CN113717969A

CN113717969A - 一类植物组织核酸提取试剂和方法

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Publication number: CN113717969A
Application number: CN202110951569.6A
Authority: CN
Inventors: 安豹; 张怀远; 丁玮云
Original assignee: Hanyuan International Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Hanyuan International Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2021-11-30

Abstract

本发明提供一类植物组织核酸提取试剂和提取方法。该类试剂组成简单，价格便宜，非常容易获得，且不使用有毒试剂，有利于操作者健康，减少对环境的破坏。本发明提供的植物提取核酸的方法操作简单而且快速。

Description

一类植物组织核酸提取试剂和方法

【技术领域】

本发明属于生物工程技术领域，具体地涉及一种植物组织核酸提取试剂、方法、提取试剂盒及提取装置。

【背景技术】

随着基因组测序技术的发展，植物基因组的序列、结构和功能研究飞速发展，而获得高纯度、高含量和高完整度的植物基因组DNA是基因组测序技术得以应用的首要前提。传统的植物基因组DNA提取方法主要有CTAB和SDS法，提取步骤主要包括植物组织进行初步处理，以及之后的细胞裂解、去除杂质、DNA沉淀、漂洗和洗脱等过程。其主要是以CTAB或SDS等去污剂对细胞进行裂解后，释放出细胞中的基因组DNA；再通过氯仿和苯酚抽提或高盐沉淀的方法，去除蛋白质、多酚和多糖等杂质；然后在提取的上清液中加入适量体积的无水乙醇、异丙醇或PEG等有机溶剂将DNA沉淀或吸附在硅胶柱、离子交换柱等介质上；最后用漂洗液进行漂洗后，用低浓度盐溶液溶解或从介质上洗脱下来。

为了更好的研究和理解基因和RNA的生物学功能，人们发展出一些提取植物组织的RNA方法。传统的植物RNA提取方法主要有Trizol法，SDS法，CTAB法，异硫氰酸胍法等。

现有技术揭示了从生物体分离和/或纯化核酸的多种方法。在这方面，有许多经典的一步法，包括在加入水性缓冲剂和有机萃取剂之后进行萃取。核酸保留在水相中，很多杂质被留在有机相而除去。但是，在水相中还会保留一些少许的核酸污染物，需要在更进一步纯化步骤中去除。因此，一些新的替代方法出现并逐渐获得重视，这些方法主要是基于把核酸选择性吸附到固体微柱上，然后，通过清洗把污染物去除，最后，将纯化的核酸从微柱上洗脱下来。但是，这些核酸提取方法随着步骤的增加，所用的试剂种类和/或提取核酸的时间也增加了。

【发明内容】

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，提供一类能够快速而又廉价提取植物组织核酸的试剂和方法。

为实现上述目的，本发明提供一类裂解、结合和/或洗涤试剂，其包含：

-至少一种盐溶液；

-和/或苯酚或水饱和苯酚；

-和/或一种和/或一种以上RNaseA酶抑制剂混合物，如：包含但不限于美国专利第6825340号说明书或美国专利第677720号说明书中公开的一些还原剂。在一些实施方案中，常用的RNase A抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)。优选异硫氰酸胍、2-巯基乙醇、8-羟基喹啉、DEPC等；

-在涉及到DNA提取时，至少一种抑制DNA降解的螯合剂，如：N-乙酰基-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N，N’-二琥珀酸(EDDS)、1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂等；

-和/或一种或一种以上能溶与水的有机物，如：甘油，葡萄糖，果糖，蔗糖，麦芽糖等；

-和/或一种或一种以上缓冲剂，如：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和/或磷酸盐缓冲液等。

出于本发明的目的，术语“盐溶液”表示一种或一种以上的能溶于水而且有利于核酸进入液相的盐溶液或混合物。

出于本发明的目的，术语“螯合剂”表示能螯合一些无机离子，起到抑制核酸降解作用的化合物。

出于本发明的目的，术语“缓冲剂”表示可以为水溶液提供缓冲或稳定溶液PH值的化合物。

出于本发明的目的，术语“有机物”表示能够在水溶液中溶解的有机物，如甘油等。

出于本发明的目的，术语“核酸”表示生物体的遗传物质，包括DNA和RNA。

本发明提供一类裂解、结合和/或洗涤试剂，在提取植物DNA时，需要加入金属离子螯合剂，抑制DNase I酶的活性，防止DNA降解，同时还需要临时加入RNase A去除RNA获得比较纯的DNA。

