CN104211835B - 利用离子液体从黄芪药渣中提取阿拉伯木聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用离子液体从黄芪药渣中提取阿拉伯木聚糖的方法，步骤包括：对黄芪药渣干燥、粉碎；利用淀粉酶除去黄芪药渣粉末中含有的淀粉；将处理过的黄芪药渣粉与离子液体1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐混合提取阿拉伯木聚糖；对提取的阿拉伯木聚糖清洗、除蛋白，最后低温冻干即可获得聚糖粉末。本发明简便易操作，克服了现有阿拉伯木聚糖分离纯化上的技术不足，实现黄芪药材资源的综合利用。

Description

利用离子液体从黄芪药渣中提取阿拉伯木聚糖的方法

技术领域

本发明涉及中药提取方法，具体属于一种利用离子液体从黄芪药渣中提取阿拉伯木聚糖的方法。

背景技术

随着中药生产工业化、规模化程度不断加深，仅以黄芪为例，国内年消耗量超过100万吨，而且逐年攀升。2010版中国药典规定的中药材就有616种，如果大量中药材提取后剩下的药渣直接排放，将对环境造成污染。另外，一些不法商贩为了追逐利益将药渣重新处理后按药材出售，严重危害人民健康。近年来，中药药渣虽然进行了循环利用，比如制成有机肥料、造纸等，但是这些产品附加值较低，甚至造成环境的二次污染。因此利用节约环保的新技术，开发附加值高的新产品具有重要意义。

中药药渣主要是细胞壁组分，多种活性多糖成分蕴含在细胞壁组分(果胶、半纤维素等)中，其中半纤维素含有活性多糖的种类最为丰富，被称为潜在的“药物资源库”。中国药典2010版规定的正品黄芪药材为豆科草本植物黄芪属蒙古黄芪或膜荚黄芪的根，具有补气升阳，固表止汗，利水消肿，生津养血，行滞通痹，托毒排脓，敛疮生肌等功效。我们在黄芪药材资源综合利用研究过程中发现黄芪半纤维素中主要是阿拉伯木聚糖，该糖已被证实具有显著改善肠道环境、提高免疫力、降血糖、抗病毒、抗肿瘤等多种功效。然而细胞壁中果胶、半纤维素、纤维素和木质素等复合体的结构特征导致其难以加工，使其在应用中受到限制。目前利用碱法提取、酶解等技术开发出的阿拉伯糖木聚糖保健品已在日本和美国等地上市。碱法提取率虽高，但对环境污染严重；酶法虽然对环境无影响，但存在得率不高等问题。因此开发一种节约环保的黄芪药渣阿拉伯木聚糖提取方法具有重要意义。

近年来，离子液体以其优良的溶解性能、环保可回收等特点备受瞩目，且在萃取过程中保持了原有生物物质的活性及构象，因此已被广泛用于蛋白质、抗生素、生物碱、药物和小分子有机化合物的分离和纯化。在多糖分离纯化方面，Masayuki等用[Bmim]Cl(1-丁基-3-甲基咪唑氯化盐)溶解纤维素微晶(Masayukietal.,CarbohydratePolymers，2013，92：651-658)，林妲等用[Amim]Cl(1-烯丙基-3-甲基咪唑氯化盐)分离毛竹半纤维素(林妲等,现代化工，2012，32(2)：41-44)。据报道，氯盐离子液体之所以对纤维素具有较强的溶解能力是因为其阴离子中的氯离子电负性较强，可以与纤维素中的羟基形成氢键。但是，这类离子液体的粘度较大，且含有有毒的卤素离子，更重要的是它们只能将纤维素部分溶解，不能完全转化为水溶性的物质，所以在实际应用中仍然受到一定的限制。硝酸酯类离子液体是由甲基咪唑与硝酸酯一步合成的离子液体，不含卤素，热稳定性好，且粘度低。而且硝酸酯类离子液体的阴离子中含有氧负离子，其电负性(3.5)远远大于氯离子的电负性(3.0)。因此，从理论上来讲，硝酸酯类离子液体与纤维素中的羟基形成氢键的能力会更强，对多糖的溶解转化能力也就越强。因此通过实验验证，本发明提供了一种利用离子液体[Bmim]NO₃(1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐)提取黄芪药渣中阿拉伯木聚糖的方法。该方法具有回收离子液体简便、节约环保、多糖得率较高、操作工艺简便等特点。经检索，该方法尚未见文献报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有阿拉伯木聚糖分离纯化困难等问题，在保证多糖结构和活性不受影响的前提下，提供一种利用离子液体从黄芪药渣中提取阿拉伯木聚糖的方法，以实现黄芪药材资源的综合利用。

