CN114230629B - 一种18-α甘草次酸的制备方法 - Google Patents

一种18-α甘草次酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种18‑α甘草次酸的制备方法，以甘草饮片为原料，先利用复合酶酶解处理，然后煎煮，浓缩，得到富含甘草酸的甘草浓缩液，再在高产葡萄糖醛酸酶酶系的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的培养产物的催化作用下，使得甘草浓缩液中的甘草酸不断转化为18‑β甘草次酸，得到反应液；将高产甘草次酸异构酶酶系的米根霉菌株的培养产物与过氧化氢酶复合制成米根霉菌丝体‑过氧化氢酶共固定化细胞催化剂，在其催化作用下，上述反应液反应生成18‑α甘草次酸粗品，纯化，即得。本申请在保留了甘草次酸护肝疗效的前提下，去除了18‑β甘草次酸长期应用的副作用，使之更安全有效地用于各类肝病的临床治疗目的，大大提高了临床用药的安全性。

Description

一种18-α甘草次酸的制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种18-α甘草次酸的制备方法。
背景技术
甘草是一种食药两用植物，目前作为调味剂、增稠剂、辅助剂、添加剂、防腐剂、抗氧化剂等，被广泛用于食品、饲料、化妆品和日用化工品等产业，但其最重要的用途是在医药领域。
中医药有“十方九草”之说，即大部分中药复方的配伍都离不开甘草，被誉为中药的“国佬”；甘草的主要化学成分甘草酸及其活性成分甘草次酸，更是被大量用于中成药和现代中药中。特别指出的是，近年来与肝病治疗相关的中药复方和提取物中，甘草制剂及其提取物、纯化物的制成品，作为广谱护肝的主流药物之一，已被广泛用于各类肝病(病毒性肝炎、酒精性和非酒精性脂肪肝、自身免疫性肝炎、中毒性肝病、肝硬化和肝癌等)的临床治疗，产生了巨大的社会效益和经济效益。
遗憾的是，目前甘草各类制剂中的主要护肝有效物质-甘草酸(五环三萜类苷)的活性药学成分——18-β甘草次酸(苷元)，虽然具有显著和稳定的护肝疗效，但如果长期应用，则会引起高血压、低血钾、钠水潴留等副作用(统称为促肾上腺皮质激素【ACTH】生物活性)，甚至可导致心衰等严重状况，危及生命，从而限制了其在慢性肝病的临床应用。进一步药学研究发现，此类副作用主要源于甘草制剂中的护肝药学活性成分——18-β甘草次酸(图2)，而甘草次酸的α-非对映异构体——即18-α甘草次酸(图1)，则无此类ACTH样生物活性，故其能在完整保留甘草次酸护肝效果的同时，几乎不出现18-β甘草次酸的副作用，安全性大大提高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种18-α甘草次酸的制备方法，从而大大提高了临床用药的安全性。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种18-α甘草次酸的制备方法，具体步骤如下：
(1)先以甘草饮片为原料，利用复合酶酶解处理，煎煮，浓缩，得到富含甘草酸的甘草浓缩液，再在高产葡萄糖醛酸酶酶系的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的培养产物的催化作用下，使得甘草浓缩液中的甘草酸不断转化为18-β甘草次酸，收集转化反应后的反应液；
(2)然后将高产甘草次酸异构酶酶系的米根霉菌株的培养产物与过氧化氢酶复合制成米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂，在此催化剂的催化作用下，步骤(1)所得的反应液不断反应生成18-α甘草次酸粗品，纯化，即得18-α甘草次酸纯品。
优选的，步骤(1)中，以重量份计，复合酶包含：纤维素酶2份，木质素酶2份，果胶酶1份。
优选的，步骤(1)中，以重量份计，甘草浓缩液的制备方法如下：先将0.025份复合酶溶于8份去离子水中，得到复合酶液；然后将1份甘草饮片粉碎成200目的甘草超细粉，再将此甘草超细粉加入复合酶液中，搅拌混匀，室温酶解4小时，接着再加入16份去离子水，加热至沸腾，保温煎煮2小时，过滤除渣，取滤液，浓缩成1/3滤液体积的甘草浓缩液。
优选的，步骤(1)中，反应液的制备方法如下：