通常来说盐类化合物的总离子浓度最好在1～4.5M之间。

更进一步说，盐类化合物的总离子强度最好在2.5～4M之间，同时，盐类化合物混合溶液的PH值最好在在6～9之间，有利于RNA的降解和去除。如果盐溶液的PH值在6～9之外，会降低RNase A的活性，使RNA降解不彻底，不能获得纯的DNA。

本发明提供一类裂解、结合和/或洗涤试剂，在提取植物RNA时，可以采用不同的实验路线获得RNA。其中，一种可以通过DNA和RNA共提，核酸结合到基质上，然后，用DNase I酶把植物DNA降解，然后通过去蛋白液把DNase I酶及其降解产物一起除去，洗涤和洗脱RNA。另一种可以通过盐类溶液在酸性条件下，加入试剂盒中的B(300ul水饱和苯酚)溶液，让DNA进入废液，而RNA留在微柱上，即获得比较纯的RNA。

一种从含核酸的植物样品分离和/或纯化核酸的方法，所述方法包括一下步骤：

a)植物样品的处理；

b)在盐类化合物和/或支化或非支化链烷醇的存在下，将释放的核酸固定到能结合核酸的基质上；

c)任选地洗涤固定在基质上的核酸；

d)任选地去洗脱结合在基质上的核酸。

通过上述操作，提取植物组织核酸可在20分钟内，甚至10分钟内完成。

本发明在另一方面提供一类用于提取植物组织核酸的试剂盒，所述试剂盒包含：第一溶液，其含有盐的总浓度浓度为1M～4.5M、一尤其优选盐的浓度在2.5M～4M。

和/或螯合剂，如5mM～150mM EDTA，根据本发明一优选的实施方式，螯合剂浓度在10mM～50mM EDTA，更优选螯合剂浓度为20mM EDTA。

和/或缓冲溶液，优选缓冲溶液浓度在10mM～300mM PH8.0 Tris-HCl或PH值在3～5之间的10mM～300mM NaAc。

和/或一些能溶于水的有机物，优先地选择甘油，优选实施方法甘油浓度1％～30％甘油，一优选甘油浓度在1％～10％之间，又一更优选甘油浓度约3％。

在提取植物RNA的时候，优选的实施方式，植物A溶液为PH值为3～5之间盐溶液。植物B溶液为100ul～600ul苯酚和/或水饱和苯酚，更具体的说，300～400ul苯酚和/或水饱和苯酚。植物C溶液为100ul～700ul去蛋白液，更具体的说，为500ul去蛋白液。

在盐类化合物和/或混合物的存在下，优选支化或非支化链烷醇的存在下，将核酸固定到基质上。因此，优选包含至少一种支链或非支链烷醇的结合试剂。

优选有用的是具有1-5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。根据本发明一优选的实施方式，支化或非支化烷醇是具有1-5个碳原子的醇，优选选自：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、支化或非支化丁醇或戊醇、和/或它们的混合物。

除非另有说明，定义“支化或非支化链烷醇”，具体是丙醇，丁醇和戊醇包它们的异构体形式。更具体说，支化或非支化丙醇包括正丙醇和异丙醇，支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇，支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物。

在本发明试剂优选的实施方式中，使用本发明的裂解试剂裂解样品。使裂解试剂与要裂解的生物样品相接触。根据应用，在各时间点相互独立地加入一种或多种酶。

本发明的第一溶液组成简单，而且非常容易获得，这样就让植物核酸的提取变得非常方便。

本发明的一个突出优点是无毒，绿色环保，有利于实验人员的身体健康，也有利于环境保护。

本发明还有一个突出的优点是稳定，尤其是一些强酸强碱盐，化学性质稳定，可以长期放置。

根据所述方法一优选的实施方式，裂解和/或结合组合物包括和/或一种和/或一种以上的缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-(三(羟甲基)甲基)甘氨酸(TRICINE)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(BICINE)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和/或磷酸盐缓冲剂、醋酸钠、醋酸甲等

