CN101067146B

CN101067146B - 甘草酸的生物提取方法

Info

Publication number: CN101067146B
Application number: CN2007100982537A
Authority: CN
Inventors: 吴力克
Original assignee: CHONGQING LIKE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Chongqing Ke Micro Ecological Technology Co. Ltd.
Priority date: 2007-04-25
Filing date: 2007-04-25
Publication date: 2011-07-27
Anticipated expiration: 2027-04-25
Also published as: CN101067146A

Abstract

本发明公开了一种甘草酸的生物提取方法，及其主要化学成分制成中间体原料或终端产品。所述方法包括以下步骤：将甘草粉碎制成超微粉体，再经酶解、煎滤和发酵充分解离；发酵液经离心去除菌体以及灭酶处理，化学沉淀析出甘草酸粗品，经纯化得纯品。所述制备成型制剂指采用制剂学上通用方法将甘草提取成分的粗品或纯品制成各类剂型。本发明有益效果：有效成分得率大幅提高，废渣减少，技术路线简化、能耗和成本降低，充分规避了化学法技术路线中过多使用强酸、强碱及有害溶剂对环境造成的污染，克服了剧烈的化学反应条件所导致的有效化学成分消旋化、异构化和结构重排问题。

Description

甘草酸的生物提取方法

技术领域

本发明涉及药品、食品、日化品、化妆品添加剂以及兽药、饲料添加剂生产技术领域，涉及一种用于中药化学成分的生物提取技术及其应用，具体地说，是应用酶工程和发酵工程为核心技术的工艺从甘草中提取其主要化学成分甘草酸，并将其制成中间体原料或终端产品。

背景技术

甘草(Glycyrrhiza)为豆科属多年生植物，种类较多，主要分布于我国西北、华北、华中和东北地区，具有抗寒、抗盐碱、耐热、耐旱等优良特性，生态适应性强，生命力旺盛，系干旱、半干旱地区重要的植物资源之一。甘草被我国认定为食药两用植物，目前作为调味剂、增稠剂、辅助剂、添加剂、防腐剂、抗氧化剂等被广泛用于食品、饲料、化妆品和日用化工等产业，但其最重要的用途是在医药领域。中医药有“十方九草”之说，即大部分中药复方的配伍都离不开甘草，被誉为中药的“国佬”；其主要化学成分甘草酸及其药理活性成分甘草次酸，更是被大量用于中成药和现代中药中。此外，甘草以其独特而显著的药学作用，也受到了其它国家特别是发达国家的极大关注，成为和银杏齐名的被西方国家进行了较为彻底研究和开发的植物药。甘草酸的衍生物甘草酸钠(GaAHS)在英、法、日、德等国获得了用作抗癌药的专利，其治疗子宫癌、直肠癌及膀胱癌的疗效，超过了氨甲喋呤、长春新碱、5-氟尿嘧啶等常用抗癌药的疗效，而无一般抗癌药的严重副作用。

近几年来，甘草主要化学成分在抑制艾滋病毒(HIV)、防治溃疡病以及抗过敏、保肝、降脂、解毒等方面的显著效果，也引起了国内外药学界的极大兴趣，加大了对甘草的开发和商业化力度。正因如此，从80年代至今，甘草一直是我国乃至全球的紧缺植物药材，特别是野生甘草，由于利益驱动下的无限制采挖，已在濒危边沿。另一方面，甘草作为重要的固沙植物品种，对治理沙漠、防治土地荒漠化同样具有重要意义，故国家曾多次下文，禁止对原产地的野生甘草进行滥采乱挖，从而更加剧了获得和利用甘草资源的压力；目前甘草虽已实现人工栽培，但还远远不能满足国内外市场的旺盛需求。

从甘草主要化学成分的提取技术来看，目前的常规工艺几乎均涉及强酸、强碱和各种有机萃取剂的应用，存在如下一系列弊端：①过多的萃取用料和设备增加生产成本；②过度产生的化学剂萃取废液严重污染环境；③常规技术不能有效解除根茎类中药中含有的大量木质素和纤维素对药效学成分的结构阻隔作用，致使有效成分的溶出和得率偏低，大量药渣丢弃，严重浪费资源，也污染环境；④强酸、强碱和其它萃取溶剂的剧烈化学反应条件，造成有效化学成分消旋化、异构化和结构重排等问题，明显影响有效成分的稳定性、纯度和药学效果；⑤无机和有机萃取溶剂的强烈药理作用和/或易爆性、腐蚀性等，对工作环境和人体健康存在安全威胁。鉴于上述情况，亟需开发可以明显提高有效成分得率(从而相对节省原料)、高效综合利用原料资源、反应条件温和、大幅度减少废水废渣、有利于环境保护、安全生产以及降低对人体健康威胁的新型中药提取工艺。

