CN105713901A - 一种改良的多糖多酚植物高山杜鹃总dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种改良的多糖多酚植物高山杜鹃总DNA提取方法。该方法增加了去多糖处理步骤，将高山杜鹃干叶用液氮研磨成粉末后加入1mL Buffer I后通过冰浴、离心、洗去植物细胞匀浆中大部分的多糖和多酚等次生代谢物质；细胞裂解液为4×CTAB；在DNA抽提中不直接对细胞裂解混合液进行抽提，而是对细胞裂解混合液经高速离心后分离得到的上清液进行抽提；在第一次抽提所得的上清液中加入Rnase A试剂室温处理20min，然后再进行第二次常规抽提；在DNA沉淀的洗涤中每次洗涤对换离心管的放置方向，且增加高速离心时间至5min。本发明方法得率高、纯度高、重复性好，可直接应用于下游的分子生物学实验。
Description
技术领域
本发明涉及植物生命科学技术领域，具体是针对多糖多酚植物高山杜鹃改进的一种高效(得率高、纯度高)的DNA提取方法。
背景技术
杜鹃花(RhododendronL.)为世界著名的园林观赏植物，是我国传统十大名花和中国云南省八大名花之一。高山杜鹃是一些常绿阔叶杜鹃原种及其杂交后代的总称，因其株型优美、花大色艳，四季常绿，逐渐成为我国年宵花和高档园林绿化的新秀。我国拥有杜鹃属植物320余种，占世界杜鹃属植物的1/3，西南部及毗邻的东喜马拉雅地区为常绿杜鹃亚属的分布中心和起源地，但有关高山杜鹃的育种研究却起步晚、远远落后于西方国家，目前我国市面上销售的高山杜鹃品种及其总量很大程度上仍处于依赖国外进口的尴尬局面。在此形势下，研究人员除了针对高山杜鹃开展常规的杂交育种研究以外，更须同时加快其分子遗传育种研究。与此同时，核酸DNA的提取和纯化是分子遗传学实验的基本前提，而高山杜鹃叶片中多糖多酚等次生代谢物质特别丰富，且组织破壁后极易发生氧化，经大量的实验方法摸索证实通过市场上试剂公司生产的DNA提取试剂盒很难获得理想浓度或纯度的高山杜鹃DNA，因此有必要针对高山杜鹃的DNA常规CTAB提取法进行改良，形成一套稳定、高效的高山杜鹃总DNA提取方法和体系，为今后有关高山杜鹃的分子遗传学相关研究奠定良好基础。
发明内容
为解决常规CTAB法对高山杜鹃进行DNA提取杂质较多、纯度较低，DNA完整性较差等技术问题，本发明提供一种改良的多糖多酚植物高山杜鹃总DNA提取方法。
本发明以高山杜鹃的干叶为材料，提供了一种改良的多糖多酚植物高山杜鹃总DNA提取方法，该方法包括以下步骤：
(1)材料研磨
取100mg高山杜鹃干叶置于提前加入液氮的研钵中研磨成粉末；
(2)去多糖处理
将粉末转移至装有1mLBufferI的离心管中，置于冰上冰浴10min，期间不时摇匀，然后于4℃，7000rpm离心8min，弃上清；如果上清液粘稠，再加入1mLBufferI重复冰浴1次，然后于4℃，7000rpm离心8min，弃上清，所述BufferI含200mmolTris-HCl、50mmolEDTA、250mmolNaCl、1％的β-巯基乙醇(v/v)和1％的PVP(m/v)；
(3)CTAB提取液萃取
在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热的4×CTAB裂解液800μL，然后置于65℃的水浴锅中水浴40min，期间不时摇匀，水浴结束后，于室温12000rpm离心8min，取上清液至新的离心管；
(4)DNA抽提
①第一次抽提：在步骤(3)所得的上清液中加入该上清液体积的1/2体积的pH>7.8Tris饱和酚，涡旋混匀后静置5min，再加入步骤(3)所得上清液体积的1/2体积的氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀，静置5min后，于12000rpm，室温离心8min，转移上清至新的离心管；
②第二次抽提：在步骤(4)①抽提所得的上清液中加入10mg/mLRnaseA5μL，于室温静止处理20min，再加入与步骤(4)①第一次抽提所得上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀，静置5min后，于12000rpm，室温离心8min；
步骤(4)①和步骤(4)②抽提步骤中所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24:1；
(5)DNA沉淀
将步骤(4)②第二次抽提所得上清液转移至新的离心管，然后加入步骤(4)②第二次抽提所得上清液体积的2/3体积的异丙醇混匀，－20℃沉淀1h后，于12000rpm，4℃离心8min，倒掉上清液得DNA沉淀；
(6)DNA沉淀的洗涤和溶解
①第一次洗涤DNA沉淀，在步骤(5)所得的DNA沉淀中加入75％的酒精500μL重悬沉淀，于14000rpm，4℃离心5min，离心后倒置离心管控干酒精；
