为进一步说明，除步骤（7）最后加入的DNase I酶和RNase A酶以外，步骤（1）-（7）中使用的所有试验试剂和耗材均不含有核酸水解酶。且根据最终所需的核酸种类，如果基因组DNA则在步骤（6）中采用DNA纯化柱步骤（7）中加入RNase A酶，如果总RNA则在步骤（6）中采用RNA纯化柱步骤（7）中加入DNase I酶。
本发明的显著优点在于：
（1）该方法的组织样品来源可以是橄榄嫩叶、成熟叶或老叶，有别于其他方法只能以橄榄嫩叶作为提取样品。针对一些无法正常抽发嫩叶的特殊橄榄种质资源或经特殊试验处理的橄榄老叶或成熟叶，本方法依然适用，且获得的橄榄叶片核酸产物浓度高、纯度高、质量好，完全能够满足后续应用。此外，与常规方法相比，本方法从橄榄嫩叶获取的核酸产物浓度、纯度和质量更好。
（2）该方法既适用于橄榄叶片基因组DNA提取也适用于总RNA提取，根据提取目的更换纯化柱和核酸水解酶类型即可实现不同种类核酸物质提取，同时解决了橄榄基因组DNA和总RNA提取难度大的难题，且成本低廉，适用性广，实用性强。
（3）在核酸物质沉淀析出过程中，除了采用无水乙醇，还针对性加入了醋酸钠，使染色体DNA聚集成不可溶的网络状聚合物或引起高分子量的RNA分子发生沉淀，提高核酸物质的提取效率。
（4）橄榄属于多酚和多糖等其他物质含量极高的植物，本方法研磨时加入了PVP有效防止多酚类物质氧化，同时PVP与多糖结合有效去除多糖，提高核酸物质提取效率和质量。裂解时加入β-巯基乙醇进一步有效抑制氧化过程。除杂时采用苯酚氯仿异戊醇混合溶剂抽提蛋白质、多酚、多糖等杂质，充分保证所提取核酸物质质量。此外，橄榄老叶角质膜厚度较厚，质地较硬，本方法在裂解过程中将CTAB的初始浓度提高到3%，从而提高橄榄叶片样品细胞的裂解效率和裂解程度，尤其是对橄榄老叶细胞的裂解具有很好的效果。
（5）本方法充分结合橄榄嫩叶、成熟叶和老叶的特性，通过多次试验探索和优化，在传统CTAB法的基础上，针对性对样品用量、试剂种类、试剂浓度、反应时间、反应体积、操作步骤等进行系统改良，获得了提取橄榄叶片核酸物质的优化体系，从而系统提高其基因组DNA和总RNA的提取效率。
附图说明
图1为实施例1提取的 DNA电泳图谱；
图2为实施例2提取的RNA电泳图谱。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步详细说明，但这并非是对本方法的限制，在本发明上作出的各种修改或改进，只要不脱离本方法的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1：
本实施例以福建省农业科学院果树研究所的农业农村部橄榄种质资源圃保存的分别来源于福建、广东、四川的福榄1号、三棱榄和合江药味青果3份种质的老叶和嫩叶作为材料，提取其基因组DNA，具体实施步骤包括：
（1）摘取3份橄榄种质的老叶和嫩叶，洗净，滤纸吸干叶片表面水分，短暂摊凉，迅速去除叶脉。
（2）研磨。称取样品0.5g，于研钵中加入10mgPVP，液氮下研磨成匀浆，转移至新离心管中。
（3）裂解。加入10mL 65℃预热的质量体积比为3%的CTAB裂解液，加入100μLβ-巯基乙醇，置于65℃中温浴30min，期间颠倒混匀3次。
（4）除杂。裂解结束后，冷却至室温，设置离心机转速12000rcf和温度4℃，离心2min。取上清液4mL，加入苯酚氯仿异戊醇混合液（体积比为25:24:1）4mL，轻轻混匀，静置1min，设置步骤（4）离心机参数离心10min。
（5）沉淀。重复步骤（4）2次。取1mL上清液，加入200μL浓度为3mol/L的醋酸钠，再加入800μL无水乙醇，轻轻混匀，静置至有白色沉淀析出。
（6）纯化。转入DNA纯化柱，设置离心机转速4000rcf和温度4℃，离心2min。加入4℃预冷过的75%乙醇1mL，设置步骤（6）离心机参数离心2min。
（7）溶解。重复步骤（6）2次。取出纯化柱置于室温中干燥2min，加50μL高压ddH2O，静置2min，设置离心机转速12000rcf和温度4℃，离心2min，收集橄榄基因组DNA提取产物，加入1μL的RNase I酶。
采用本实施例获得的福建、广东、四川的福榄1号（Ca21）、棱尖（Ca76）和合江药味青果（Ca86）3份种质的老叶和嫩叶的基因组DNA质量较高，纯度较好，且具有较高的浓度。经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，其DNA条带清晰，没有多糖、蛋白质等杂质残留，也没有RNA污染（图1：注：Ca21、Ca76、Ca86分别为福榄1号、棱尖和合江药味青果。M为Trans2K Plus DNA分子标记，条带所表示标记大小从上到下分别为2000bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp。）。此外，采用超微量紫外光分光光度计检测（表1）发现其A260/A280的比值介于1.8-2.0之间，说明所获得的基因组DNA产物纯度较好，没有蛋白质或酚类物质污染。A260/A230比值大于2.0，表明基因组DNA产物受碳水化合物、盐等其他物质污染较少。其浓度介于100ng.μL-1-500ng.μL-1之间，能够满足后续应用需求。结果说明，该方法适用于我国不同地区的橄榄种质资源高质量的基因组DNA的提取。此外，嫩叶中获得的橄榄基因组DNA浓度高于老叶，具有很好的适用性。
