CN103275970A - 一种总核酸、总rna和基因组dna的同步提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，涉及一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法，是将植物材料粉碎后用SDS提取液进行提取，得到粗提物上清液，三等分粗提物上清液后分别用于总核酸、总RNA和基因组DNA的提取。本发明将SDS提取液与其它试剂相结合，可以同步提取总核酸、总RNA和基因组DNA，不仅节约了时间，而且节约了提取成本，可以满足多种分子生物学研究的需要，具有现实意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种提取方法，具体是一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法。
背景技术
高质量的RNA和DNA在植物分子生物学研究中具有重要的作用，关系到后续分子生物学研究的成功与否，如分子标记、基因克隆、基因上游启动子序列的分离、Southern印迹分析、表达特性分析和cDNA文库构建等。另外，随着分子生物学的发展，实验中对所需的核酸要求不但质量高，而且类型多样，可能有的实验需要总核酸、部分实验需要总RNA、还有实验需要基因组DNA。
目前，关于植物总核酸、总RNA和基因组DNA提取方法的报道较多，技术也非常成熟，但多是在植物中应用不同方法分别对总核酸、总RNA和基因组DNA进行提取，在应用中，由于分子生物学研究需要的核酸类型多样，如分别提取总核酸、总RNA和基因组DNA，过程较为繁琐。经检索，对于采用一种方法或一套试剂从植物中同步提取总核酸、总RNA和基因组DNA的方法，未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法，可以同步提取总核酸、总RNA和基因组DNA，不仅节约了时间，而且节约了提取成本，以满足多种分子生物学研究的需要。
本发明所采用的技术原理：
总核酸的提取：提取总核酸时，用水饱和酚和氯仿组成的混合试剂进行抽提。理论上，当用水饱和酚（pH ≈ 5，呈酸性）进行抽提时，RNA溶解于酸性的水相，DNA处于有机相，从而把RNA与DNA分离。但实验表明，水饱和酚只能去除少量的DNA，所以本方法采用水饱和酚提取总核酸。提取总核酸时所用氯仿的作用主要有以下几点：1、它是分子量比较大的有机溶剂，能加速有机相与水相分层；2、它能去除核酸溶液中的痕量酚（酚易溶于氯仿中）；3、它能使蛋白质变性；4、它作为有机溶剂可抽提样品中的一些脂溶性杂质（如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用。
总RNA的提取：提取总RNA时，除了用水饱和酚和氯仿组成的混合试剂进行抽提，还用到高浓度的酸性醋酸钾溶液，该溶液能使多糖和DNA一起沉淀下来，使得水相中就只剩下RNA。
基因组DNA的提取：提取基因组DNA时，用Tris-饱和酚（pH > 7.8）和氯仿组成的混合试剂进行抽提。Tris-饱和酚的中性偏碱性的环境使DNA处于水相，RNA处于有机相，从而把RNA与DNA分离，但实验证明，Tris-饱和酚也只能去除少量的RNA。为了有效去除RNA和多糖，本方法中加入无水乙醇，原因在于这个体积比的无水乙醇能将多糖和RNA一起沉淀下来，使得水相中就只剩下DNA。氯仿的作用与总核酸的提取中的描述相同。
本发明所采用的技术方案：
一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法，其步骤如下：
1、粗提
将植物材料粉碎后与SDS提取液混合，60～70℃水浴10～60分钟；离心，取上清得到粗提物上清液，三等分粗提物上清液后分别用于总核酸、总RNA和基因组DNA的提取。
所述植物材料是指富含多糖多酚的植物，进一步优选香蕉。
所述植物材料粉碎是在液氮中将植物材料研磨成粉末。
所述的离心条件为：转速8000～12000 rpm，时间5～20分钟。
2、提取
总核酸的提取：在粗提物上清液中加入水饱和酚与氯仿组成的混合试剂，混匀，离心，取上清液，重复此步至无中间相；在上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到包含总RNA和基因组DNA的总核酸。所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1︰1。所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2。
总RNA的提取： 在粗提物上清液中加入1／5～5／5体积的醋酸钾溶液，混匀，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，取上清，得到第一次提取上清液；在第一次提取上清液中加入水饱和酚与氯仿组成的混合试剂，混匀，离心，取上清液，重复此步至无中间相，得到第二次提取上清液；在第二次提取上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到总RNA。所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1︰1。所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2。