发明内容

本发明的目的在于应用酶工程和发酵工程为核心技术的工艺从甘草中提取其主要化学成分甘草酸，旨在克服传统提取工艺的上述弊端，提供能够充分综合利用中药资源、可使有效成分得率大幅度提高、不使用对环境和人体健康有害的萃取剂及其设备、提取条件温和节能、几乎没有废液和废渣排放、可产生高附加值副产品的一种增效节耗、环境友好、资源节约的绿色提取工艺，从而达到有效利用宝贵的甘草资源、促进甘草及中药产业发展的目的。

本发明的另一目的是将提取、纯化的甘草有效成分用制剂学上的通用方法制成各类剂型，包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、口服液、注射液等。

实现本发明的目的技术方案如下：

一种甘草中主要化学成分的生物提取方法，包括以下步骤：将甘草经细粉化和超微粉化处理后，由来自微生物的木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应，用生物降解酶深度破坏甘草细胞壁及细胞网架结构，酶解反应后通过煎提、分级过滤，得到富含有效成分的滤液和主要含无关成分的滤渣；将滤渣进一步处理，分离成副产品木质素和纤维素，将滤液减压浓缩为发酵原液，接种嗜甘草乳杆菌进行厌氧液体深层发酵；终止发酵后先离心去除菌体，再用相应有机溶剂从发酵物中分别萃取出甘草酸粗品，进一步用吸附和重结晶方法对其进行纯化，得到纯品；用制剂学通用方法将甘草酸粗品和/或纯品制成所需的各类制剂，包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、口服液、注射液等。

所述甘草包括《中国药典》中收载的甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)、胀果甘草(G.inflata.Bat.)、光果甘草(G.glabra L.)和已在我国存在的黄甘草(G.eurycarpa P.)、粗毛甘草(G.aspera)、云南甘草(G.yunnanesis)、刺果甘草(G.lallidiflora)及圆果甘草(G.sguanulosa)等。

所述细粉化和超微粉化处理，指将甘草切片后，通过机械粉碎设备粉碎成为平均粒径100-150μm的细粉体，再通过气流粉碎设备粉碎成为5-25μm的超微粉体。

所述产木质素降解酶微生物采用革菌科白腐真菌，更优选地，采用采绒革盖菌(Coriolus versicolor，即云芝菌)，出发菌株购自广东省微生物研究所菌种保藏中心(菌株编号：GIM5.178)，由本发明人反复驯化诱导为木质素降解酶系高产菌株后，送武汉中国典型培养物保藏中心保藏(保藏编号CCTCC NO.M207024)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名为云芝ODK-CY₁(Polystictus versicolor ODK-CY₁)；粗酶液制备过程：云芝菌株接种于PDA斜面培养基恢复培养(复壮)7天，转种于装有300mlPDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，28℃，150r/min恒温振荡培养5天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L液体PDA培养基的不锈钢气升式发酵罐中，30℃，100r/min好氧深层液体培养；约12d测多酚过氧化物酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏备用。

所述产纤维素降解酶微生物采用木霉属丝状真菌，更优选地，本发明采用绿色木霉(Trichoderma viride)，出发菌株购自中国科学院普通微生物中心(菌株编号：3.3711)，由本发明人反复驯化诱导为纤维素降解酶系高产菌株后，送中国典型培养物保藏中心保藏(保藏编号CCTCC NO.M207025)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名为绿色木霉ODK-TL₁(Trichodermaviride ODK-TL₁)；粗酶液制备过程：绿色木霉菌株接种于PDA斜面培养基恢复培养(复壮)5天，转种于装有300mlPDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，32℃，120r/min恒温振荡培养3天，再以5％的接种量，将此菌种培养液转种至装有6L液体PDA培养基的气升式发酵罐中，35℃，100r/min好氧深层液体培养；约4d测滤纸酶活(FPA)达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏备用。