本发明提供的一种利用离子液体从黄芪药渣中提取阿拉伯木聚糖的方法，包括如下步骤：

1)、原料预处理：将干燥的黄芪药渣粉碎成粉末，备用；

2)、除淀粉：将上述粉末加入PH7.0，200U/mL的猪胰α-淀粉酶Tris-HCl缓冲液，所述粉末与猪胰α-淀粉酶Tris-HCl缓冲液的质量比例1:5～20，37℃震荡过夜；5000转/分钟离心，弃上清；沉淀用去离子水清洗，5000转/分钟离心，弃上清收集沉淀；重复清洗三次后，烘干备用；

3)、提取阿拉伯聚糖：将步骤2)得到的沉淀加入离子液体，65～90℃下磁力搅拌18～36小时；搅拌结束并冷却后，加入去离子水，静置并去除沉淀，回收滤液；浓缩滤液除去水分，加入四氢呋喃，静置收集沉淀，即得阿拉伯木聚糖粗品，上清为离子液体，可回收继续使用；

其中沉淀、离子液体、去离子水和四氢呋喃的质量比为1︰2～100︰200～600︰50～200；

4)、除蛋白：粗品用95％的乙醇洗涤3～6次后，复溶配成5～20％的聚糖粗品水溶液，加入链蛋白酶，比例为粗品︰蛋白酶＝100:1～5，37℃酶解24～48小时，取出后浓缩至原体积，再用Savage法(氯仿：正丁醇＝4:1)脱蛋白3次后得到聚糖溶液；

5)、干燥：将聚糖溶液冷冻干燥过夜，得到黄芪药渣阿拉伯木聚糖。

结构鉴定：上述聚糖水解后，经过乙酰化，并采用气相色谱-质谱联用技术分析表明，该聚糖主要由阿拉伯糖(40～53％)、木糖(30～45％)，半乳糖(2～30％)组成。经甲基化，硼氢化钠还原后乙酰化，并通过气相色谱-质谱联用技术分析表明：该聚糖连接方式主要包括阿拉伯糖1,3连接，木糖1,4连接，半乳糖1,6连接。

所述的离子液体为[Bmim]NO₃，即1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐。

本发明与现有技术相比主要有以下优点：以黄芪废弃药渣为原料，提取制备具有高附加值的阿拉伯木聚糖类成分；首次采用绿色环保的离子液体对黄芪药渣多糖进行分离，避免了以往碱法对环境污染和酶法得率较低等问题。本发明实现了黄芪药材资源的综合利用，将产生良好的社会效益和经济效益。

附图说明

图1气相色谱质谱检测阿拉伯木聚糖中单糖成分总离子流图

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1：

1)、阿拉伯木聚糖的提取：干燥的黄芪药渣经粉碎后，过百目筛，备用；将上述粉末加入猪胰α-淀粉酶(Tris-HCl缓冲液，PH7.0，200U/mL)溶液(粉末与猪胰α-淀粉酶溶液质量比例1:10)，37℃震荡过夜。除淀粉后，5000转/分钟离心，弃上清。沉淀用去离子水清洗，5000转/分钟离心，弃上清收集沉淀。重复清洗三次后，烘干备用。1g上述除淀粉后的药渣粉末加入5g的离子液体[Bmim]NO₃(1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐)，65℃下磁力搅拌36小时。搅拌结束并冷却后，加入200mL去离子水，静置并去除沉淀，回收滤液。浓缩滤液除去水分，加入50mL四氢呋喃，静置收集沉淀，即是阿拉伯木聚糖粗品，上清为离子液体，可回收继续使用。聚糖粗品用95％的乙醇洗涤6次后，复溶配成5％的糖液，加入链蛋白酶，比例为聚糖粗品︰蛋白酶＝100︰1，37℃酶解24小时，取出后浓缩除去水分，再用Savage法(氯仿：正丁醇＝4:1)脱蛋白3次后得到聚糖溶液。将聚糖溶液冷冻干燥过夜，得到阿拉伯木聚糖。

