CN110386860A - 一种大麻二酚的高效提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大麻二酚的高效提取方法，属于植物有效成分提取方法技术领域。为解决现有大麻二酚提取效率低、产品纯度低、收率低的问题，本发明提供了一种大麻二酚的高效提取方法，包括汉麻原料经哈茨木霉发酵→超高压处理→多粘芽孢杆菌发酵→洗涤离心→大孔吸附树脂除杂→硅胶层析柱纯化，最终得到纯度为98％的大麻二酚固体，且未检出四氢大麻酚杂质。本发明从汉麻中提取大麻二酚时，采用真菌固体发酵、超高压处理和芽孢杆菌固体发酵相结合的前处理方法，利用微生物发酵代谢产生的酶系能够破坏汉麻细胞中致密的物理化学结构，超高压处理将汉麻细胞彻底破碎，充分释放大麻二酚，能够显著提高大麻二酚的提取率和汉麻利用率。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分提取方法技术领域，尤其涉及一种大麻二酚的高效提取方法。
背景技术
大麻因含有一种致幻成瘾的次生代谢产物-四氢大麻酚(Tetrahydrocannabinol，THC)而成为公众熟知的毒品原植物之一。为了方便监管和合理使用，国际上将大麻中THC含量＜0.3％的大麻品种定义为不具备毒品利用价值的工业大麻，又名汉麻。
汉麻中非成瘾性成分大麻二酚(Cannabidiol，CBD)具有保护神经、改善记忆力、抗炎、杀菌、镇痛、抗焦虑、抗精神病、抗氧化等作用，具有较高的研究价值。大麻二酚的传统提取途径为溶剂提取，因汉麻植物中大麻素类成分复杂且性质相近，特别是四氢大麻酚与大麻二酚为同分异构体，极性相近分离纯化困难，且溶剂提取过程中使用了大量的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，有机溶剂的使用不仅会污染环境、影响产品的安全性，而且对大麻二酚的提取收率不高。
发明内容
为解决现有大麻二酚提取效率低、产品纯度低、收率低的问题，本发明提供了一种大麻二酚的高效提取方法。
本发明的技术方案：
一种大麻二酚的高效提取方法，包括如下步骤：
步骤一、将汉麻叶和汉麻花干燥后粉碎至40目得到汉麻粉；配制哈茨木霉液体发酵培养基，以一定料液比向所述哈茨木霉液体发酵培养基中加入所述汉麻粉，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤二、哈茨木霉活化后接入液体种子培养基，一定温度下进行种子培养得到哈茨木霉种子液；以一定接种量将哈茨木霉种子液接入步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基，混匀后于一定温度和湿度条件下进行固体培养得到哈茨木霉发酵培养物；将所得哈茨木霉发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min，冷却、充分干燥并粉碎至40目待用；
步骤三、向步骤二所得粉碎后的哈茨木霉发酵培养物中加水制成混悬液，将所述混悬液装入耐压的塑料袋中，密封后放入超高压处理装置的提取容器中；常温下在一定时间内将超高压处理装置内的压强升高至200Mpa并保压一定时间，然后在一定时间内将超高压处理装置内的压强迅速泄为常压；重复升压泄压的操作3次后，将塑料袋从超高压处理装置的提取容器中取出待用；
步骤四、向步骤三所得超高压处理后的物料中添加牛肉膏、蛋白胨和NaCl配制营养肉汤培养基，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤五、多粘芽孢杆菌活化后接入多黏芽孢杆菌液体种子培养基，一定温度、转速下培养得到多粘芽孢杆菌种子液；以一定接种量将多粘芽孢杆菌种子液接入步骤三所得冷却后的营养肉汤培养基，一定温度、湿度条件下进行固体培养得到多粘芽孢杆菌发酵培养物，将所得多粘芽孢杆菌发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min待用；
步骤六、将冷却后的步骤五所得灭过菌多粘芽孢杆菌发酵培养物用乙醇充分洗涤，离心收集上清液，将离心沉淀用乙醇再次充分洗涤，离心收集上清液，合并所得上清液待用；
步骤七、将步骤六所得上清液置于50～70℃下减压蒸馏脱除乙醇溶剂，得到浓缩液以大孔吸附树脂为层析介质在一定吸附温度下完成吸附；用45～55％的乙醇洗脱5个柱体积洗脱大部分极性杂质，再用80～95％的乙醇洗脱3～5个柱体积洗脱大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脱液，50～70℃减压浓缩得到大麻二酚浓缩液，经高效液相色谱分析未发现四氢大麻酚杂质；