根据所述方法一尤其优选的实施方式，裂解和/或结合组合物包含至少一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)和/或醋酸钠和/或磷酸盐缓冲剂。根据所述方法又一更优选的实施方式，裂解和/或结合组合物至少包含一种缓冲化合物，所述缓冲化合物选自：三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)和/或醋酸钠。

植物样品可以在室温或低于室温，例如在4℃至25℃裂解，或者在升高的温度，例如在37℃至90℃的范围内都可以进行裂解。

在优选实施方式中，裂解组合物还可包包含酶，例如蛋白酶K、RNase A、DNase I、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、羧肽酶、氨基肽酶、菠萝蛋白酶、组织蛋白酶C、胶原酶、内肽酶Arg-C、内肽酶Asp-N、内肽酶Glu-C、内肽酶Lys-C、Xa因子、无花果蛋白酶、激肽释放酶、纤溶酶、链酶蛋白酶、凝血酶、消解酶、溶细胞酶、溶菌酶、溶葡萄球菌酶和无色肽酶等。根据所述方法一尤其优选的实施方式，裂解组合物包含和/或至少一种酶，例如蛋白酶K、RNase A、DNase I、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、溶菌酶。

根据所述方法又一更优选的实施方式，裂解组合物包含和/或至少一种酶，例如例如蛋白酶K、RNase A、DNase I。

被处理后的植物样品转入第一溶液中，加入RNase A常温和/或高温孵育，时间从10秒到30分钟范围的孵育时间对于核酸提取是方便的。具体从1分钟到10分钟，更具体约5分钟的孵育时间是有益的。

使用的洗涤剂可以是常规缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4-6M盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。

而且，也可使用含醇的洗涤试剂，例如具有1-5个碳原子的醇的水溶液，优选乙醇的水溶液，具体是含50-100％乙醇的水溶液。

优选将固定到基质的核酸洗涤几次，例如2-4次，优选用不同的洗涤试剂。在优选实施方式中，洗涤首先用具有低到中度离子强度的洗涤试剂进行，然后用含70-100％乙醇的水溶液再次洗涤核酸。

根据所述实施方式，可从基质去除结合的核酸。去除核酸的过程被称为洗脱核酸。也优选使用结合到基质(具体是磁性颗粒)上的核酸，无需去除步骤，例如用于PCR或其他扩增方法，DNA检测方法或DNA鉴定方法等。

结合的核酸可借助低盐含量的洗脱试剂把核酸从颗粒上去除。更具体说，可使用含盐量小于0.1M的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脱试剂。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)。

根据本发明一优选的实施方式，使样品与基于一种或一种以上二氧化硅化合物如二氧化硅、硅酸盐、玻璃和/或硅胶的基质接触并孵育足以实现结合的时间，从而分离核酸。基质可以使现有技术已知的常规设计，例如颗粒形式，膜形式或滤器形式等。为便于去除，优选具有磁性的颗粒。从10秒～30分钟的孵育时间对于核酸是方便的。根据上述所述方法，一尤其优选的实施方式，从1分钟～10分钟的孵育时间对于核酸是方便的。根据上述所述方法，又一更优选实施方式，具体月为5分钟的孵育时间是有益的。

优选才有具有胶状二氧化硅涂层的磁性颗粒来分离核酸。优选采用具有胶状二氧化硅涂层并且平均粒径在1um～40um范围内，优选在5um～20um之间，尤其优选在6um～10um之间，优选粒度分布窄的磁性颗粒来分离核酸。更优选地，采用具有胶状二氧化硅涂层并且平均粒度在6um～10um之间，优选粒度分布窄大的磁性颗粒来分离核酸。

在又一优选的实施方式中，磁性或有磁力吸引的颗粒是具有基于氧化铁的磁性的颗粒，优选选自磁铁矿(Fe₃O₄)，磁赤铁矿(γ-Fe₂-O₃)和/或铁氧体。

能够以有益方式使用的磁性二氧化硅颗粒可参见例如国际申请WO 01/71732，其内容被纳入本文作为参考。

在优选实施方式中，可使用具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性颗粒形式的基于一种或多种二氧化硅化合物的基质。