表1 橄榄基因组DNA浓度与OD值
实施例2：
本实施例以福建省农业科学院果树研究所的农业农村部橄榄种质资源圃保存的分别来源于福建、广西、浙江的池2号、牛榄2号和瑞安3号3份种质的嫩叶为材料，提取其总RNA。在本实施例中，所有试剂和耗材均采用DEPC水处理或高压处理，灭活RNA水解酶，具体实施步骤包括：
（1）摘取3份橄榄种质的老叶和嫩叶，洗净，滤纸吸干叶片表面水分，短暂摊凉，迅速去除叶脉。
（2）研磨。称取样品0.5g，于研钵中加入10mgPVP，液氮下研磨成匀浆，转移至新离心管中。
（3）裂解。加入10mL 65℃预热的质量体积比为3%的CTAB裂解液，加入100μLβ-巯基乙醇，置于65℃中温浴30min，期间颠倒混匀3次。
（4）除杂。裂解结束后，冷却至室温，设置离心机转速12000rcf和温度4℃，离心2min。取上清液4mL，加入苯酚氯仿异戊醇混合液（体积比为25:24:1）4mL，轻轻混匀，静置1min，设置步骤（4）离心机参数离心10min。
（5）沉淀。重复步骤（4）2次。取1mL上清液，加入200μL浓度为3mol/L的醋酸钠，再加入800μL无水乙醇，轻轻混匀，静置至有白色沉淀析出。
（6）纯化。转入RNA纯化柱，设置离心机转速4000rcf和温度4℃，离心2min。加入4℃预冷过的75%乙醇1mL，设置步骤（6）离心机参数离心2min。
（7）溶解。重复步骤（6）2次。取出纯化柱置于室温中干燥2min，加50μL高压ddH2O，静置2min，设置离心机转速12000rcf和温度4℃，离心2min，收集橄榄RNA提取产物，加入1μL的DNase A酶。
采用本实施例获得的福建、广西、浙江的池2号（Ca27）、牛榄2号（Ca80）和瑞安3号（Ca99）3份种质嫩叶的总RNA质量较高，纯度较好，且具有较高的浓度。经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，其总RNA条带清晰，没有降解，没有多糖、蛋白质等杂质残留，也不存在DNA污染（图2：注：Ca27、Ca80、Ca99分别为池2号、牛榄2号和瑞安3号；M为Trans2K Plus DNA分子标记，条带所表示标记大小从上到下分别为2000bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp和100bp）。采用超微量紫外光分光光度计检测（表2）发现其A260/A280的比值介于2.0-2.2之间，说明总RNA提取物没有蛋白质或酚类物质污染。A260/A230比值大于2.0，表明基因组DNA产物受碳水化合物、盐等其他物质污染较少。其浓度介于100ng.μL-1-500 ng.μL-1之间，能够满足后续应用需求。结果可见，该方法适用于我国不同地区的橄榄种质资源总RNA的提取。
表2 橄榄总RNA浓度与OD值
Claims (4)
1.一种高效提取橄榄叶片核酸物质的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）取样：采集无病虫害橄榄叶片，用清水洗净，用滤纸吸干叶表水分，短暂摊凉，迅速用剪刀去除叶脉；
（2）研磨：称取上述样品0.5-0.6g，置于研钵中，加入10mg的PVP，液氮下快速研磨成匀浆，转移至15mL离心管中；
（3）裂解：加入10mL 65℃预热的质量体积比为3%的CTAB裂解液，加入100μLβ-巯基乙醇，置于65℃条件下温浴30min，期间每隔10min颠倒混匀1次；
（4）除杂：裂解结束后，冷却至室温，在温度为4℃、转速为12000rcf下离心2min；取上清液4mL，加入4mL体积比为25:24:1的苯酚氯仿异戊醇混合液，轻轻混匀，静置1min，再离心10min；
（5）沉淀；重复步骤（4）2-3次；取1mL上清液，加入200μL浓度为3mol/L的醋酸钠，再加入800μL无水乙醇，轻轻混匀，静置至有白色沉淀析出；
（6）纯化；将步骤（5）的白色沉淀转入核酸纯化柱，在温度为4℃、转速为4000rcf下离心2min；再加入4℃预冷过的75%乙醇1mL，然后离心2min；
（7）溶解；重复步骤（6）2-3次；取出纯化柱置于室温中干燥2min，加50μL高压过的ddH2O，静置2min，在温度为4℃、转速为12000rcf下离心2min，收集橄榄核酸提取产物，加入1μL核酸水解酶后即得到橄榄叶片核酸物质。
2.根据权利要求1所述的高效提取橄榄叶片核酸物质的方法，其特征在于：步骤（1）使用的橄榄叶片为橄榄嫩叶、橄榄老叶或橄榄成熟叶。
3.根据权利要求1所述的高效提取橄榄叶片核酸物质的方法，其特征在于：当提取橄榄叶片核酸物质为DNA时，步骤（6）和（7）中的纯化柱和核酸水解酶分别选用DNA纯化柱和RNase I酶；当提取橄榄叶片核酸物质为RNA时，步骤（6）和（7）中的纯化柱和核酸水解酶分别选用RNA纯化柱和DNase A酶。
4.根据权利要求1所述的一种高效提取橄榄叶片核酸物质的方法，其特征在于，除步骤（7）最后加入的核酸水解酶以外，步骤（1）-（7）中使用的所有试验试剂和耗材均不含有核酸水解酶。
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