基因组DNA的提取：在粗提物上清液中加入1／10～1／2体积无水乙醇，混匀，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，取上清，得到第一次提取上清液；在第一次提取上清液中加入Tris-饱和酚与氯仿组成的混合试剂，混匀，离心，取上清，重复此步至无中间相，得到第二次提取上清液；在第二次提取上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到基因组DNA。所述Tris-饱和酚与氯仿组成的混合试剂中Tris-饱和酚与氯仿的体积比为1︰1。所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2。
本发明将SDS提取液与其它试剂相结合，可以同步提取总核酸、总RNA和基因组DNA，不仅节约了时间，而且节约了提取成本，可以满足多种分子生物学研究的需要，具有现实意义。
附图说明
图1是香蕉叶片总核酸、总RNA和基因组DNA提取电泳图。1：总核酸；2：总RNA；3：基因组DNA。
图2是香蕉Actin1基因的RT-PCR。M：DNA Marker；1:总核酸中的总RNA的反转录产物；2：总RNA的反转录产物。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一、香蕉叶片总核酸、总RNA和基因组DNA的提取
称取香蕉叶片约0.6 g，于液氮中迅速研磨成粉末，加入到含有2.4mL SDS提取液的10 mL离心管中，65 ℃水浴10分钟；12000 rpm离心10分钟，得到粗提物上清液，三等分上清液后分别用于总核酸、总RNA和基因组DNA的提取。
总核酸的提取：在粗提物上清液中加入与粗提物上清液等体积的由水饱和酚和氯仿组成的混合试剂（其中水饱和酚和氯仿的体积比为1︰1），轻轻上下颠倒混匀，12000 rpm离心10分钟，取上清，重复此步至无中间相；加入1／10上清液体积的3 mol／L醋酸钠溶液（pH值为5.2）和2倍上清液体积的无水乙醇，冰浴10分钟以上；12000 rpm离心10分钟，弃上清，用75 %的乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥，得到包含总RNA和基因组DNA的总核酸。
总RNA的提取：在粗提物上清液中加入相当于粗提物上清液1／3体积的5 mol／L醋酸钾溶液（pH值为4.8），轻轻上下颠倒混匀，冰上放置10分钟；12000 rpm离心10分钟，取上清，后续步骤中的水饱和酚和氯仿混合试剂抽提总RNA、总RNA的沉淀和洗涤、以及总RNA的电泳检查与总核酸提取方法中的相应步骤相同。
基因组DNA的提取：在粗提物上清液中加入相当于粗提物上清液1／3体积的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀，冰上放置10分钟；12000 rpm离心10分钟，取上清，加入与上清液等体积的Tris-饱和酚和氯仿组成的混合试剂，其中Tris-饱和酚和氯仿的体积比为1︰1，轻轻上下颠倒混匀，重复此步至无中间相；12000 rpm离心10分钟，取上清，上清液中的基因组DNA的沉淀、洗涤以及电泳检查与总核酸提取方法的相应步骤相同。
试验分析：
1、总核酸的质量分析
将总核酸溶于50 μL DEPC处理的双蒸水中；取2 μL总核酸，用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压为120 V，当溴酚蓝离进样孔的距离达到胶面长度的1／3时取出，于凝胶成像系统上拍照分析，结果如图1所示。从电泳结果可以看出，本发明提取的总核酸中没有蛋白、多糖等物质的污染，并且DNA和RNA条带清晰、整齐。
1）、总核酸中总RNA的质量分析
取20μL总核酸，用不含RNA酶的DNA酶消化总核酸中的DNA，然后用水饱和酚和氯仿混合试剂抽提一次，以去除DNA酶，接着加入1／10上清液体积的3 mol／L醋酸钠溶液（pH值为5.2）和2倍上清液体积的无水乙醇沉淀总RNA，将总RNA用75 %的乙醇洗涤2次后，溶于10 μL DEPC处理的双蒸水中。用紫外可见分光光度计（岛津UV-2550）检测总RNA的质量，结果表明：RNA浓度为150.73 ± 2.16 μg／ml，OD260／280为2.029 ± 0.027，OD260／230为2.184 ± 0.035。将0.5μg总RNA进行反转录，用M-MLV反转录酶（TransGen Biotech NoAT101-01）进行反转录，反转录反应体系和反应程序参考说明书的方法进行。以香蕉Actin1基因为内参基因，检测反转录合成cDNA的质量。根据NCBI数据库中登录的香蕉Actin1序列（AF246288.1），设计扩增香蕉Actin1基因的特异引物，Actin1-F：CCTCCATCCTTCGGTCTCCT；Actin1-R：GACCCATTCCGACCATCACA。取l μL的cDNA模板进行PCR扩增，PCR扩增体系为：模板1 μL，10×PCR缓冲溶液2.5 μL，2.5mmol／L dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL，Taq酶0.2 μL，最后加灭菌的双蒸水至总体积为25 μL。反应条件为：94 ℃预变性2分钟，94 ℃变性30秒，59 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，共进行35个循环，72 ℃延伸7分钟。在1 %的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR产物，结果见图2。如图2所示，本方法从香蕉叶片总核酸的总RNA反转录产物中成功地克隆到了大约241 bp的目标片段，测序结果表明克隆到的片段与目标片段的同源性达到了99 %。这些实验结果说明该方法提取的香蕉总核酸中总RNA的质量较高。