优选在4℃～90℃之间的温度进行结合，优选在20℃～70℃，尤其优选在45℃～70℃，最佳优选在50℃～65℃。结合也可以是室温进行，例如在15℃～25℃之间。

孵育后，从裂解和/或结合组合物中去除结合到基于一种基质或一种以上二氧化硅化合物基质混合物上的核酸。当使用磁性二氧化硅颗粒时，这可以在磁场的帮助下实现。例如，通过施加磁场将磁性颗粒拖拽至在其中进行孵育的容器的壁上，用吸管尖端或移液枪把液体移除；或者将磁性颗粒固定到塑料涂层保护的磁棒上，可以取出磁棒，把废液去除。

优选地，固定到基质上的核酸可以在去除之前进行洗涤。洗涤步骤优选通过孵育洗涤溶液与加载的颗粒来进行，优选涉及所述颗粒的重悬，例如通过震摇和/或应用磁场。优选去除污染的洗涤溶液，即结合后留下裂解和/或结合组合物，具体使裂解组合物和/或结合组合物的混合物。

使用的洗涤试剂可以是常规洗涤缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤试剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的溶液和/或0.05M～0.2M柠檬酸钠溶液等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4-6M盐酸胍的溶液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。

更具体说，利用磁性颗粒，由于颗粒的磁性聚集而便于进行分离和/或洗涤步骤。

最后的洗涤步骤或水洗涤之后，可干燥优选的磁性颗粒，例如真空干燥或者通过蒸发液体或者让液体蒸发。

根据所述方法的步骤d)，可从基质上去除结合的核酸。去除核酸的过程被称为洗脱。

也优选使用结合到基质(具体是磁性颗粒)上的核酸，无需去除步骤，例如用于PCR或其他扩增方法，DNA检测方法或DNA鉴定方法。

具体说，使用裂解和/或结合组合物产生了从生物样品分离核酸，具体是分离植物DNA的尤其有益的方法。

即使在储存之后，裂解和/或结合试剂的优点尤其在于可获得优良产品。

本发明还涉及从植物样品分离和/或纯化核酸的试剂盒，该试剂盒包含本发明的裂解、结合和/或洗涤试剂。

在优选实施方式中，该试剂盒还包含基于一种或一种以上二氧化硅化合物的基质。具体是具有二氧化硅表面的磁性或磁力吸引性颗粒形式的基于一种或一种以上的二氧化硅化合物的基质。优选包含在所述试剂盒中的磁性二氧化硅颗粒的例子参见国际申请WO01/71732，其全部内容被纳入本文作为参考。

在又一优选的实施方式中，试剂盒可包含除磁性二氧化硅颗粒之外的硅烷化载体材料，优选具有二氧化硅膜的离心柱。

所述记载前述植物组织核酸试剂的载体，典型地为纸质说明书，也可以是记载所述试剂的电子版说明书的任意载体(包括但不限于可移动磁盘、光盘、电子墨水屏幕、网络资源及其地址等)，只要能通过读取该载体而获知该试剂，则均在本概念范围内。

本发明在另一方面提供一种计算机可读载体，其记载包含用于实施前述提取植物组织核酸试剂的计算机程序。所述计算机作广义理解，包括但不限于单片机、PLC、单板机、工控机、PC机等形式。所述计算机可读载体包括但不限于Flash、EEPROM、磁盘(软盘或硬盘)、光盘等任何形式。所述计算机程序可以是任意语言编写的，例如汇编、JAVA、VB、VC、C++、Python，只要能够控制相关系统实施所述方法即可。

本发明在另一方面提供一种自动化核酸提取装置，所述装置包含：液体加注/吸移组件、离心组件、研磨组件以及与上述组件电连接的控制器；所述控制器包含前述的计算机可读载体。其中液体加注/吸移组件用于控制前述方法中各种液体的加注和移除，离心组件和研磨组件分别用于执行相应的离心及研磨操作，所述控制器用于控制上述组件以自动化地执行前述植物组织核酸的提取。自动化的核酸提取装置广泛见于现有技术中，因而在此不予赘述。

