CN101486747A - 一种同时提取植物dna和rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时提取植物DNA和RNA的方法,所述方法利用同一份植物样本,先经相同步骤进行处理除杂后,再分别进行DNA和RNA沉淀和纯化,以达到共同提取的目的。本发明所述方法可用于山药样品中DNA和RNA的同时提取,其优点不仅在于可以同时进行核酸提取,节省时间,经济,快速,而且本发明中采用的超速离心和KAC等对山药本身所含多糖等杂质的去除非常有效,DNA/RNA提取质量高,RNA OD260/280比值间于(1.8~2.0),DNA间于1.7~1.8之间,电泳条带完整清晰。本发明也同样适用于其他植物样本的核酸提取。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种同时提取植物样本DNA和RNA的方法,尤其是一种同时提取山药DNA和RNA的方法。
(二)背景技术
在最近十多年里,分子生物学的发展一日千里,而且已广泛用于医学、农业、药学、法医学等各个方面,有着重要的发展意义。自从DNA双螺旋结构发现以来,核酸就成为了生物学的研究重点,并产生了以DNA和RNA为主要研究对象的分子生物学学科。从样品中分离出高纯度高质量的核酸是下游实验顺利进行的最基本前提。DNA和RNA纯化技术主要包括酚氯仿抽提法,离子交换法,盐析法,玻璃奶法和硅胶柱法等,但是这些方法往往只能提取出其中一种核酸而浪费另一种核酸。当样品比较有限时,常常需要将同一种样品中的DNA和RNA提取出来。但是提取纯度比较低,难溶解(需要在8mM NaOH溶液中才能溶解),而且DNA片段断裂比较严重,只有10Kb左右,因而很难满足下游的实验要求。山药块茎富含多糖,容易造成核酸提取过程中的共沉淀,从而影响了核酸的纯度。目前国内外为去除多糖的干扰,采用经典的CsCl超速离心的方法,但此法技术要求高,花费高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种高速、简单且提取质量高的可同时提取植物DNA和RNA的方法。
本发明采用的技术方案是:
一种同时提取植物DNA和RNA的方法,所述方法包括:
(1)取植物样品,液氮研磨成粉,得到样品粉末;
(2)将样品粉末加入预热至60~70℃的CTAB提取液,样品粉末与CTAB提取液用量为1g:2~3mL,再加入β-巯基乙醇至终浓度为1~5%(v/v),60~70℃水浴20~40min得混合液A;
(3)步骤(2)所得混合液A分别加入体积为所述混合液A体积0.2~0.3倍的无水乙醇和体积为所述混合液A体积0.1~0.15倍的pH5.3KAc缓冲液,混匀后,于60~70℃水浴5~10min得混合液B;
(4)步骤(3)混合液B加入等体积的氯仿/异戊醇混合液,氯仿/异戊醇混合液中氯仿与异戊醇体积比为24:1,混匀,10000rpm以上转数离心1~2次,每次5~10min,取上清液1用于下一步操作;
(5)上清液1加入等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液,水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液中水饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1,混匀,10000rpm以上转数离心5~10分钟,取上清液2分别进行RNA和DNA提取:
(6)取1体积上清液2加入0.5~0.6体积的10M LiCl水溶液于-20℃~-10℃静置12小时以上,再经分离纯化得到植物RNA;
(7)另取1体积上清液2加入0.05~0.2体积的pH5.2NaAc缓冲液和2~3体积的无水乙醇,-20℃~-10℃静置30min以上,沉淀DNA,再经分离纯化得到植物DNA。
所述RNA分离纯化可按本领域常规方法进行,本发明采用分离纯化方法如下:取RNA沉淀,分别依次用3M LiCl、无水乙醇、70%(v/v)乙醇冲洗,得到植物RNA溶于DEPC水中,保存于-70℃备用。
所述DNA分离纯化可按本领域常规方法进行,本发明采用分离纯化方法如下:
1)将絮状DNA挑出或者离心得到DNA沉淀,再用无水乙醇洗涤;
2)步骤1)所得的DNA沉淀用灭菌水溶解,加入适量RNase酶液,于37℃水浴保温1小时,得混合液C;
3)步骤2)所得混合液C加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液,所述的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液中Tris饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1,混匀,10000rpm以上转数离心5~10分钟,上清液3进行下一步操作;