步骤八、将步骤七所得大麻二酚浓缩液用硅胶层析柱进行进一步纯化，以石油醚为流动相进行等度洗脱，收集富含大麻二酚的洗脱液，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固体。
进一步的，步骤一所述干燥为80℃干燥10～12h，所述哈茨木霉液体发酵培养基的配方为：马铃薯200g/L，蔗糖10g/L，葡萄糖10g/L，pH6.5；所述汉麻粉与哈茨木霉液体发酵培养基的料液比为1g：1mL。
进一步的，步骤二所述哈茨木霉液体种子培养基配方为：马铃薯200g/L，蔗糖10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，无水乙酸钠2g/L，七水硫酸镁6g/L，pH6.5；所述哈茨木霉种子培养条件为25℃培养48h，所述哈茨木霉种子液的菌丝浓度为200～250g/L；所述哈茨木霉种子液的接入量为步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基体积的10～15％；所述固体培养的温度为28℃，相对湿度为92％，培养时间为5d。
进一步的，步骤三所述哈茨木霉发酵培养物与水的质量体积比为1g：1mL，所述升压时间为15min，所述保压时间为20min，所述泄压时间为10～14s。
进一步的，步骤四所述营养肉汤培养基配方为：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，pH6.5。
进一步的，步骤五所述多黏芽孢杆菌液体种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，pH6.5；所述多粘芽孢杆菌种子培养条件为37℃、转速为220r/min摇床培养24h，所述多粘芽孢杆菌种子液的芽孢率为90％以上；所述多粘芽孢杆菌种子液的菌浓为106～108CFU/mL；所述多粘芽孢杆菌种子液的接入量为步骤三所得冷却后的营养肉汤培养基体积的5～10％；所述固体培养的条件为28℃、相对湿度80％的条件下发酵培养24h。
进一步的，步骤六所述洗涤是用2～3倍体积的95％乙醇充分震荡洗涤，所述离心为转速5000r/min离心20min。
进一步的，步骤七所述大孔吸附树脂为DM-130大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂质量与浓缩液体积之间的料液比为1g:5mL；所述吸附温度为25℃，所述大麻二酚浓缩液中大麻二酚的纯度为60～70％。
进一步的，步骤八中所述硅胶层析柱为200目硅胶层析柱，所述流动相流速为10mL/min，所述大麻二酚固体纯度为99％以上。
进一步的，所述哈茨木霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12165：所述多粘芽孢杆菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC No.10122。
本发明的有益效果：
本发明利用哈茨木霉在发酵过程中产生的以纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶为主的酶系对汉麻细胞壁进行酶解，酶解的过程即是发酵的过程，哈茨木霉会根据发酵体系中纤维素、半纤维素、果胶等物质的量调整相应酶的合成量，在动态发酵过程中彻底将汉麻细胞壁酶解。然后利用超高压处理将剩余的原生质体彻底破碎，充分释放出汉麻细胞内的细胞质和细胞核等物质，能够充分提取汉麻细胞中的大麻二酚。
本发明对破碎的汉麻细胞进行多粘芽孢杆菌的短时发酵，在24h的发酵时间内，利用多粘芽孢杆菌丰富的以蛋白酶为主的酶系将残存在体系中的汉麻细胞的细胞内容物进行进一步降解，尤其是蛋白质、多糖等大分子杂质，既可以将大麻二酚充分释放出来，也可以避免大分子杂质堵塞大孔吸附树脂，减轻吸附树脂的压力，提高提纯效率。
本发明提取方法得到的大麻二酚纯度高，无四氢大麻酚杂质，提取过程中无有机溶剂，不污染环境，能够显著提高大麻二酚的提取率、收率和汉麻利用率，为大麻二酚的进一步研究及将其应用于医药、保健品、化妆品等领域提供基础。
附图说明
图1是实施例10提取所得大麻二酚固体的高效液相色谱分析(HPLC)图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1
一种大麻二酚的高效提取方法，包括如下步骤：