本发明提出的植物组织核酸提取试剂、提取试剂盒和提取装置至少能产生如下有益效果：

1.试剂价格便宜而且非常容易获得；

2.不使用有毒试剂，对植物核酸提取过程是绿色环保的，有利于实验者的健康和减少对环境的破坏；

3.试剂组成简单而且非常稳定。

【附图说明】

图1是本发明所述试剂中不同NaAc浓度提取结果的DNA凝胶电泳图；

图2是本发明所述试剂中不同KAc浓度提取结果的DNA凝胶电泳图；

图3是本发明所述试剂中不同NaCl浓度提取结果的DNA凝胶电泳图；

图4是本发明所述试剂中不同EDTA浓度提取结果的DNA凝胶电泳图；

图5是本发明所述试剂中NaCl提取7种植物DNA的凝胶电泳图；

图6是本发明所述4种试剂分别提取绿萝叶片RNA的凝胶电泳图。

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述，这些描述仅用于帮助理解本发明。

实施例1——NaAc最佳浓度的确定

如前所述，对绿萝叶片进行DNA提取，用液氮冷冻干燥法把绿萝叶片研磨成极为细小的粉末状态。然后，把粉末转入600ul的第一溶液中。其中第一溶液包含20mM EDTA、实验前，临时加入的8ul 10mg/ml RNase A，以及体积浓度分别为1M、2M、3M、4M的NaAc。加入0.6倍的异丙醇，转入微柱，再用600ul的75％乙醇的洗脱液清洗2次，最后用100ul的洗脱液将DNA洗脱下来。将结果在Nanodrop上测定(表1)，并通过凝胶电泳检测(图1)，由1M～4M的NaAc的结果可见，3M NaAc提取DNA效果最佳。

表1：不同NaAc浓度提取得到的绿萝叶片DNA浓度

NaAc浓度	1.0M	2.0M	3.0M	4.0M
					DNA浓度	15.12ng/ul	25.43ng/ul	45.81ng/ul	24.93ng/ul
A260/A280	1.832	1.837	1.821	1.819

实施例2——KAc最佳浓度的确定

如前所述，对绿萝叶片进行DNA提取，用液氮冷冻干燥法把绿萝叶片研磨成极为细小的粉末状态。然后，把粉末转入600ul的第一溶液中。其中第一溶液包含20mM EDTA、实验前，临时加入的8ul 10mg/ml RNase A，以及体积浓度分别为1M、2M、3M、4M的KAc。加入0.6倍的异丙醇，转入微柱，再用600ul的75％乙醇的洗脱液清洗2次，最后用100ul的洗脱液将DNA洗脱下来。将结果在Nanodrop上测定(表2)，并通过凝胶电泳检测(图2)，由1M～4M的KAc的结果可见，3M KAc提取DNA效果最佳。

表2：不同KAc浓度提取得到的绿萝叶片DNA浓度

KAc浓度	1.0M	2.0M	3.0M	4.0M
					DNA浓度	11.28ng/ul	36.46ng/ul	49.61ng/ul	20.35ng/ul
A260/A280	1.824	1.819	1.811	1.817

实施例3——NaCl最佳浓度的确定

如前所述，对绿萝叶片进行DNA提取，用液氮冷冻干燥法把绿萝叶片研磨成极为细小的粉末状态。然后，把粉末转入600ul的第一溶液中。其中第一溶液包含20mM EDTA、实验前，临时加入的8ul 10mg/ml RNase A，以及体积浓度分别为2.5M、3M、3.5M、4M的NaCl。加入0.6倍的异丙醇，转入微柱，再用600ul的75％乙醇的洗脱液清洗2次，最后用100ul的洗脱液将DNA洗脱下来。将结果在Nanodrop上测定(表3)，并通过凝胶电泳检测(图3)，由2.5M～4M的NaCl的结果可见，3M～4M NaAc提取DNA效果都比较好。

表3：不同NaCl浓度提取得到的绿萝叶片DNA浓度

NaCl浓度	2.5M	3.0M	3.5M	4.0M
					DNA浓度	21.62ng/ul	19.38ng/ul	45.36ng/ul	44.93ng/ul
A260/A280	1.817	1.813	1.808	1.809