所述酶解反应，指以1∶4的料液比，在反应釜中充分混合甘草超微粉体和上述两种粗酶液，每6h一次间歇搅拌，进行共酶解反应；以单位质量溶出甘草酸含量为评价指标，通过正交试验，优化出两种粗酶液共酶解甘草的最佳条件为：云芝酶液∶绿色木霉酶液按质量比计比例为1∶1，温度30℃，酶解反应周期48h。

所述发酵原液的获得，指将完成酶解反应的甘草物料与蒸馏水以料水比1∶10(w/v)的比例混合后，加热至100℃，煎提120min；以60目、100目、200目、300目、500目、800目筛分级过滤，收集滤液，将滤渣再次煎提60min，合并滤液，减压浓缩至原体积的1/3，成为发酵原液。

所述滤渣的处理，指将煎提和分级过滤后留下的不溶物(滤泥)，干燥后用70％乙醇按料液比1∶10混匀，回流浸提3次，每次30min，合并浸提液，低速分离(2500r/min)出可溶性的上清和不溶性的沉淀，分别蒸发干燥，前者主要为木质素超微粉体，后者主要为纤维素超微粉体，两者均用作生物基原料。

所述厌氧液体深层发酵，指用本发明人自行分离驯化的嗜甘草植物乳杆菌(菌种保藏号CCTCC NO.M207026)，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2007年3月23日，分类命名为植物乳杆菌ODK-LR₁(Lactobacillusplantarum ODK-LR₁)；先在种子罐中增菌培养，生物量达到10¹¹cfu/ml后，以1％的接种量转入发酵罐中，对上述甘草原液进行厌氧液体深层发酵；通过正交试验，优化出中试水平的最佳发酵条件为：温度35℃，pH6.0，搅拌速度100r/min，间歇搅拌5min/2h，发酵周期72h。

所述甘草酸萃取，指发酵终止并去除菌体后，发酵物加4倍量80％乙醇加热溶解，1/40活性炭回流脱色30min，冷却，过滤，水洗3次后浓缩滤液，60℃以下蒸发干燥，得甘草酸粗品；将粗品溶于热水，调pH6.0-6.5，过硅胶柱层析，将洗脱液减压蒸干后，用75％乙醇重结晶，得甘草酸纯品。发酵物中未被乙醇溶解的部分，可继续用于提取甘草的其它生理活性成分。

所述制剂制备，指用制剂学上通用的方法，将甘草酸粗品和/或纯品，制成各种剂型，包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、口服液、注射液等。

本发明方法还可应用于其它根茎类中药，诸如黄芪、川芎、五加皮、升麻、天麻、括楼根、白术、柴胡、桔梗、地黄、接骨木、黄柏、远志、龙胆草、党参、桂枝、当归、人参等。

本发明的有益效果在于：

1.本发明与传统工艺相比，甘草酸提取的得率有数倍以上的增加，不仅明显提高了甘草的药用价值，也相对节约了紧缺的甘草资源；

2.本发明技术方案以生物法酶解反应和微生物发酵为核心工艺，大部分工作单元在常温、常压下进行，较传统工艺明显减少了能耗；

3.与传统工艺相比，本发明最突出的优点之一是摈弃了应用强酸、强碱和有机溶剂做为主要提取方法的工艺，而用温和的微生物酶法取代，不仅基本消除了强酸、强碱、有害溶剂废水排放造成的环境污染，减少相关设备和试剂成本，而且基本杜绝了强烈化学反应导致目的产物的质量问题以及产品中化学溶剂残留带来的潜在健康威胁。

4.与传统工艺相比，本发明的另一突出优点是通过酶分解的高选择性和发酵法的高生物量特性，可得到一系列附加值高的副产物，通过资源综合利用提高了经济效益，有较高价值的副产物包括：1)通过酶解-醇提过程从甘草中获得高纯度木质素和纤维素；2)通过发酵-离心过程从发酵液中获得高生物量有益微生物菌体；3)经过本工艺路线充分处理的萃取残液，仍可用于继续提取甘草的其它含量少但生理活性显著的有效物质，如黄酮类、多糖类、醇类等化学成分。

5.甘草经本工艺路线处理的过程产物，可根据纯度不同(即甘草酸的含量水平不同)，分成等级，用于不同产业领域，以扩大市场范围。即：①制备发酵原液所余滤渣(去除木质素和纤维素后)以及未经萃取的发酵物，可直接制备饲料级中间体原料或产品；②发酵后经初步萃取和脱色的甘草酸粗品，可用于制备食品级中间体原料或产品；③经过柱层析纯化所得甘草酸纯品用于制备医药级中间体原料或产品。