步骤一、将汉麻叶和汉麻花干燥后粉碎至40目得到汉麻粉；配制哈茨木霉液体发酵培养基，以一定料液比向所述哈茨木霉液体发酵培养基中加入所述汉麻粉，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤二、哈茨木霉活化后接入液体种子培养基，一定温度下进行种子培养得到哈茨木霉种子液；以一定接种量将哈茨木霉种子液接入步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基，混匀后于一定温度和湿度条件下进行固体培养得到哈茨木霉发酵培养物；将所得哈茨木霉发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min，冷却、充分干燥并粉碎至40目待用；
步骤三、向步骤二所得粉碎后的哈茨木霉发酵培养物中加水制成混悬液，将所述混悬液装入耐压的塑料袋中，密封后放入超高压处理装置的提取容器中；常温下在一定时间内将超高压处理装置内的压强升高至200Mpa并保压一定时间，然后在一定时间内将超高压处理装置内的压强迅速泄为常压；重复升压泄压的操作3次后，将塑料袋从超高压处理装置的提取容器中取出待用；
步骤四、向步骤三所得超高压处理后的物料中添加牛肉膏、蛋白胨和NaCl配制营养肉汤培养基，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤五、多粘芽孢杆菌活化后接入多黏芽孢杆菌液体种子培养基，一定温度、转速下培养得到多粘芽孢杆菌种子液；以一定接种量将多粘芽孢杆菌种子液接入步骤三所得冷却后的营养肉汤培养基，一定温度、湿度条件下进行固体培养得到多粘芽孢杆菌发酵培养物，将所得多粘芽孢杆菌发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min待用；
步骤六、将冷却后的步骤五所得灭过菌多粘芽孢杆菌发酵培养物用乙醇充分洗涤，离心收集上清液，将离心沉淀用乙醇再次充分洗涤，离心收集上清液，合并所得上清液待用；
步骤七、将步骤六所得上清液置于50～70℃下减压蒸馏脱除乙醇溶剂，得到浓缩液以大孔吸附树脂为层析介质在一定吸附温度下完成吸附；用45～55％的乙醇洗脱5个柱体积洗脱大部分极性杂质，再用80～95％的乙醇洗脱3～5个柱体积洗脱大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脱液，50～70℃减压浓缩得到大麻二酚浓缩液，经高效液相色谱分析未发现四氢大麻酚杂质；
步骤八、将步骤七所得大麻二酚浓缩液用硅胶层析柱进行进一步纯化，以石油醚为流动相进行等度洗脱，收集富含大麻二酚的洗脱液，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固体。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于，本实施例中步骤一如下：
步骤一、将汉麻叶和汉麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到汉麻粉；配制哈茨木霉液体发酵培养基，以料液比为1g：1mL将汉麻粉加入哈茨木霉液体发酵培养基中，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用。
本实施例中哈茨木霉液体发酵培养基的配方为：马铃薯200g/L，蔗糖10g/L，葡萄糖10g/L，pH6.5。
实施例3
本实施例与实施例2的区别仅在于，本实施例中步骤二如下：
将哈茨木霉活化后的斜面培养物接入液体种子培养基，25℃培养48h，得到菌丝浓度为200～250g/L的哈茨木霉种子液；以哈茨木霉种子液接入量为哈茨木霉液体发酵培养基体积的10～15％，将哈茨木霉种子液接入步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基，混匀后于28℃，相对湿度为92％的条件下培养5d，将所得哈茨木霉发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min，冷却、充分干燥并粉碎至40目待用。
本实施例中哈茨木霉液体种子培养基配方为：马铃薯200g/L，蔗糖10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，无水乙酸钠2g/L，七水硫酸镁6g/L，pH6.5。
汉麻叶与汉麻花的细胞壁以纤维素、木质素、果胶和蜡质为主要成分，这些成分所构成的网络形成了细胞壁的基本架构，保护细胞内部结构，维持细胞的正常形态。现有技术在提取大麻二酚时会使用纤维素酶、果胶酶来对细胞壁进行酶解，以破坏细胞壁，提高提取效率。但直接用纤维素酶、果胶酶进行酶解的效果依赖于酶活力、酶解的温度和时间等因素，常常不能彻底的酶解植物的细胞壁。