(A)将高产葡萄糖醛酸酶酶系的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株培养制成菌体细胞悬液，接着将菌体细胞悬液与海藻酸钠溶液混合制成混合液，然后将混合液滴入氯化钙溶液中，静置，过滤，洗净，利用戊二醛交联，得到珠体；
(B)将珠体装入流化反应器的柱床内封好，再将步骤(1)所得甘草浓缩液连续注入流化反应器，在珠体的催化作用下，甘草浓缩液中的甘草酸不断转化为18-β甘草次酸，收集转化反应后的反应液。
进一步优选的，步骤(A)中，所述的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株为：保藏号：CCTCCNO.M207055，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国，武汉，武汉大学；保藏起始时间：2007年3月23日；菌株编号：ODK-BN1。
进一步优选的，步骤(A)的具体方法如下：先将枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株复壮，在种子罐中增菌，待该菌种的菌体生物量增至1011cfu/L时，按占发酵培养液总容积5％的接种量，将该菌种液接入发酵罐培养液中行高密度培养，直至发酵罐中的菌体生物量也达到1011cfu/L时，终止发酵；收集发酵液，4000r/min离心，弃去上清液，收集含水量(质量)为70～80％的菌泥，用生理盐水稀释成质量百分比为10～40％的菌体细胞悬液，在40℃条件下，将该菌体细胞悬液与质量浓度为3～4％的海藻酸钠溶液，按照质量比1：3缓慢混匀，得到混合液；然后将混合液用多头滴管以18-20滴/min的速度，滴入质量浓度为5～10％的CaCl2溶液中，于5～10℃静置4小时，过滤得凝胶状颗粒，将颗粒用生理盐水洗净后，再用质量浓度0.5％的戊二醛水溶液交联5分钟后，用无菌水洗涤，得到硬化后的直径为1～3mm的珠体。
进一步优选的，步骤(B)的具体方法如下：先将上述所得珠体装入流化反应器的柱床内封好，接着将前述所得甘草浓缩液以0.15m/秒的恒定流速从流化反应器的底部连续注入，在珠体的催化作用下，甘草浓缩液中的甘草酸不断转化为18-β甘草次酸，从流化反应器的顶部收集转化过后的反应液。
优选的，步骤(2)中，米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂的制备方法如下：
(a)先将高产甘草次酸异构酶酶系的米根霉菌株培养制成菌丝体细胞悬液；
(b)将菌丝体细胞悬液预处理后，悬浮于卵清蛋白-过氧化氢酶溶液中，再加入异丙醇溶液和戊二醛溶液，充分混合，摇床培育，收集菌丝体，洗涤，再悬浮于pH5.0的柠檬酸(0.1mol/L)-磷酸盐(0.2mol/L)缓冲液中，得到米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂。
进一步优选的，步骤(a)中，所述的米根霉菌株为：保藏号：CCTCCNO.M207054；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏起始时间：2007年3月23日；菌株编号：ODK-RM1。
进一步优选的，步骤(a)的具体方法如下：先将米根霉菌株复壮后在种子罐中增菌，待其生物量增至1011cfu/L后，按占发酵培养液总容积3％的接种量，将该菌种液接入发酵罐的培养液中行高密度培养，直至发酵罐中的菌体生物量也达到1011cfu/L时，终止发酵；收集发酵液，5000r/min离心，弃去上清液，收集含水量为50～60％的菌丝体细胞悬液。
进一步优选的，步骤(b)的具体方法如下：先将上述菌丝体细胞悬液用去离子水洗涤2～次，再用异丙醇在5℃条件下处理以增加菌丝体细胞的通透性，35℃条件下真空干燥，得到干燥菌丝体；然后将干燥菌丝体通过搅拌，悬浮于过氧化氢酶质量浓度为5％(酶活力大于2500IU)的卵清蛋白溶液中，得到悬浮液，继续加入质量浓度为3％的异丙醇溶液以及质量浓度为25％的戊二醛溶液后，充分混合，并在20℃摇床内培育4小时，过滤，收集处理后的菌丝体，5℃条件下用去离子水洗涤2次，再悬浮于pH＝5.0的柠檬酸(0.1mol/L)-磷酸盐(0.2mol/L)缓冲液中，即得米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂。