6.由于本工艺路线涉及的溶剂只有水和乙醇，热源为蒸汽，原料和相应的工具微生物均无毒无害，故溶剂和热源易于处理回收，循环利用，进一步节约了成本，最后的少量药渣亦可加工成生物饲料或有机肥料，可基本做到“三废”的零排放，具有显著的生态效益。

附图说明

图1显示了木质素酶系和纤维素酶系共酶解甘草对甘草酸溶出量的增加效果；

图2显示了植物乳杆菌发酵甘草对甘草酸溶出量的增加效果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的一种甘草中主要化学成分的生物提取方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了验证本发明技术路线的有效性，发明人进行了如下工作：

1.考察了工艺中物理破碎处理对甘草主要化学成分得率的影响常规获得甘草主要化学成分的方法是甘草饮片煎煮提取，更标准的传统方法为索氏提取法，认为甘草饮片经索氏提取，甘草酸提取率可达100％。

本发明根据上述观点所得实验结果见表1：

表1 甘草饮片不同煎煮时间及索氏提取甘草酸溶出量

表1可以看出，用煎煮法从甘草饮片中提取甘草甜素得率不佳，最高只有22.44mg.g^-1，用索氏提取法，甘草饮片的甘草酸溶出率为100％，也只有25.27mg.g^-1，远低于资料显示的甘草根茎中所含甘草酸最高可达干重14％的实际含量，表明传统提取方法效果较差，有改进必要。本发明人认为，甘草酸得率不佳的主要原因系甘草根茎组织对甘草酸溶出的结构阻隔作用，因此本发明人首先采用机械粉碎+气流粉碎的方法部分消除此种结构阻隔作用。处理结果见表2：

表2 甘草机械粉碎(细粉体)和气流粉碎(超微粉体)后甘草酸溶出量

表2可以看出，以同样的煎煮时间和次数，甘草机械粉碎后的细粉体和气流粉碎后的超微粉体甘草酸的溶出量有较大幅度的渐次增加，表明甘草的物理破碎处理有助于解除对甘草酸溶出的结构阻隔作用。

2.考察了工艺中增加酶解过程对甘草主要化学成分得率的影响在物理破碎的基础上，本发明人采用木质素降解酶系和纤维素降解酶系的粗酶液，对甘草超微粉体进行共酶解反应，以期进一步解除甘草组织的结构阻隔作用。酶解前后水提处理结果见表3：

表3 木质素酶和纤维素酶共酶解反应前后甘草酸溶出量的比较

表3结果可见，酶解后水提物中的甘草酸溶出量(干燥后测定结果)较酶解前有显著提高，表明共酶解反应可在超微粉碎基础上，通过水解作用深入破坏木质纤维素网络架构，进一步解除甘草组织的结构阻隔作用，增加甘草酸的溶出量。

3.考察了工艺中增加发酵过程对甘草主要化学成分得率的影响以共酶解后的浓缩甘草水提液为发酵原液，用嗜甘草乳杆菌对甘草成分进行发酵，通过微生物酶的生化反应进一步解离与甘草酸化学结合的其它成分。发酵前后样品的甘草酸测定结果见表4：

表4 甘草发酵原液和乳杆菌发酵液中甘草酸含量和溶出率比较

表4结果可见，发酵后发酵液中的甘草酸含量以及发酵物的甘草酸溶出量(干燥后测定结果)均较发酵前的发酵原液明显增加，表明酶解-水提后的发酵过程通过微生物酶的生物化学活动进一步解离了与甘草酸结合的其它成分，使得甘草酸的溶出量继续显著提高。

4.考察了工艺中增加纯化过程对甘草酸纯度的影响

在前述工艺路线基础上，用热乙醇萃取得到甘草酸粗品，再经柱层析-重结晶得到甘草酸纯品。为了评价纯化过程的有效性和纯化产品的质量，以甘草酸标准品(购自中国国家药品生物制品检定所)为纯度标准，用高效液相色谱法(HPLC)检验本发明技术方案获得甘草酸的纯度。结果见表5：