本实施例利用哈茨木霉在发酵过程中产生的以纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶为主的酶系对汉麻细胞壁进行酶解，酶解的过程即是发酵的过程，哈茨木霉会根据发酵体系中纤维素、半纤维素、果胶等物质的量调整相应酶的合成量，在动态发酵过程中彻底将汉麻细胞壁酶解。
实施例4
本实施例与实施例3的区别仅在于，本实施例中步骤三如下：
向步骤二所得粉碎后的哈茨木霉发酵培养物中加水制成混悬液，将所述混悬液装入耐压的塑料袋中，密封后放入超高压处理装置的提取容器中；常温下在15min内将超高压处理装置内的压强升高至500Mpa，保压20min后在10～14s内将超高压处理装置内的压强迅速泄为常压；重复升压泄压的操作3次后，将塑料袋从超高压处理装置的提取容器中取出待用。
现有技术在提取大麻二酚时，在酶解后直接进行醇提，但大麻二酚作为次生代谢产物主要存在于细胞质内的细胞器中，被原生质膜、细胞器膜以及细胞质内的其他蛋白、多糖等分泌物层层包围，导致大麻二酚提取率低。
本实施例在步骤二将汉麻细胞壁酶解后，利用超高压处理将剩余的原生质体彻底破碎，充分释放出汉麻细胞内的细胞质和细胞核等物质，能够充分提取汉麻细胞中的大麻二酚。
实施例5
本实施例与实施例4的区别仅在于，本实施例中步骤四如下：
以步骤三所得超高压处理后的物料为基础配制营养肉汤培养基，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用。
本实施例中营养肉汤培养基配方为：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，pH6.5。
实施例6
本实施例与实施例5的区别仅在于，本实施例中步骤五如下：
多粘芽孢杆菌活化后的斜面培养物接入MRS培养基，37℃、转速为220r/min摇床培养24h，至芽孢率达到90％以上，得到多粘芽孢杆菌种子液，菌浓为106～108CFU/mL；以多粘芽孢杆菌种子液的接入量为步骤三所得冷却后的营养肉汤培养基体积的5～10％；将多粘芽孢杆菌种子液接入步骤三所得冷却后的营养肉汤培养基，混匀并于28℃、相对湿度80％的条件下发酵培养24h，将所得多粘芽孢杆菌发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min待用。
本实施例多黏芽孢杆菌液体种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，pH6.5；
本实施例在高压处理后对破碎的汉麻细胞进行多粘芽孢杆菌的短时发酵，在24h的发酵时间内，利用多粘芽孢杆菌丰富的以蛋白酶为主的酶系将残存在体系中的汉麻细胞的细胞内容物进行进一步降解，尤其是蛋白质、多糖等大分子杂质，既可以将大麻二酚充分释放出来，也可以避免大分子杂质堵塞大孔吸附树脂，减轻吸附树脂的压力，提高提纯效率。
实施例7
本实施例与实施例6的区别仅在于，本实施例中步骤六如下：
将冷却后的步骤五所得灭过菌多粘芽孢杆菌发酵培养物用2～3倍体积的95％乙醇充分洗涤，离心收集上清液，将离心沉淀用2～3倍体积的95％乙醇再次充分洗涤，离心收集上清液，合并所得上清液待用。
本实施例通过乙醇洗脱使大麻二酚溶解在乙醇中，也可使蛋白等杂质发生变性经离心除去。
实施例8
本实施例与实施例7的区别仅在于，本实施例中步骤七如下：
将步骤六所得上清液置于50～70℃下减压蒸馏脱除乙醇溶剂，得到浓缩液，以大孔吸附树脂DM-130为层析介质，大孔吸附树脂质量与浓缩液体积之间的料液比为1:5，在25℃条件下完成吸附；用45～55％的乙醇洗脱5个柱体积洗脱大部分极性杂质，再用80～95％的乙醇洗脱3～5个柱体积洗脱大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脱液，50～70℃减压浓缩得到大麻二酚浓缩液，经高效液相色谱分析所得大麻二酚浓缩液中大麻二酚含量大于65％，且未发现四氢大麻酚。
实施例9
本实施例与实施例8的区别仅在于，本实施例中步骤八如下：
所得大麻二酚浓缩液用200目硅胶层析柱进行进一步纯化，以石油醚为流动相进行等度洗脱，流动相流速为10mL/min，收集富含大麻二酚的洗脱液，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固体，所得大麻二酚固体纯度为99％以上。
实施例10
本实施例提供了一种大麻二酚的高效提取方法，包括如下步骤：