2)、阿拉伯木聚糖中单糖组成分析：称取10mg阿拉伯木聚糖，加入2mL三氟乙酸(2mol/L)溶液，121℃水解90分钟。取200uL水解液低温冻干，加入0.5mL10mg/mL硼氢化钠的二甲亚砜溶液室温振荡反应2小时。逐滴加入4mol/L乙酸中和，PH试纸检测。加入0.1mL甲醇，氮气吹干。加入200uL乙酸酐和50uL1-甲基咪唑进行乙酰化反应，30分钟后加水停止反应。加入2mL二氯甲烷萃取后，用氮气适当吹浓后，取有机相1uL进GC/MS分析。分析结果具体见表1和图1。

气相色谱分析条件：美国热电Finnigan气相色谱质谱连用仪，色谱条件:DB-17柱(30m×0.318mmi.d,0.25umfilmthickness)，进样口温度250℃，载气为99.999％的高纯He，流速1ml/min，初始柱前压26.3kPa，柱温度100℃(保持3.5min)，15℃/min至160℃(保持20min)，15℃/min至200℃(保持15min)，20℃/min至280℃(保持5min)。分流进样1uL(分流比10)。

质谱条件：用电子轰击(electronimpactEI)源分析，电子能量为70eV，离子源温度260℃，接口温度250℃。选取全离子碎片扫描模式时，质量扫描范围为50-600，溶剂延迟3.5min。

表1阿拉伯木聚糖水解检测单糖种类及含量

3)、阿拉伯木聚糖中单糖连接位点分析：称取200mg的阿拉伯木聚糖，溶解于3mLDMSO中。加入20mg氢氧化钠后在超声波细胞破碎仪中超声直至样品全部溶解。加入1mL碘甲烷密闭，至于控温摇床中4℃、200转/分钟摇3小时。反应结束后，取200uL加入适量的去离子水停止反应。加入二氯甲烷萃取后，取有机相旋干。加入3mL2mol/L的三氟乙酸于120℃水解90分钟。旋干后，加入0.5mL新配制10mg/mL硼氘化钠室温振荡反应2小时后，逐滴加入4mol/L乙酸中和，PH试纸检测。加入0.1mL甲醇，氮气吹干。加入200uL乙酸酐和50uL1-甲基咪唑进行乙酰化反应，30分钟后加水停止反应。加入2mL二氯甲烷萃取后，用氮气适当吹浓后，取有机相1uL进GC/MS分析。检测结果表明聚糖连接方式是阿拉伯糖1,3连接，木糖1,4连接，半乳糖1,6连接。

实施例2：

干燥的黄芪药渣经粉碎后，过百目筛，备用；将上述粉末加入猪胰α-淀粉酶(Tris-HCl缓冲液，PH7.0，200U/mL)溶液(粉末与猪胰α-淀粉酶溶液质量比例1:20)，37℃震荡过夜。除淀粉后，5000转/分钟离心，弃上清。沉淀用去离子水清洗，5000转/分钟离心，弃上清收集沉淀。重复清洗三次后，烘干备用。5g上述除淀粉后的药渣粉末加入50g的离子液体[Bmim]NO₃(1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐)，90℃下磁力搅拌18小时。搅拌结束并冷却后，加入600mL去离子水，静置并去除沉淀，回收滤液。浓缩滤液除去水分，加入200mL四氢呋喃，静置收集沉淀，即是阿拉伯木聚糖粗品，上清为离子液体，可回收继续使用。聚糖粗品用95％的乙醇洗涤六次后，复溶配成20％的糖液，加入链蛋白酶，比例为聚糖粗品︰蛋白酶＝100︰1，37℃酶解48小时，取出后浓缩除去水分，再用Savage法(氯仿：正丁醇＝4:1)脱蛋白3次后得到聚糖溶液。将聚糖溶液冷冻干燥过夜，得到阿拉伯木聚糖。经气相色谱-质谱联用技术(同实施例一)分析阿拉伯木聚糖单糖组成为：阿拉伯糖40％、木糖45％，半乳糖15％组成。该聚糖连接方式主要包括阿拉伯糖1,3连接，木糖1,4连接，半乳糖1,6连接。