2）、总核酸中基因组DNA的质量分析
取20μL总核酸，用不含DNA酶的RNA酶消化总核酸中的RNA，然后用Tris-饱和酚和氯仿混合试剂抽提一次，以去除RNA酶，接着加入1／10上清液体积的3 mol／L醋酸钠溶液（pH值为5.2）和2倍上清液体积的无水乙醇沉淀基因组DNA，将基因组DNA用75 %的乙醇洗涤2次后，溶于10μL灭菌的双蒸水中。用紫外可见分光光度计检测基因组DNA的质量，结果表明：DNA浓度为121.14 ± 2.95 μg／ml，OD260／280为1.912 ± 0.033，说明该方法提取的总核酸中基因组DNA的质量较高。
2、基因组DNA的质量分析
取2 μL基因组DNA，用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示。 基因组DNA条带整齐、无降解。用紫外可见分光光度计检测基因组DNA的质量，结果表明：所提取的DNA浓度为137.65 ± 3.81μg／ml，OD260／280是1.937 ± 0.020，说明提取的基因组DNA质量较高。
3、总RNA的质量分析
取2 μL总RNA，用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示。 RNA没有蛋白、多糖和DNA的污染，并且28S、18S条带清晰、整齐。用紫外可见分光光度计检测RNA的质量，RNA浓度为142.96 ± 4.73 μg／ml，OD260／280为2.035 ± 0.036，OD260／230为2.236± 0.028。将0.5μg总RNA进行反转录，反转录完成后以香蕉Actin1基因为内参基因，检测总RNA提取以及cDNA合成的质量。总RNA反转录产物的PCR反应体系和反应程序与总核酸中总RNA反转录产物的PCR反应体系和反应程序相同。结果如图2所示，本方法从香蕉叶片的总RNA反转录产物中成功地克隆到了大约241 bp的目标片段，测序结果表明克隆到的片段与目标片段的同源性达到了100%。这些实验结果说明该方法提取的香蕉总RNA具有较高的质量，能满足分子生物学研究的要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种总核酸、总RNA和基因组DNA的同步提取方法，其特征在于，其步骤如下：
1）、粗提
将植物材料粉碎后与SDS提取液混合，60～70℃水浴10～60分钟；离心，取上清得到粗提物上清液，三等分粗提物上清液后分别用于总核酸、总RNA和基因组DNA的提取；
2）、提取
总核酸的提取：在粗提物上清液中加入水饱和酚与氯仿组成的混合试剂，混匀，离心，取上清液，重复此步至无中间相；在上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上；离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到包含总RNA和基因组DNA的总核酸；所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1︰1；所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2；
总RNA的提取： 在粗提物上清液中加入1／5～5／5体积的醋酸钾溶液，混匀，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，取上清，得到第一次提取上清液；在第一次提取上清液中加入水饱和酚与氯仿组成的混合试剂，混匀，离心，取上清液，重复此步至无中间相，得到第二次提取上清液；在第二次提取上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到总RNA；所述水饱和酚与氯仿组成的混合试剂中水饱和酚与氯仿的体积比为1︰1；所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2；
基因组DNA的提取：在粗提物上清液中加入1／10～1／2体积无水乙醇，混匀，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，取上清，得到第一次提取上清液；在第一次提取上清液中加入Tris-饱和酚与氯仿组成的混合试剂，混匀，离心，取上清，重复此步至无中间相，得到第二次提取上清液；在第二次提取上清液中加入2倍体积的无水乙醇和1／10体积的醋酸钠溶液，降温至0℃，保持0℃并放置10分钟以上，离心，弃上清，沉淀物用75 %乙醇洗涤1～5次，室温干燥，得到基因组DNA；所述Tris-饱和酚与氯仿组成的混合试剂中Tris-饱和酚与氯仿的体积比为1︰1；所述醋酸钠溶液的浓度为3～5 mol／L，pH值为5.2。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述植物材料是指富含多糖多酚的植物。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述植物材料粉碎是在液氮中将植物材料研磨成粉末。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述的离心条件为：转速8000～12000 rpm，时间5～20分钟。
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