步骤一、将汉麻叶和汉麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到汉麻粉；配制哈茨木霉液体发酵培养基，以料液比为1g：1mL将汉麻粉加入哈茨木霉液体发酵培养基中，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤二、哈茨木霉活化后接入液体种子培养基，25℃培养48h，得到菌丝浓度为200～250g/L的哈茨木霉种子液；以接种量7mL将哈茨木霉种子液接入50mL步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基，混匀后于28℃，相对湿度为92％的条件下培养5d，将所得哈茨木霉发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min，冷却、充分干燥并粉碎至40目待用；
步骤三、向步骤二所得粉碎后的哈茨木霉发酵培养物中加水制成混悬液，将所述混悬液装入耐压的塑料袋中，密封后放入超高压处理装置的提取容器中；常温下在15min内将超高压处理装置内的压强升高至500Mpa，保压20min后在10～14s内将超高压处理装置内的压强迅速泄为常压；重复升压泄压的操作3次后，将塑料袋从超高压处理装置的提取容器中取出待用；
步骤四、以步骤三所得超高压处理后的物料为基础配制营养肉汤培养基，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤五、多粘芽孢杆菌活化后接入MRS培养基，37℃、转速为220r/min摇床培养24h，至芽孢率达到90％以上，得到多粘芽孢杆菌种子液，菌浓为106～108CFU/mL；以接种量3mL将多粘芽孢杆菌种子液接入50mL步骤三所得冷却后的营养肉汤培养基，混匀并于28℃、相对湿度80％的条件下发酵培养24h，将所得多粘芽孢杆菌发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min待用；
步骤六、将冷却后的步骤五所得灭过菌多粘芽孢杆菌发酵培养物用2～3倍体积的95％乙醇充分洗涤，离心收集上清液，将离心沉淀用2～3倍体积的95％乙醇再次充分洗涤，离心收集上清液，合并所得上清液待用；
步骤七、将步骤六所得上清液置于50～70℃下减压蒸馏脱除乙醇溶剂，得到浓缩液，以大孔吸附树脂DM-130为层析介质，大孔吸附树脂质量与浓缩液体积之间的料液比为1:5，在25℃条件下完成吸附；用45～55％的乙醇洗脱5个柱体积洗脱大部分极性杂质，再用80～95％的乙醇洗脱3～5个柱体积洗脱大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脱液，50～70℃减压浓缩得到大麻二酚浓缩液，经高效液相色谱分析所得大麻二酚浓缩液中大麻二酚含量大于65％，且未发现四氢大麻酚；
步骤八、所得大麻二酚浓缩液用200目硅胶层析柱进行进一步纯化，以石油醚为流动相进行等度洗脱，流动相流速为10mL/min，收集富含大麻二酚的洗脱液，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固体，经高效液相色谱检测所得大麻二酚固体纯度为99.8％，收率为1.26％；高效液相检测图谱如图1所示，无四氢大麻酚杂质。
本实施例使用的高效液相色谱条件如下：
C18反相柱：4.6×150mm 5μm 柱温：40℃
检测波长：220nm 洗脱方式：等度洗脱
流速：1ml/min
进样量：20μL
流动相：甲醇:0.1％甲酸＝80:20。
对比例1
本对比例提供了一种仅做哈茨木霉处理的大麻二酚的高效提取方法，包括如下步骤：
步骤一、将汉麻叶和汉麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到汉麻粉；配制哈茨木霉液体发酵培养基，以料液比为1g：1mL将汉麻粉加入哈茨木霉液体发酵培养基中，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤二、哈茨木霉活化后接入液体种子培养基，25℃培养48h，得到菌丝浓度为200～250g/L的哈茨木霉种子液；以接种量7mL将哈茨木霉种子液接入50mL步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基，混匀后于28℃，相对湿度为92％的条件下培养5d，将所得哈茨木霉发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min，待用；
步骤三、将步骤二所得哈茨木霉发酵培养物用2～3倍体积的95％乙醇充分洗涤，离心收集上清液，将离心沉淀用2～3倍体积的95％乙醇再次充分洗涤，离心收集上清液，合并所得上清液待用；