4)取1体积上清液3加入0.05~0.2体积的pH5.2NaAc缓冲液和2~3体积的无水乙醇,-20℃~-10℃静置30min以上沉淀DNA,10000rpm以上离心5~10分钟,用70%乙醇冲洗沉淀1~3次;
5)步骤4)所得沉淀晾干,得到植物DNA,用TE缓冲液溶解,-20℃保存备用。
饱和酚包括水饱和酚和Tris饱和酚,水饱和酚的pH小于7,通常与异硫氢酸胍一起使用,用于细胞RNA的提取,这样DNA在酚相,RNA在水相,这样可将两者分开,水饱和酚获得过程如下:往苯酚中加入蒸馏水至出现白色混浊,沉淀,取清液即为水饱和酚;Tris饱和酚一般pH大于7.8,用于DNA的提取,Tris饱和酚也称Tris平衡酚或Tris平衡苯酚,是添加了抗氧化剂8-羟基喹啉,Tris,pH8.0充分平衡的苯酚。
所述方法适用于山药、竹子、茄子、长瓜、豇豆等植物DNA和RNA的提取,尤其适用于山药。
具体的,所述方法如下:
(1)取山药样品,液氮研磨成粉,得到样品粉末;
(2)将样品粉末加入预热至65℃的CTAB提取液,样品粉末与CTAB提取液用量为1g:2.5mL,再加入β-巯基乙醇至终浓度为5%,65℃水浴30min,期间震荡3~4次,得混合液A;
(3)步骤(2)混合液A加入体积为所述混合液A体积0.25倍的无水乙醇和0.11倍的pH5.3KAc缓冲液,混匀后,于65℃水浴10min得混合液B;
(4)步骤(3)混合液B加入等体积的氯仿/异戊醇混合液,氯仿/异戊醇混合液中氯仿与异戊醇体积比为24:1,混匀,4℃、16000rpm离心1~2次,每次10min,取上清液1用于下一步操作;
(5)上清液1加入等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液,水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液中水饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25∶24:1,混匀,4℃、16000rpm离心10分钟,取上清液2分别进行RNA和DNA提取:
(6)取1体积上清液2加入3/7体积的10M LiCl水溶液于-20℃静置12小时沉淀RNA,得到沉淀1用3M LiCl溶液冲洗,4℃、16000rpm离心5分钟,得到沉淀2用无水乙醇冲洗,4℃、16000rpm离心5分钟,得到沉淀3用70%乙醇冲洗,4℃、16000rpm离心5分钟,获得山药RNA用DEPC水溶解于-70℃保存备用;
(7)另取1体积上清液2加入0.1体积的pH5.2NaAc缓冲液和2体积的无水乙醇,-20℃静置30min沉淀DNA,将絮状DNA挑出,无水乙醇洗涤,将絮状DNA用灭菌水溶解,加入适量RNase酶液,于37℃水浴保温1小时,所得混合液C加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液,Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液中Tris饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1,混匀,4℃、16000rpm离心10分钟,得到上清液3;取1体积上清液3加入0.1体积的pH5.2 NaAc缓冲液和2体积的无水乙醇,-20℃静置30min沉淀DNA,4℃、12000rpm离心10分钟,70%乙醇冲洗沉淀2次,每次4℃、12000rpm离心5分钟;沉淀晾干,得到山药DNA,用TE缓冲液溶解,-20℃保存备用。
本发明所述方法可用于山药样品中DNA和RNA的同时提取,其优点不仅在于可以同时进行核酸提取,节省时间,经济,快速,而且本发明中采用的超速离心和KAC等对山药本身所含多糖等杂质的去除非常有效,DNA/RNA提取质量高。本发明也同样适用于其他植物样本的核酸提取。
(四)
图1为实施例提取的基因组DNA电泳图;1、2为山药块茎;3、4为山药叶片;5、6为竹子叶片;7为茄子叶片;8为瓠瓜叶片;
图2为实施例提取的总RNA甲醛变性电泳图;1、2为山药块茎;3、4为山药叶片;5、6为竹子叶片;7为茄子叶片;8为瓠瓜叶片。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1:
1.取山药块茎,用刀切成小碎块,取1克,按样品:不溶性PVP(K40)=10:1的比例用液氮研磨成细粉。