优选的，步骤(2)中，将米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂用吸附法固定于列管式反应器内，接着将步骤(1)所得反应液浓缩至原体积的40～50％，在50℃条件下注入列管式反应器，50～60℃温度下反应4小时，在列管式反应器的出口处收集反应产物，过滤取滤液，浓缩得到含18-α甘草次酸的终产物；再将该终产物利用其4倍重量、质量浓度为80％的丙酮水溶液加热溶解，然后利用活性炭回流脱色30分钟，冷却后过滤，取滤液，去离子水洗涤2～3次，60℃蒸发干燥，即得18-α甘草次酸粗品。
优选的，步骤(2)中，纯化的具体方法为：将18-α甘草次酸粗品溶于40～60℃热水中，调节pH＝6～6.5，过硅胶柱层析，收集洗脱液，减压蒸干，用体积浓度为75％的乙醇水溶液进行重结晶，即得18-α甘草次酸纯品。
本发明的有益效果在于：
本发明先以甘草饮片为原料，粉碎后利用复合酶酶解处理，煎煮，浓缩，得到富含甘草酸的甘草浓缩液，再在高产葡萄糖醛酸酶酶系的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的培养产物的催化作用下，使得甘草浓缩液中的甘草酸不断转化为18-β甘草次酸，得到反应液；然后将高产甘草次酸异构酶酶系的米根霉菌株的培养产物与过氧化氢酶复合，制成米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂，接着在该催化剂的催化作用下，上述反应液中的18-β甘草次酸不断反应，生成18-α甘草次酸粗品，经进一步纯化，即得18-α甘草次酸纯品。该方法获得的18-α甘草次酸，在保留了18-β甘草次酸护肝疗效的前提下，去除了该药学成分长期应用时出现的ACTH样生物活性副作用，使之更安全有效地应用于各类肝病的临床治疗目的，大大提高了临床用药的安全性。
本发明所得18-α甘草次酸，可以用制剂学上通用的方法，制成各种制剂剂型，包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、口服液、注射液等，具有非常广阔的临床应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明。
图1为18-α甘草次酸的化学结构式；
图2为18-β甘草次酸的化学结构式；
图3为18-α甘草次酸、18-β甘草次酸标准样品的HPLC谱图，其中，αGA为18-α甘草次酸，βGA为18-β甘草次酸，I.S.为内标，。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例：
一种18-α甘草次酸的制备方法，具体步骤如下：
步骤一：取2kg圆片状甘草饮片，将其进行分级化超微粉碎，即先将甘草饮片用万能粉碎机粉碎成粒度为20目左右的细颗粒，再用真空超微粉碎机进行超微粉碎，过200目筛，得粒度在200目以下的甘草超细粉体，将此粉体加入复合酶液(复合酶液配制：纤维素酶10g：木质素酶10g：果胶酶5g，溶于去离子水8L中)，倾入100L反应釜中，充分搅拌均匀，浸泡4小时，再加入16L水，100℃高温煎煮2小时，降温过滤去渣后，收集富含甘草酸的甘草提取液约60L，浓缩成原液三分之一的甘草浓缩液约20L后备用。
步骤二：高产葡萄糖醛酸酶酶系的固定化细胞制备(包埋法)：应用本发明人自行诱导驯化的高产葡萄糖醛酸酶酶系(酶+辅酶)的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株(菌种保藏号：CCTCC