表5 甘草酸粗品样本及纯品样本HPLC纯度测定结果

表5结果可见，发酵后萃取的甘草酸粗品与标准品相比，纯度为标准品的76.32％，经柱层析-重结晶纯化，则提高到99.07％，表明纯化过程大大提高了甘草酸的纯度，优化了质量，使本工艺所获产品适合于用作中间体原料和制剂制备。

实施例1：甘草酸中间体原料的制备

目的：获得饲料级、食品级、药品级中间体原料。

共性技术路线：甘草洗净、除杂、烘干、切片，机械粉碎至平均粒度100～150μm，再气流粉碎至平均粒度5～25μm；反应釜内与木质素降解酶系和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应，纯水煎提，滤液分级过滤并浓缩为发酵原液；乳杆菌对发酵原液进行厌氧液体深层发酵，终止发酵后分离菌体并灭酶，发酵产物经热乙醇萃取、活性炭脱色并过滤得甘草酸粗品，硅胶柱层析、乙醇重结晶得甘草酸纯品。

产品制备工艺：将上述所得剔除木质素、纤维素的发酵原液滤渣和去除菌体的发酵液合并，减压浓缩后烘箱内干燥，得粉末状(超微粉体)产品，是为饲料级甘草酸中间体原料，甘草酸纯度不低于50％，密封包装待用。

将上述所得甘草发酵液去菌灭酶后，热乙醇萃取，萃取物活性炭脱色、过滤后真空浓缩，喷雾干燥，得粉末状产品，是为食品级甘草酸中间体原料，甘草酸纯度不低于75％，密封包装待用。

将上述所得甘草酸萃取物进一步过柱层析，洗脱液蒸干后乙醇重结晶，真空冷冻干燥，得粉末状产品，是为药品级甘草酸中间体原料，甘草酸纯度不低于95％，密封包装待用。

实施例2：甘草酸口服胶囊制备

目的：获得甘草酸口服制剂。

共性技术路线：甘草饮片净化后，机械粉碎至平均粒度100～150μm，再气流粉碎至平均粒度5～25μm，与木质素降解酶系和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应48h，纯水煎提，滤液分级过滤并浓缩为发酵原液，乳杆菌对甘草发酵原液进行厌氧液体深层发酵，终止发酵后分离菌体并灭酶，发酵物热乙醇萃取、活性炭脱色并过滤得甘草酸粗品，硅胶柱层析、乙醇重结晶得甘草酸纯品。

产品制备工艺：将上述技术路线所得甘草酸粗品或纯品进行喷雾干燥或真空冷冻干燥，得淡黄色疏松粉末状产品，无菌环境下与辅料β-环糊精以4；1的比例混合，充分混匀，80％的乙醇为润湿剂，沸腾干燥制粒，平均粒径控制在50～100μm，自动灌装硬胶囊，泡眼薄膜铝塑板包装，辐照灭菌后加外包装。

实施例3：甘草酸单铵盐注射液制备

目的：获得甘草酸注射用制剂。

共性技术路线：甘草饮片净化后，机械粉碎至平均粒度100～150μm，再气流粉碎至平均粒度5～25μm，与木质素降解酶系和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应48h，纯水煎提，滤液分级过滤并浓缩为发酵原液，乳杆菌对甘草发酵原液进行厌氧液体深层发酵，终止发酵后分离菌体并灭酶，发酵物热乙醇萃取、活性炭回流脱色并过滤得甘草酸粗品滤液。

产品制备工艺：将上述技术路线所得甘草酸粗品滤液用氨水调pH7～7.5，静置沉淀，少量酒精洗涤后室温干燥得甘草酸三铵盐，用等量冰醋酸重结晶2次，再用4倍量80％乙醇加热溶解，活性炭再次脱色，过滤除菌，真空冷冻干燥得白色结晶，是为甘草酸单铵盐，注射用水或葡萄糖注射液溶解至一定浓度，加适量稳定剂后分装密封。

实施例4：甘草酸生物转化为甘草次酸

目的：体外获得甘草酸的药理活性成分甘草次酸。

共性技术路线：甘草饮片净化后，机械粉碎至平均粒度100～150μm，再气流粉碎至平均粒度5～25μm，与木质素降解酶系和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应48h，纯水煎提，滤液分级过滤并浓缩为发酵原液，乳杆菌对甘草发酵原液进行厌氧液体深层发酵，终止发酵后离心去除乳杆菌菌体。