实施例4——EDTA最佳浓度的确定

如前所述，对绿萝叶片进行DNA提取，用液氮冷冻干燥法把绿萝叶片研磨成极为细小的粉末状态。然后，把粉末转入600ul的第一溶液中。其中第一溶液包含3.5M的NaCI、实验前，临时加入的8ul 10mg/ml RNase A，以及体积浓度分别为20mM、50mM、80mM、100mM的EDTA。加入0.6倍的异丙醇，转入微柱，再用600ul的75％乙醇的洗脱液清洗2次，最后用100ul的洗脱液将DNA洗脱下来。将结果在Nanodrop上测定(表4)，并通过凝胶电泳检测(图4)，由20mM～100mM的EDTA的结果可见，20mM的EDTA最佳。

表4：不同EDTA浓度提取得到的绿萝叶片DNA浓度

EDTA浓度	20mM	50mM	80mM	100mM
					DNA浓度	66.67ng/ul	61.27ng/ul	63.60ng/ul	62.09ng/ul
A260/A280	1.836	1.842	1.838	1.883

实施例5——7种类植物组织的DNA提取

如前所述，分别对约100mg的马铃薯叶片、杨树叶片、花叶青木叶片、卤蕨叶片、山莴苣叶片、四蕊朴叶片、龙葵叶片进行DNA提取，用液氮冷冻干燥法把上面7种不同植物叶片分别研磨成极为细小的粉末状态。然后，把粉末分别转入600ul的第一溶液中。其中第一溶液包含20mM EDTA、实验前，临时加入的8ul 10mg/ml RNase A，3.5M NaCl和3％甘油。分别加入0.6倍的异丙醇，转入微柱，再用600ul的75％乙醇的洗脱液清洗2次，最后用100ul的洗脱液将DNA洗脱下来。将结果在Nanodrop上测定(表5)，并通过凝胶电泳检测(图5)。可见，用简单盐溶液提取植物DNA具有普适性的。

表5：7种不同植物叶片DNA浓度

植物名称

马铃薯

杨树

花叶青木

卤蕨

山莴苣

四蕊朴

龙葵

DNA浓度

39.36ng/ul

28.51ng/ul

105.7ng/ul

11.31ng/ul

35.51ng/ul

20.49ng/ul

A260/A280

1.827

1.824

1.801

1.819

1.813

1.817

1.828

实施例6——分别用NaAc、NaCl、KAc和KCl提取绿萝叶片RNA

上述4种试剂的第一溶液组成分别为：3M NaAc和3％甘油，溶液PH4.5；3.5M NaCl、100mM NaAc和3％甘油，溶液PH4.5；3M KAc和3％甘油，溶液PH4.5；2.5M KCl、100mM NaAc和3％甘油，溶液PH4.5。分别对约100mg的绿萝叶片进行RNA提取，植物B为：300ul水饱和苯酚，植物C为500ul去蛋白液(38％乙醇、5M盐酸胍、20mM Tris-HCl)，将结果在Nanodrop上测定(表6)和图6。其中上述所用溶液都是用DEPC水配制的。可见，用简单的盐溶液提取植物RNA也具有普适性的。

表6：4种试剂分别提取得到的绿萝叶片RNA浓度

试剂	NaAc	NaCl	KAc	KCl
					RNA浓度	102.1ng/ul	112.8ng/ul	95.24ng/ul	97.31ng/ul
A260/A280	2.051	2.063	2.048	2.035

由结果可见，本发明提供的提取试剂在植物组织核酸提取方面具有较好的普适性。更为突出的是，本发明提供的这类试剂价格便宜，易得，稳定性好，绿色环保。

本发明所用试剂的来源：

EDTA 国药试剂CAS号：6381-92-6

Tris-HCl 国药试剂CAS号：77-86-1

NaCl 国药试剂CAS号：7647-14-5

KCl 国药试剂CAS号：7447-40-7

NaAc 国药试剂CAS号：127-09-3

KAc 国药试剂CAS号：127-08-2

异丙醇国药试剂CAS号：67-63-0

无水乙醇国药试剂CAS号：64-17-5

DEPC 上海生物工程股份有限公司CAS号：1609-47-8

RNase A 汉远化生医国际科技(北京)有限公司

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和结构的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、组合、替换和变型，本发明的保护由所附权利要求及其等同范围限定。