步骤四、将步骤三所得上清液置于50～70℃下减压蒸馏脱除乙醇溶剂，得到浓缩液，以大孔吸附树脂DM-130为层析介质，大孔吸附树脂质量与浓缩液体积之间的料液比为1:5，在25℃条件下完成吸附；用45～55％的乙醇洗脱5个柱体积洗脱大部分极性杂质，再用80～95％的乙醇洗脱3～5个柱体积洗脱大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脱液，50～70℃减压浓缩得到大麻二酚浓缩液，经高效液相色谱分析所得大麻二酚浓缩液中大麻二酚含量大于65％，且未发现四氢大麻酚；
步骤五、所得大麻二酚浓缩液用200目硅胶层析柱进行进一步纯化，以石油醚为流动相进行等度洗脱，流动相流速为10mL/min，收集富含大麻二酚的洗脱液，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固体，经高效液相色谱检测所得大麻二酚固体纯度为99.3％，收率为0.67％。
对比例1的大麻二酚收率仅为0.67％，约为实施例10大麻二酚收率的50％，这充分说明利用超高压处理和多粘芽孢杆菌处理可以将汉麻细胞中的大麻二酚充分释放，提高其收率。
对比例2
本对比例提供了一种仅做哈茨木霉和超高压处理的大麻二酚的高效提取方法，包括如下步骤：
步骤一、将汉麻叶和汉麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到汉麻粉；配制哈茨木霉液体发酵培养基，以料液比为1g：1mL将汉麻粉加入哈茨木霉液体发酵培养基中，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤二、哈茨木霉活化后接入液体种子培养基，25℃培养48h，得到菌丝浓度为200～250g/L的哈茨木霉种子液；以接种量7mL将哈茨木霉种子液接入50mL步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基，混匀后于28℃，相对湿度为92％的条件下培养5d，将所得哈茨木霉发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min，冷却、充分干燥并粉碎至40目待用；
步骤三、向步骤二所得粉碎后的哈茨木霉发酵培养物中加水制成混悬液，将所述混悬液装入耐压的塑料袋中，密封后放入超高压处理装置的提取容器中；常温下在15min内将超高压处理装置内的压强升高至500Mpa，保压20min后在10～14s内将超高压处理装置内的压强迅速泄为常压；重复升压泄压的操作3次后，将塑料袋从超高压处理装置的提取容器中取出待用；
步骤四、将超高压处理液用1～2倍体积的95％乙醇充分洗涤，离心收集上清液，将离心沉淀用1～2倍体积的95％乙醇再次充分洗涤，离心收集上清液，合并所得上清液待用；
步骤五、将步骤四所得上清液置于50～70℃下减压蒸馏脱除乙醇溶剂，得到浓缩液，以大孔吸附树脂DM-130为层析介质，大孔吸附树脂质量与浓缩液体积之间的料液比为1:5，在25℃条件下完成吸附；用45～55％的乙醇洗脱5个柱体积洗脱大部分极性杂质，再用80～95％的乙醇洗脱3～5个柱体积洗脱大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脱液，50～70℃减压浓缩得到大麻二酚浓缩液，经高效液相色谱分析所得大麻二酚浓缩液中大麻二酚含量大于65％，且未发现四氢大麻酚；
步骤六、所得大麻二酚浓缩液用200目硅胶层析柱进行进一步纯化，以石油醚为流动相进行等度洗脱，流动相流速为10mL/min，收集富含大麻二酚的洗脱液，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固体，经高效液相色谱检测所得大麻二酚固体纯度为99.5％，收率为1.10％。
对比例2的大麻二酚收率为1.10％，约为实施例10大麻二酚收率的87％，而比对比例1仅用哈茨木霉处理的大麻二酚收率提高了64％，这充分说明在哈茨木霉处理的基础上增加超高压处理取得了显著的进步，是细胞在高压破碎后充分释放了细胞内容物，提高了细胞中大麻二酚溶于乙醇的量。
对比文件3
本对比例提供了一种仅做哈茨木霉和多粘芽孢杆菌处理的大麻二酚的高效提取方法，包括如下步骤：