NO.M207055；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏起始时间：2007年3月23日；菌株编号：ODK-BN1)，复壮后先在20L种子罐内增菌，待其生物量增至1011cfu/L后，按占发酵培养液总容积5％的接种量，将该菌种液8L接入200L发酵罐约160L的培养液中行高密度培养(培养条件：pH＝6.5，培养温度35℃，搅拌速度120r/min)，直至发酵罐中的菌体生物量也达到1011cfu/L时，终止发酵；收集发酵液约170L，4000r/min离心，弃去上清液，收集含水量为70％(质量)的全部菌泥，在200L储罐中，用30L生理盐水稀释成质量百分比为30％的菌体细胞悬液，在40℃条件下，将该菌体细胞悬液与质量浓度为3％的海藻酸钠溶液，按照菌体细胞悬液30L：海藻酸钠溶液90L＝1：3的质量比例，缓慢混匀，得到约120L的混合液；然后将该混合液用多头滴管，以18-20滴/min的速度，滴入质量浓度为8％的CaCl2溶液中，于8℃静置4小时，过滤，得凝胶状颗粒，将此类颗粒用生理盐水洗净后，再用质量浓度为0.5％的戊二醛水溶液交联硬化5分钟后，用无菌水洗涤，得到直径为2mm的固化珠体，称湿重约为2.0kg。
步骤三：流化床固定化细胞反应器(FBR)的准备：将上述所得固化后的菌体细胞珠体2.0kg，装入流化反应器(FBR)柱床中，封好，随即将前述所得富含甘草酸的甘草浓缩液以0.15m/秒的恒定流速从FBR的底部连续注入该反应器中，甘草溶液中的甘草酸在柱床中菌细胞携带的葡萄糖醛酸酶系催化下，不断转化为18-β甘草次酸；反应达到平衡后，保持以恒定流速(0.10m/秒)连续注入甘草浓缩液，同时以相同的流速，从反应器顶部输出富含18-β甘草次酸的反应液，最终得该反应液约18L。
步骤四：高产甘草次酸异构酶酶系(酶+辅酶)菌细胞的制备：应用本发明人自行诱导驯化的高产甘草次酸异构酶酶系(酶+辅酶)的米根霉菌株(菌种保藏号：CCTCCNO.M207054；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；保藏起始时间：2007年3月23日；菌株编号：ODK-RM1)，先将该米根霉菌株复壮后，在20L种子罐内增菌，待其生物量增至1011cfu/L后，按占发酵培养液总容积3％的接种量，将该菌种液8L接入200L发酵罐约160L的培养液中，行高密度培养(培养条件：pH＝7.0，培养温度30℃，搅拌速度80r/min)，直至发酵罐中的菌体生物量也达到1011cfu/L时，终止发酵；收集发酵液约160L，5000r/min离心，弃去上清液，收集含水量(质量)为50％的菌丝体细胞湿重约1.8kg。
步骤五：高产甘草次酸异构酶酶系的固定化细胞制备(吸附法)：将上述收集的富含甘草次酸异构酶酶系的米根霉菌丝体细胞用去离子水洗涤2次，再用异丙醇在5℃低温条件下处理以增加其通透性，35℃条件下真空干燥，得干燥菌丝体约0.9kg；搅拌均匀后，将该菌丝体悬浮于20L过氧化氢酶质量浓度为5％(酶活力大于2500IU)的卵清蛋白溶液中(酶活力须大于2500IU)；该悬浮液制成后，再添加质量分数为3％的异丙醇溶液以及质量分数为25％的戊二醛溶液各2％(即各400ml)于悬浮液中，充分混合，并在20℃摇床内培育4h。过滤，收集全部菌丝体，5℃低温条件下用去离子水洗涤2次，再悬浮于pH5.0的柠檬酸(0.1mol/L)-磷酸盐(0.2mol/L)缓冲液中，即得含水量约为60％的米根霉菌丝体/过氧化氢酶共固定化细胞催化剂大约1.2kg。
步骤六：应用列管式填充床固定化细胞反应器制备18-α甘草次酸：将上述米根霉菌丝体/过氧化氢酶共固定化细胞催化剂1.2kg，吸附固定于填充床内的数根管状DEAE-Sephadex上；将前述富含18-β甘草次酸的反应液(底物)18L浓缩至原液的50％浓度约9L后，按设定方向将此浓缩后的反应液从反应器的顶部入口注入列管式反应器，在加热至50℃的条件下，于列管式反应器中反应4小时，在列管式反应器的出口处收集反应产物，过滤，取滤液，得到约8L富含18-α甘草次酸的终产物。
步骤七：将上述终产物加到其4倍重量、质量浓度为80％的丙酮水溶液中，加热溶解，然后利用活性炭回流脱色30分钟，冷却后过滤，取滤液，用去离子水洗涤3次，60℃蒸发干燥，即得18-α甘草次酸粗品约1.6kg。
步骤八：取上述18-α甘草次酸粗品1.0kg，溶于其4倍重量、加热至55℃的去离子热水中，调节其pH至6.5，过硅胶柱进行层析，收集过柱层析纯化后的液体(洗脱液)约3.5L，减压蒸干后，用其4倍重量、体积浓度为75％的乙醇溶液对其进行重结晶，4℃条件下真空干燥48h，得到约0.6kg的18-α甘草次酸纯品(图3为18-α甘草次酸、18-β甘草次酸标准样品的HPLC谱图(电泳条件：25mM，pH＝10.0碳酸盐缓冲液+甲醇+乙二醇，体积比为8：1：1)，经与图3比对，确认本申请为αGA，即18-α甘草次酸。)。