Claims

1.一种裂解、结合和/或洗涤试剂，其中包含：

-至少一种能溶解植物核酸的盐类化合物；

-和/或至少一种防止DNA降解的金属离子螯合剂(提取植物DNA)；

-和/或至少一种缓冲化合物；

-和/或一些能溶于水的有机物；

-和/或苯酚或水饱和苯酚；

-和/或一种和/或一种以上RNase A酶抑制剂混合物，如：包含但不限于美国专利第6825340号说明书或美国专利第677720号说明书中公开的一些还原剂。在一些实施方案中，常用的RNase A抑制剂为焦碳酸二乙酯(DEPC)。优选异硫氰酸胍、2-巯基乙醇、8-羟基喹啉、DEPC等；

2.如权利要求1所述的裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，盐的总浓度在1M～4.5M之间。

3.如权利要求1所述的裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，在提取植物组织DNA时，选自PH值在6～9之间的盐类化合物较好且加入螯合剂防止DNA降解，远离PH值在6～9之外的盐类化合物，不利于RNA的降解或降解速度变慢。

4.如权利要求1所述的裂解、结合和/或洗涤试剂，其特征在于，在提取植物组织RNA时，如果采用基质上酶解DNA而获得RNA，对盐类没有什么特殊要求，具体的说，用DNase I把DNA酶解，然后用去蛋白液再去除DNase I而保留RNA；如果采用直接把DNA和RNA分离的方法，需要添加缓冲溶液，其最佳PH值在4～5之间，再分别加入苯酚和/或水饱和苯酚，再加入去蛋白液，剩下RNA。

5.一种从含核酸的植物样品分离和/或纯化核酸的方法，所述方法包括一下步骤：

a)植物样品的处理；

c)任选地洗涤固定在基质上的核酸；

d)任选地去洗脱结合的核酸。

6.如权利要求5a)所述植物样品的处理，具体来说包含但不限于，机械研磨法，液氮冷冻干燥研磨法，酶解法等。

7.根据权利要求5所述的植物样品核酸提取方法，其特征在于：步骤(b)通过结合试剂包含但不限于支化或非支化的链烷醇，具体说，具有1～5个碳原子的短链支化或非支化链烷醇。支化或非支化丁醇包括正丁醇、异丁醇、仲丁醇、和叔丁醇；支化或非支化戊醇包括例如正戊醇和异戊醇。优选使用选自下组的醇：甲醇、乙醇、异丙醇、和/或其混合物，尤其优选使用选自下组的醇：乙醇、异丙醇和/或其混合物，优选地选择异丙醇，其用量：0.3～2倍上清体积。

8.根据权利要求5所述的植物样品核酸提取方法，其特征在于：步骤(c)所用的洗涤剂可以是常规缓冲剂或者任何其他合适的介质。通常，优选具有低到中度离子强度的洗涤剂，例如10mM三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的裂解液和/或0.05M～0.2M柠檬酸钠裂解液等。还可使用具有较高盐浓度的洗涤缓冲剂，例如4～6M盐酸胍的裂解液。如上所述，本发明的洗涤试剂类似地是合适的洗涤试剂。例如具有1～5个碳原子的醇的水裂解液，优选乙醇的水裂解液，具体是含50～100％乙醇的水裂解液。清洗次数：一次或一次以上。

9.根据权利要求5所述的植物样品核酸提取方法，其特征在于：步骤(d)所用的洗脱试可以室低盐含量的核酸洗脱剂，如：含盐量小于0.1M的试剂作为低盐含量的洗脱试剂。尤其优选包含缓冲化合物三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)的洗脱试剂和/或0.01％～0.02％DEPC水裂解液。尤其适用于洗脱的还有软化水，任选地包含一种或多种添加剂，例如螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、叠氮化合物和/或缓冲化合物如三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)等。洗脱次数：一次或一次以上。

10.根据权利要求5所述的植物样品核酸提取方法，其特征在于：步骤(b)、(c)、(d)均在室温下完成的，也可以在高温下完成，例如：30℃～95℃。

11.一种用于实施如权利要求1～10任一项所述试剂和方法的试剂盒，以及记载如权利要求1～10任一项所述方法的载体。

12.一种计算机可读载体，其记载包含用于实施如权利要求1～10任一项所述试剂和方法的计算机程序。