步骤一、将汉麻叶和汉麻花置于80℃干燥10～12h后粉碎至40目得到汉麻粉；配制哈茨木霉液体发酵培养基，以料液比为1g：1mL将汉麻粉加入哈茨木霉液体发酵培养基中，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤二、哈茨木霉活化后接入液体种子培养基，25℃培养48h，得到菌丝浓度为200～250g/L的哈茨木霉种子液；以接种量7mL将哈茨木霉种子液接入50mL步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基，混匀后于28℃，相对湿度为92％的条件下培养5d，将所得哈茨木霉发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min，冷却、充分干燥并粉碎至40目待用；
步骤三、配制营养肉汤培养基，按料液比1g：1mL向营养肉汤培养基中加入步骤二所得哈茨木霉发酵培养物，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤四、多粘芽孢杆菌活化后接入MRS培养基，37℃、转速为220r/min摇床培养24h，至芽孢率达到90％以上，得到多粘芽孢杆菌种子液，菌浓为106～108CFU/mL；以接种量3mL将多粘芽孢杆菌种子液接入50mL步骤三所得营养肉汤培养基，混匀并于28℃、相对湿度80％的条件下发酵培养24h，将所得多粘芽孢杆菌发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min待用；
步骤五、将冷却后的步骤四所得灭过菌多粘芽孢杆菌发酵培养物用2～3倍体积的95％乙醇充分洗涤，离心收集上清液，将离心沉淀用2～3倍体积的95％乙醇再次充分洗涤，离心收集上清液，合并所得上清液待用；
步骤六、将步骤五所得上清液置于50～70℃下减压蒸馏脱除乙醇溶剂，得到浓缩液，以大孔吸附树脂DM-130为层析介质，大孔吸附树脂质量与浓缩液体积之间的料液比为1:5，在25℃条件下完成吸附；用45～55％的乙醇洗脱5个柱体积洗脱大部分极性杂质，再用80～95％的乙醇洗脱3～5个柱体积洗脱大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脱液，50～70℃减压浓缩得到大麻二酚浓缩液，经高效液相色谱分析所得大麻二酚浓缩液中大麻二酚含量大于65％，且未发现四氢大麻酚；
步骤七、所得大麻二酚浓缩液用200目硅胶层析柱进行进一步纯化，以石油醚为流动相进行等度洗脱，流动相流速为10mL/min，收集富含大麻二酚的洗脱液，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固体，经高效液相色谱检测所得大麻二酚固体纯度为99.6％，收率为0.91％。
对比例3的大麻二酚收率为0.91％，约为实施例10大麻二酚收率的72％，而比对比例1仅用哈茨木霉处理的大麻二酚收率提高了35％，比对比例2仅做哈茨木霉和超高压处理的大麻二酚收率降低了17％，这充分说明在哈茨木霉处理的基础上增加超高压处理能够充分释放汉麻细胞的细胞内容物，而多粘芽孢杆菌进一步酶处理能在超高压处理的基础上将蛋白质、多糖等大分子物质降解，充分释放出大麻二酚，显著提高了大麻二酚的提取率和收率。
Claims (10)
1.一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将汉麻叶和汉麻花干燥后粉碎至40目得到汉麻粉；配制哈茨木霉液体发酵培养基，以一定料液比向所述哈茨木霉液体发酵培养基中加入所述汉麻粉，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤二、哈茨木霉活化后接入液体种子培养基，一定温度下进行种子培养得到哈茨木霉种子液；以一定接种量将哈茨木霉种子液接入步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基，混匀后于一定温度和湿度条件下进行固体培养得到哈茨木霉发酵培养物；将所得哈茨木霉发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min，冷却、充分干燥并粉碎至40目待用；
步骤三、向步骤二所得粉碎后的哈茨木霉发酵培养物中加水制成混悬液，将所述混悬液装入耐压的塑料袋中，密封后放入超高压处理装置的提取容器中；常温下在一定时间内将超高压处理装置内的压强升高至200Mpa并保压一定时间，然后在一定时间内将超高压处理装置内的压强迅速泄为常压；重复升压泄压的操作3次后，将塑料袋从超高压处理装置的提取容器中取出待用；
步骤四、向步骤三所得超高压处理后的物料中添加牛肉膏、蛋白胨和NaCl配制营养肉汤培养基，120℃灭菌锅中灭菌20min，冷却后待用；