2.加入预热的2%CTAB提取液2.5mL,并加入β-巯基乙醇至终浓度5%,65℃水浴30分钟,期间震荡3~4次。
3.再加入625uL无水乙醇和275uL KAc缓冲液(pH5.3),剧烈振荡混匀后,再在65℃水浴中10分钟,期间振荡1~2次。
4.加入等体积3.4mL的氯仿:异戊醇(体积比24:1),上下倒置5分钟使之混匀,然后在4℃、16000rpm离心10分钟
5.吸上清液700uL于新的1.5mL的eppendorf管中(上述离心管每管分成两管),加入350uL的氯仿:异戊醇(24:1)和350uL的水饱和酚(pH5.3),上下倒置5分钟使之混匀,再在4℃、16000rpm离心10分钟。
6.吸上清液于新的1.5mL的eppendorf管中,每个新管中装800uL上清液,其中一管加入342.9uL的10M的LiCl于-20℃静置过夜(12小时)沉淀RNA;另一管加入80uL的NaAC缓冲液(pH5.2)和1600uL的无水乙醇于-20℃静置30分钟以上沉淀DNA;以下分别进行RNA和DNA的提取。
7.RNA的提取
1)500uL 3M LiCl冲洗一次RNA沉淀,在4℃、16000rpm离心5分钟。
2)1mL无水乙醇冲洗一次步骤1)沉淀,在4℃、16000rpm离心5分钟。
3)1mL 70%乙醇冲洗一次步骤2)沉淀,在4℃、16000rpm离心5分钟。
4)加入500uL的DEPC-处理水溶解步骤3)沉淀后保存于-70℃,可用于进行检测和其他实验。
5)RNA质量的分光光度法检测总RNA经核酸测定仪检测发现,OD260/OD280值在1.8~2.0之间,表明RNA没有蛋白质、酚类物质污染;另外经甲醛变性凝胶电泳检测28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA三条带清晰和较整齐,且28S rRNA带较18S rRNA带亮,说明所提取的总RNA完整性较好。附图说明
8.DNA的提取
①用枪头将DNA挑出后用1mL的70%(v/v)的乙醇冲洗一次。
②用700uL的灭菌水溶解DNA后加入2uL RNase(10ug/mL,上海生工生物技术有限公司)酶液,于37℃水浴中保温1小时。
③加入350uL的氯仿/异戊醇(24:1)和350uL的Tris饱和酚(pH8.0),上下倒置1分钟使之混匀,在4℃、16000rpm离心10分钟。
④取550uL的上清液于新的1.5mL的eppendorf管中加入55uL的NaAc缓冲液(pH5.2)和110uL的无水乙醇于-20℃30分钟以上沉淀DNA。
⑤在4℃、12000rpm离心10分钟,用70%的乙醇冲洗沉淀两次,每次4℃、12000rpm离心5分钟。
⑥室温晾干,用50uL TE缓冲液溶解DNA沉淀,检测和于-20℃保存备用。样品检测结果表明,DNA OD260/280比值为1.75~1.83,带型整齐,无明显降解(参见图1~2)。
实施例2:
取山药、竹子、茄子和瓠瓜的叶片、各1克,用刀切碎,按样品:不溶性PVP=10:1的比例用液氮研磨成细粉。其他步骤同实施例1。得到的RNA和DNA质量同实例1,RNA比值在1.8~2.0之间,DNA比值在1.7~18之间,电泳结果条带清晰完整(参见图1~2)。
Claims (5)
1.一种同时提取植物DNA和RNA的方法,所述方法包括:
(1)取植物样品,液氮研磨成粉,得到样品粉末;
(2)将样品粉末加入预热至60~70℃的CTAB提取液,样品粉末与CTAB提取液用量为1g:2~3mL,再加入β-巯基乙醇至终浓度为1~5%,60~70℃水浴20~40min得混合液A;
(3)步骤(2)所得混合液A分别加入体积为所述混合液A体积0.2~0.3倍的无水乙醇和体积为所述混合液A体积0.1~0.15倍的pH5.3KAc缓冲液,混匀后,于60~70℃水浴5~10min得混合液B;
(4)步骤(3)混合液B加入等体积的氯仿/异戊醇混合液,氯仿/异戊醇混合液中氯仿与异戊醇体积比为24:1,混匀,10000rpm以上转数离心1~2次,每次5~10min,取上清液1用于下一步操作;
(5)上清液1加入等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液,水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液中水饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1,混匀,10000rpm以上转数离心5~10分钟,取上清液2分别进行RNA和DNA提取:
(6)取1体积上清液2加入0.5~0.6体积的10M LiCl水溶液于-20℃~-10℃静置12小时以上沉淀RNA,再经分离纯化得到植物RNA;
(7)另取1体积上清液2加入0.05~0.2体积的pH5.2NaAc缓冲液和2~3体积的无水乙醇,-20℃~-10℃静置30min以上,沉淀DNA,再经分离纯化得到植物DNA。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述步骤(6)RNA分离纯化方法如下:取RNA沉淀,分别依次用3M LiCl、无水乙醇、70%乙醇冲洗,得到植物RNA溶于DEPC水中,保存于-70℃备用。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述步骤(7)DNA分离纯化方法如下:
1)将絮状DNA挑出或者离心得到DNA沉淀,再用无水乙醇洗涤;
2)步骤1)所得的DNA沉淀用灭菌水溶解,加入适量RNase酶液,于37℃水浴保温1小时,得混合液C;
3)步骤2)所得混合液C加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液,所述的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液中Tris饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1,混匀,10000rpm以上转数离心5~10分钟,上清液3进行下一步操作;
4)取1体积上清液3加入0.05~0.2体积的pH5.2NaAc缓冲液和2~3体积的无水乙醇,-20℃~-10℃静置30min以上,沉淀DNA,10000rpm以上离心5~10分钟,用70%乙醇冲洗沉淀1~3次;
5)步骤4)所得沉淀晾干,得到植物DNA,用TE缓冲液溶解,-20℃保存备用。
4.如权利要求1~3之一所述的方法,其特征在于所述植物为山药、竹子或茄子。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于所述方法如下:
(1)取山药样品,液氮研磨成粉,得到样品粉末;
(2)将样品粉末加入预热至65℃的CTAB提取液,样品粉末与CTAB提取液用量为1g:2.5mL,再加入β-巯基乙醇至终浓度为5%,65℃水浴30min,期间震荡3~4次,得混合液A;
(3)步骤(2)混合液A加入体积为所述混合液A体积0.25倍的无水乙醇和0.11倍的pH5.3KAc缓冲液,混匀后,于65℃水浴10min得混合液B;
(4)步骤(3)混合液B加入等体积的氯仿/异戊醇混合液,氯仿/异戊醇混合液中氯仿与异戊醇体积比为24:1,混匀,4℃、16000rpm离心1~2次,每次10min,取上清液1用于下一步操作;
(5)上清液1加入等体积的水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液,水饱和酚/氯仿/异戊醇混合液中水饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1,混匀,4℃、16000rpm离心10分钟,取上清液2分别进行RNA和DNA提取:
(6)取1体积上清液2加入3/7体积的10M LiCl水溶液于-20℃静置12小时沉淀RNA,得到沉淀1用3M LiCl溶液冲洗,4℃、16000rpm离心5分钟,得到沉淀2用无水乙醇冲洗,4℃、16000rpm离心5分钟,得到沉淀3用70%乙醇冲洗,4℃、16000rpm离心5分钟,获得山药RNA用DEPC水溶解于-70℃保存备用;
(7)另取1体积上清液2加入0.1体积的pH5.2NaAc缓冲液和2体积的无水乙醇,-20℃静置30min沉淀DNA,将絮状DNA挑出,无水乙醇洗涤,将絮状DNA用灭菌水溶解,加入适量RNase酶液,于37℃水浴保温1小时,所得混合液C加入等体积的Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液,Tris饱和酚/氯仿/异戊醇混合液中Tris饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1,混匀,4℃、16000rpm离心10分钟,得到上清液3;取1体积上清液3加入0.1体积的pH5.2NaAc缓冲液和2体积的无水乙醇,-20℃静置30min沉淀DNA,4℃、12000rpm离心10分钟,70%乙醇冲洗沉淀2次,每次4℃、12000rpm离心5分钟;沉淀晾干,得到山药DNA,用TE缓冲液溶解,-20℃保存备用。
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