进一步地，将上述制备工艺路线所得的18-α甘草次酸粗品或纯品，用制剂学上通用的方法，可制成各种制剂剂型，包括散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、口服液、注射液等。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (1)

1.一种18-α甘草次酸的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)先以甘草饮片为原料，利用复合酶酶解处理，煎煮，浓缩，得到富含甘草酸的甘草浓缩液，再在高产葡萄糖醛酸酶酶系的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株的培养产物的催化作用下，使得甘草浓缩液中的甘草酸不断转化为18-β甘草次酸，收集转化反应后的反应液；
(2)然后将高产甘草次酸异构酶酶系的米根霉菌株的培养产物与过氧化氢酶复合制成米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂，在此催化剂的催化作用下，步骤(1)所得的反应液不断反应生成18-α甘草次酸粗品，纯化，即得18-α甘草次酸纯品；
步骤(1)中，以重量份计，复合酶包含：纤维素酶2份，木质素酶2份，果胶酶1份；
步骤(1)中，以重量份计，甘草浓缩液的制备方法如下：先将0.025份复合酶溶于8份去离子水中，得到复合酶液；然后将1份甘草饮片粉碎成200目的甘草超细粉，再将此甘草超细粉加入复合酶液中，搅拌混匀，室温酶解4小时，接着再加入16份去离子水，加热至沸腾，保温煎煮2小时，过滤除渣，取滤液，浓缩成1/3滤液体积的甘草浓缩液；
步骤(1)中，反应液的制备方法如下：
(A)将高产葡萄糖醛酸酶酶系的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株培养制成菌体细胞悬液，接着将菌体细胞悬液与海藻酸钠溶液混合制成混合液，然后将混合液滴入氯化钙溶液中，静置，过滤，洗净，利用戊二醛交联，得到珠体；
(B)将珠体装入流化反应器的柱床内封好，再将步骤(1)所得甘草浓缩液连续注入流化反应器，在珠体的催化作用下，甘草浓缩液中的甘草酸不断转化为18-β甘草次酸，收集转化反应后的反应液；
步骤(A)中，所述的枯草芽孢杆菌纳豆亚种菌株为：保藏号：CCTCCNO.M207055，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国，武汉，武汉大学；保藏起始时间：2007年3月23日；菌株编号：ODK-BN1；
步骤(2)中，米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂的制备方法如下：
(a)先将高产甘草次酸异构酶酶系的米根霉菌株培养制成菌丝体细胞悬液；
(b)将菌丝体细胞悬液预处理后，悬浮于卵清蛋白-过氧化氢酶溶液中，再加入异丙醇溶液和戊二醛溶液，充分混合，摇床培育，收集菌丝体，洗涤，再悬浮于pH5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，得到米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂；
步骤(2)中，将米根霉菌丝体-过氧化氢酶共固定化细胞催化剂用吸附法固定于列管式反应器内，接着将步骤(1)所得反应液浓缩至原体积的40～50％，在50℃条件下注入列管式反应器，50～60℃温度下反应4小时，在列管式反应器的出口处收集反应产物，过滤取滤液，浓缩得到含18-α甘草次酸的终产物；再将该终产物利用其4倍重量、质量浓度为80％的丙酮水溶液加热溶解，然后利用活性炭回流脱色30分钟，冷却后过滤，取滤液，去离子水洗涤2～3次，60℃蒸发干燥，即得18-α甘草次酸粗品；
步骤(2)中，纯化的具体方法为：将18-α甘草次酸粗品溶于40～60℃热水中，调节pH＝6～6.5，过硅胶柱层析，收集洗脱液，减压蒸干，用体积浓度为75％的乙醇水溶液进行重结晶，即得18-α甘草次酸纯品。
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