②第二次洗涤DNA沉淀和DNA沉淀的溶解，加入75％的酒精500μL重悬沉淀，于14000rpm，4℃离心5min，此次离心管的放置方向应与步骤(6)①第一次洗涤DNA沉淀时的离心管的放置方向相反，离心后倒置离心管控干酒精后，置于通风橱内晾干，最后加100μLddH2O室温溶解得DNA溶液，DNA溶液经琼脂糖凝胶或NanoDrop仪检测后，置于－20℃下保存。
与常规CTAB提取方法相比，本发明方法(即改良的4×CTAB法)的创新点和有益效果是：
1、增加了去多糖处理步骤，利用去多糖bufferI洗去植物细胞匀浆中大部分的多糖和多酚等次生代谢物质。
2、细胞裂解液为4×CTAB而非2×CTAB，使得植物细胞裂解更加充分。
3、不直接对细胞裂解混合液进行抽提，而是对细胞裂解混合液经高速离心后分离得到的上清液进行抽提，如此抽提效果更佳，还可在一定程度上提高DNA得率。
4、在第一次抽提所得的上清液中加入RnaseA试剂室温处理20min，然后再进行第二次常规抽提，由此可彻底去除RNA的污染。
5、用75％酒精洗涤DNA沉淀时，注意每次对换离心管的放置方向，且增加高速离心时间至5min，使离心管底部的沉淀在离心过程中通过逐渐移位从而得到充分洗涤，达到彻底洗涤去杂质的目的。
本发明所改进之处简单、易操作且经济、快速，改良后的DNA提取方法得率高、纯度高、重复性好，可直接应用于下游的分子生物学实验。从图1结合表1的数据可以看出，通过把常规的2×CTAB改成4×CTAB可有效地提高DNA的得率；增加去多糖BufferI冰浴处理的步骤，大大地提高了DNA的纯度。本发明方法通过对常规2×CTAB法的改良，获得了纯度和浓度都较高的DNA，所得DNA不需纯化可直接用于下游的分子生物学实验。
附图说明
图1是不同CTAB法所提取高山杜鹃总DNA的琼脂糖凝胶电泳图。图中1、2、3、4、5分别代表马缨杜鹃(Rhododendrondelavayi)、云南杜鹃(RhododendronYunnanese)、爆仗花杜鹃(Rhododendronspinuliferum)、大白花杜鹃(Rhododendrondecorum)和宽杯杜鹃(Rhododendronsinofalconeri)5个不同种的高山杜鹃；M1代表15K的DNAMarker，M2代表2KPlusDNAmarker；图中顶部的白线以上的文字描述对应的是提取方法，改良的4×CTAB法即为本发明方法。
具体实施方式
以下实施例无特殊说明的为常规方法。
实施例1
采用马缨杜鹃(样品1)、云南杜鹃(样品2)、爆仗花杜鹃(样品3)、大白花杜鹃(样品4)和宽杯杜鹃(样品5)5个不同种的高山杜鹃为实验材料，用以下改良的4×CTAB法即本发明方法提取高山杜鹃干叶的总DNA。所述5个不同种的高山杜鹃以及实施例所用的各种试剂等材料均为市售。
(1)材料研磨
称取100mg的高山杜鹃干叶置于提前加入液氮的研钵中研磨成粉末；由于采集的高山杜鹃鲜叶需立即置于液氮中研磨才不易损失DNA，本发明人采用高山杜鹃鲜叶和干叶为实验材料，同时比较2×CTAB、4×CTAB及改良的4×CTAB共三种方法的DNA提取效果，结果表明：同种提取方法无论以干叶还是新鲜叶为材料，DNA的提取效果差别不大，因此，为便于实际取样和实验操作，最终采用高山杜鹃干叶为材料。将采集的高山杜鹃新鲜叶片置于装有硅胶的自封袋中(每一个自封袋装有100-200克硅胶)，封闭袋口，5天后袋中叶片即为干叶。
(2)去多糖处理
将粉末转移至装有1mLBufferI的离心管中，置于冰上冰浴10min，期间不时摇匀，然后于4℃，7000rpm离心8min，弃上清；如果上清液粘稠，再加1mLBufferI重复冰浴1次，于4℃，7000rpm离心8min，弃上清；所述BufferI含200mmolTris-HCl、50mmolEDTA、250mmolNaCl、1％的β-巯基乙醇(v/v)和1％的PVP(m/v)。BufferI的制备方法如下：依次加入20mL的1MTris-HCl、10mL的0.5MEDTA、5mL的5MNaCl、1gPVP粉末和1mL的β-巯基乙醇，最后加入适量双蒸水充分溶解后定容至100mL，制备得100mL的BufferI溶液。
(3)CTAB提取液萃取
在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热的4×CTAB裂解液800μL，然后置于65℃的水浴锅中水浴40min，期间不时摇匀，水浴结束后，12000rpm，室温离心8min，取上清液至新的离心管。
(4)DNA抽提
①第一次抽提，在步骤(3)所得的上清液中加入该上清液体积的1/2体积的pH>7.8Tris饱和酚，涡旋混匀后静置5min，再加入步骤(3)所得上清液体积的1/2体积的氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀，静置5min后，于12000rpm，室温离心8min，转移上清至新的离心管。
②第二次抽提，在步骤(4)①第一次抽提所得的上清中加入10mg/mLRnaseA5μL，于室温静止处理20min；再加入与步骤(4)①第一次抽提所得上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀，静置5min后，于12000rpm，室温离心8min。