产品制备工艺：将上述技术路线所得去菌体发酵液加热灭酶后，按2％接种量接种本发明人驯化而得的甘草酸真杆菌(出发菌株编号：ATCC NO.25540)，继续进行厌氧液体深层发酵，发酵条件：pH5.0-6.0，温度30-35℃，周期80-96h。发酵菌株大量产生的葡萄糖醛酸苷酶将发酵液中的甘草酸生物转化为其甙元甘草次酸。终止发酵后，按前述方法萃取甘草次酸粗品和纯品。

实施例5：甘草药学成分甘草黄酮的提取

目的：获得甘草中甘草酸以外的另一药学成分甘草黄酮。

共性技术路线：甘草饮片净化后，机械粉碎至平均粒度100～150μm，再气流粉碎至平均粒度5～25μm，与木质素降解酶系和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应48h，纯水煎提，滤液分级过滤并浓缩为发酵原液，乳杆菌对甘草发酵原液进行厌氧液体深层发酵，终止发酵后离心去除乳杆菌菌体，热乙醇萃取甘草酸。

产品制备工艺：将上述经热乙醇萃取完甘草酸后的发酵残液，热水溶解后用乙酸乙酯继续萃取，取水层，正丁醇再次萃取，浓缩、干燥得浅棕色固体，是为甘草总黄酮。进一步聚酰胺柱层析，乙醇-水系统梯度洗脱，可收集到三个流分：流分1用硅胶柱中压层析，氯仿＝甲醇系统梯度洗脱，分离得到甘草苷和异芒柄花苷；流分2先用SephadexLH-20柱层析，再制备薄层层析(氯仿∶甲醇＝8∶2)，分离得到异甘草苷；流分3先后经硅胶夹板层析、低压聚酰胺柱层析和制备薄层层析，可分离得到新异甘草苷和甘草素。

实施例6：木质素中间体原料的制备

目的：获得高纯度木质素中间体原料产品。

共性技术路线：甘草洗净、除杂、烘干、切片，机械粉碎至平均粒度100～150μm，再气流粉碎至平均粒度5～25μm；反应釜内与木质素降解酶系和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应，纯水煎提，滤液分级过滤并浓缩为发酵原液，收集分级过滤后的所有滤渣。

产品制备工艺：将上述技术路线所得滤渣，用80％乙醇按料液比＝1∶10的比例充分混匀浸提，低速分离(2500r/min)出可溶性上清和不溶性沉淀，收集可溶性上清，乙醇回流浸提，共3次，每次30min，合并浸提液，抽滤、蒸馏回收乙醇，浓缩液的pH调至4.0充分沉淀，将沉淀彻底干燥，得木质素产品，其中木质素含量不低于90％，占甘草干重不低于20％，密封包装待用。

实施例7：纤维素中间体原料的制备

目的：获得高纯度纤维素中间体原料产品。

共性技术路线：甘草洗净、除杂、烘干、切片，机械粉碎至平均粒度100～150μm，再气流粉碎至平均粒度5～25μm；反应釜内与木质素降解酶系和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应，纯水煎提，滤液分级过滤并浓缩为发酵原液，收集分级过滤后的所有滤渣，用80％乙醇按料液比＝1∶10的比例充分混匀浸提，低速分离(2500r/min)出可溶性上清和不溶性沉淀，收集沉淀，乙醇回流浸提，共3次，每次30min，收集不溶性沉淀。

产品制备工艺：将上述技术路线所得不溶性沉淀物，用18％的氢氧化钠溶液按料液比＝1∶20的比例混合，加热至120℃，搅拌45min，水洗3次后充分干燥，得纤维素产品，其中纤维素含量不低于90％，占甘草干重不低于35％，密封包装待用。

本发明的实施例是为了更好地理解本发明进行的详细的描述，并不是对本发明所保护的范围的限定，本发明的保护范围以本发明权利要求限定为准。因此，本领域普通技术人员不脱离本发明的主旨未经创造性劳动而对本明所做的改变在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种甘草酸的生物提取方法，其特征在于包括以下步骤：