实施例3：

干燥的黄芪药渣经粉碎后，过百目筛，备用；将上述粉末加入猪胰α-淀粉酶(Tris-HCl缓冲液，PH7.0，200U/mL)溶液(粉末与猪胰α-淀粉酶溶液质量比例1:15)，37℃震荡过夜。除淀粉后，5000转/分钟离心，弃上清。沉淀用去离子水清洗，5000转/分钟离心，弃上清收集沉淀。重复清洗三次后，烘干备用。3g上述除淀粉后的药渣粉末加入40g的离子液体[Bmim]NO₃(1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐)，70℃下磁力搅拌36小时。搅拌结束并冷却后，加入400mL去离子水，静置并去除沉淀，回收滤液。浓缩滤液除去水分，加入150mL四氢呋喃，静置收集沉淀，即是阿拉伯木聚糖粗品，上清为离子液体，可回收继续使用。聚糖粗品用95％的乙醇洗涤六次后，复溶配成15％的糖液，加入链蛋白酶，比例为聚糖粗品︰蛋白酶＝100︰1，37℃酶解32小时，取出后浓缩除去水分，再用Savage法(氯仿：正丁醇＝4:1)脱蛋白3次后得到聚糖溶液。将聚糖溶液冷冻干燥过夜，得到阿拉伯木聚糖。经气相色谱-质谱联用技术(同实施例一)分析阿拉伯木聚糖单糖组成为：阿拉伯糖43％、木糖38％，半乳糖19％组成。该聚糖连接方式主要包括阿拉伯糖1,3连接，木糖1,4连接，半乳糖1,6连接。

Claims (3)

1.一种利用离子液体从黄芪药渣中提取阿拉伯木聚糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、将干燥的黄芪药渣粉碎成粉末，备用；

2)、将上述粉末加入pH7.0、200U/mL的猪胰α-淀粉酶Tris-HCl缓冲液，所述的粉末与猪胰α-淀粉酶Tris-HCl缓冲液的质量比例为1:5～15，37℃震荡过夜；离心分离，弃上清；沉淀用去离子水清洗，离心分离，弃上清收集沉淀；重复清洗2～3次后，烘干备用；

3)、将步骤2)得到的沉淀加入离子液体，65～90℃下磁力搅拌18～36小时；搅拌结束并冷却后，加入去离子水，静置并去除沉淀，回收滤液；浓缩滤液除去水分，加入四氢呋喃，静置收集沉淀，即得阿拉伯木聚糖粗品，上清为离子液体，可回收继续使用；

其中沉淀、离子液体、去离子水和四氢呋喃的质量比为1︰2～100︰200～600︰50～200；

4)、粗品用95％的乙醇洗涤3～6次后，复溶配成5～20％的聚糖粗品水溶液，加入链蛋白酶，比例为粗品︰蛋白酶＝100︰1～5，37℃酶解24～48小时，取出后浓缩至原体积，再用Savage法脱蛋白后得到聚糖溶液；

5)、将聚糖溶液冷冻干燥过夜，得到阿拉伯木聚糖。

2.如权利要求1所述的一种利用离子液体从黄芪药渣中提取阿拉伯木聚糖的方法，其特征在于，所述的离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑硝酸盐。

3.如权利要求1或2所述提取方法得到的阿拉伯木聚糖。