步骤(4)①和步骤(4)②抽提中所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24:1。
(5)DNA沉淀
将步骤(4)②第二次抽提所得上清液转移至新的离心管，然后加入步骤(4)②第二次抽提所得上清液体积的2/3体积的异丙醇混匀后，－20℃下沉淀1h，于12000rpm，4℃离心8min后倒掉上清液得DNA沉淀；
(6)DNA沉淀的洗涤和溶解
①第一次洗涤DNA沉淀，在步骤(5)所得的DNA沉淀中加入75％的酒精500μL重悬沉淀，于14000rpm，4℃离心5min，离心后倒置离心管控干酒精。
②第二次洗涤DNA沉淀和DNA沉淀的溶解，在步骤(6)①第一次洗涤后的DNA沉淀中再次加入75％的酒精500μL重悬沉淀，于14000rpm，4℃离心5min，此次离心管的放置方向应与步骤(6)①第一次洗涤沉淀时的离心管的放置方向相反，有利于杂质的彻底清除，离心后倒置离心管控干酒精后，置于通风橱内晾干，最后加100μLddH2O室温溶解得DNA溶液，DNA溶液经琼脂糖凝胶或NanoDrop仪检测后，置于－20℃下长期保存。
从图1可以看出，由本发明方法所得的DNA经琼脂糖凝胶电泳，主带明亮且无弥散，表示DNA完整未发生降解；点样孔干净、无杂质残留，未见RNA条带污染，可见所得DNA纯度高，无杂质污染；NANODROP仪检测结果显示在260nm处有平滑主峰，OD260/280值(主要指示DNA的完整性，大于1.8指示DNA未发生降解)均在1.8～2.0之间，且OD260/230值(主要指示蛋白、盐离子、有机溶剂等其它杂质的污染情况，一般其值在2.0左右表示基本无污染)均大于1.9，表明所提取DNA纯度较高，DNA浓度达350ng/μL左右(见表1)，能满足一般性的分子生物学实验要求。
表1三种不同提取方法所得高山杜鹃总DNA的DANODROP仪检测结果
Claims (1)
1.一种改良的多糖多酚植物高山杜鹃总DNA提取方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)材料研磨
取100mg高山杜鹃干叶置于提前加入液氮的研钵中研磨成粉末；
(2)去多糖处理
将粉末转移至装有1mLBufferI的离心管中，置于冰上冰浴10min，期间不时摇匀，然后于4℃，7000rpm离心8min，弃上清；如果上清液粘稠，再加入1mLBufferI重复冰浴1次，然后于4℃，7000rpm离心8min，弃上清，所述BufferI含200mmolTris-HCl、50mmolEDTA、250mmolNaCl、1％β-巯基乙醇(v/v)和1％PVP(m/v)；
(3)CTAB提取液萃取
在步骤(2)所得沉淀中加入于65℃水浴预热的4×CTAB裂解液800μL，然后置于65℃的水浴锅中水浴40min，期间不时摇匀，水浴结束后，于室温12000rpm离心8min，取上清液至新的离心管；
(4)DNA抽提
①第一次抽提：在步骤(3)所得的上清液中加入该上清液体积的1/2体积的pH>7.8Tris饱和酚，涡旋混匀后静置5min，再加入步骤(3)所得上清液体积的1/2体积的氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀，静置5min后，于12000rpm，室温离心8min，转移上清至新的离心管；
②第二次抽提：在步骤(4)①抽提所得的上清液中加入10mg/mLRnaseA5μL，于室温静止处理20min，再加入与步骤(4)①第一次抽提所得上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀，静置5min后，于12000rpm，室温离心8min；
步骤(4)①和步骤(4)②抽提步骤中所述的氯仿-异戊醇混合液中氯仿：异戊醇的体积比为24:1；
(5)DNA沉淀
将步骤(4)②第二次抽提所得上清液转移至新的离心管，然后加入步骤(4)②第二次抽提所得上清液体积的2/3体积的异丙醇混匀，－20℃沉淀1h后，于12000rpm，4℃离心8min，倒掉上清液得DNA沉淀；
(6)DNA沉淀的洗涤和溶解
①第一次洗涤DNA沉淀，在步骤(5)所得的DNA沉淀中加入75％的酒精500μL重悬沉淀，于14000rpm，4℃离心5min，离心后倒置离心管控干酒精；
②第二次洗涤DNA沉淀和DNA沉淀的溶解，加入75％的酒精500μL重悬沉淀，于14000rpm，4℃离心5min，此次离心管的放置方向应与步骤(6)①第一次洗涤DNA沉淀时的离心管的放置方向相反，离心后倒置离心管控干酒精后，置于通风橱内晾干，最后加100μLddH2O室温溶解得DNA溶液，DNA溶液经琼脂糖凝胶或NanoDrop仪检测后，置于－20℃下保存。
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