将甘草经细粉化和超微粉化处理；

用来自微生物的木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液与处理后的甘草进行共酶解反应；所述木质素降解酶系粗酶液来自保藏编号为CCTCCNO.M207024的云芝(Polystictus versicolor)ODK-CY₁，制备过程为：云芝ODK-CY₁接种于PDA斜面培养基恢复培养7天，转种于装有300ml PDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，28℃、150r/min恒温振荡培养5天，再以5％的接种量将此菌种培养液转种至装有6L液体PDA培养基的不锈钢气升式发酵罐中，30℃、100r/min好氧深层液体培养，测多酚过氧化物酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏备用；所述纤维素降解酶系粗酶液来自保藏编号为CCTCC NO.M207025的绿色木霉(Trichoderma viride)ODK-TL₁，制备过程为：绿色木霉ODK-TL₁接种于PDA斜面培养基恢复培养5天，转种于装有300ml PDA液体培养基的500ml三角烧瓶中，32℃、120r/min恒温振荡培养3天，再以5％的接种量将此菌种培养液转种至装有6L液体PDA培养基的气升式发酵罐中，35℃、100r/min好氧深层液体培养，测滤纸酶活达到高峰时，终止发酵，用管式菌体离心机去除菌体，取其上清液为粗酶液，密封低温保藏备用；所述共酶解反应中指以1∶4的料液比，在反应釜中充分混合甘草超微粉体和上述两种粗酶液，每6h一次间歇搅拌，进行共酶解反应，其中木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液的比例为1∶1，温度为30℃，酶解反应周期为48h；

酶解反应后通过煎提、分级过滤，得到富含有效成分的滤液和主要含无关成分的滤渣；

滤渣处理，分离成副产品木质素和纤维素，将滤液减压浓缩为发酵原液；

将所述发酵原液接种保藏编号为CCTCC NO.M207026的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ODK-LR₁进行厌氧液体深层发酵；

终止发酵后先离心去除菌体，再从发酵物中萃取出甘草酸粗品，进一步用吸附和重结晶方法对其进行纯化得到甘草酸纯品。

2.根据权利要求1所述的一种甘草酸的生物提取方法，其特征在于：还包括利用制剂学通用方法将所述甘草酸粗品和/或甘草酸纯品制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、口服液或注射液。

3.根据权利要求1或2所述的一种甘草酸的生物提取方法，其特征在于：所述甘草选自胀果甘草、光果甘草、黄甘草、粗毛甘草、云南甘草、刺果甘草和圆果甘草中的一种或多种。

4.根据权利要求1或2所述的一种甘草酸的生物提取方法，其特征在于：所述细粉化和超微粉化处理指将甘草切片后，通过机械粉碎设备粉碎成为平均粒径100-150μm的细粉体，再通过气流粉碎设备粉碎成为5-25μm的超微粉体。

5.根据权利要求1或2所述的一种甘草酸的生物提取方法，其特征在于：所述发酵原液的获得指将完成酶解反应的甘草物料与蒸馏水以料水比1∶10w/v的比例混合后，加热至100℃，煎提120min；以60目、100目、200目、300目、500目、800目筛分级过滤，收集滤液，将滤渣再次煎提60min，合并滤液，减压浓缩至原体积的1/3，成为发酵原液。

6.根据权利要求1或2所述的一种甘草酸的生物提取方法，其特征在于：所述滤渣处理指将煎提和分级过滤后留下的不溶物干燥后用70％乙醇按料液比1∶10混匀，回流浸提3次，每次30min，合并浸提液，低速分离出可溶性的上清和不溶性的沉淀，分别蒸发干燥，前者主要为木质素超微粉体，后者主要为纤维素超微粉体。

7.根据权利要求1或2所述的一种甘草酸的生物提取方法，其特征在于：所述厌氧液体深层发酵指植物乳杆菌ODK-LR₁先在种子罐中增菌培养，生物量达到10¹¹cfu/ml后，以1％的接种量转入发酵罐中，对甘草发酵原液进行厌氧液体深层发酵；发酵条件为：温度35℃，pH6.0，搅拌速度100r/min，间歇搅拌5min/2h，发酵周期72h。

8.根据权利要求1或2所述的一种甘草酸的生物提取方法，其特征在于：所述甘草酸萃取指发酵终止并去除菌体后，发酵物加4倍量80％乙醇加热溶解，1/40活性炭回流脱色30min，冷却，过滤，水洗3次后浓缩滤液，60℃以下蒸发干燥，得甘草酸粗品；将粗品溶于热水，调pH6.0-6.5，过硅胶柱层析，将洗脱液减压蒸干后，用75％乙醇重结晶，得甘草酸纯品。