步骤五、多粘芽孢杆菌活化后接入多黏芽孢杆菌液体种子培养基，一定温度、转速下培养得到多粘芽孢杆菌种子液；以一定接种量将多粘芽孢杆菌种子液接入步骤三所得冷却后的营养肉汤培养基，一定温度、湿度条件下进行固体培养得到多粘芽孢杆菌发酵培养物，将所得多粘芽孢杆菌发酵培养物置于120℃灭菌锅中灭菌40min待用；
步骤六、将冷却后的步骤五所得灭过菌多粘芽孢杆菌发酵培养物用乙醇充分洗涤，离心收集上清液，将离心沉淀用乙醇再次充分洗涤，离心收集上清液，合并所得上清液待用；
步骤七、将步骤六所得上清液置于50～70℃下减压蒸馏脱除乙醇溶剂，得到浓缩液以大孔吸附树脂为层析介质在一定吸附温度下完成吸附；用45～55％的乙醇洗脱5个柱体积洗脱大部分极性杂质，再用80～95％的乙醇洗脱3～5个柱体积洗脱大麻二酚，收集富含大麻二酚的洗脱液，50～70℃减压浓缩得到大麻二酚浓缩液，经高效液相色谱分析未发现四氢大麻酚杂质；
步骤八、将步骤七所得大麻二酚浓缩液用硅胶层析柱进行进一步纯化，以石油醚为流动相进行等度洗脱，收集富含大麻二酚的洗脱液，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到白色大麻二酚固体。
2.根据权利要求1所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步骤一所述干燥为80℃干燥10～12h，所述哈茨木霉液体发酵培养基的配方为：马铃薯200g/L，蔗糖10g/L，葡萄糖10g/L，pH6.5；所述汉麻粉与哈茨木霉液体发酵培养基的料液比为1g：1mL。
3.根据权利要求1或2所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步骤二所述哈茨木霉液体种子培养基配方为：马铃薯200g/L，蔗糖10g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨1g/L，无水乙酸钠2g/L，七水硫酸镁6g/L，pH6.5；所述哈茨木霉种子培养条件为25℃培养48h，所述哈茨木霉种子液的菌丝浓度为200～250g/L；所述哈茨木霉种子液的接入量为步骤一所得冷却后的哈茨木霉液体发酵培养基体积的10～15％；所述固体培养的温度为28℃，相对湿度为92％，培养时间为5d。
4.根据权利要求3所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步骤三所述哈茨木霉发酵培养物与水的质量体积比为1g：1mL，所述升压时间为15min，所述保压时间为20min，所述泄压时间为10～14s。
5.根据权利要求4所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步骤四所述营养肉汤培养基配方为：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，pH6.5。
6.根据权利要求5所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步骤五所述多黏芽孢杆菌液体种子培养基配方为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸氢二钾2g/L，柠檬酸氢二胺2g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.04g/L，pH6.5；所述多粘芽孢杆菌种子培养条件为37℃、转速为220r/min摇床培养24h，所述多粘芽孢杆菌种子液的芽孢率为90％以上；所述多粘芽孢杆菌种子液的菌浓为106～108CFU/mL；所述多粘芽孢杆菌种子液的接入量为步骤三所得冷却后的营养肉汤培养基体积的5～10％；所述固体培养的条件为28℃、相对湿度80％的条件下发酵培养24h。
7.根据权利要求6所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步骤六所述洗涤是用2～3倍体积的95％乙醇充分震荡洗涤，所述离心为转速5000r/min离心20min。
8.根据权利要求7所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步骤七所述大孔吸附树脂为DM-130大孔吸附树脂，所述大孔吸附树脂质量与浓缩液体积之间的料液比为1g:5mL；所述吸附温度为25℃，所述大麻二酚浓缩液中大麻二酚的纯度为60～70％。
9.根据权利要求8所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，步骤八中所述硅胶层析柱为200目硅胶层析柱，所述流动相流速为10mL/min，所述大麻二酚固体纯度为99％以上。
10.根据权利要求1-9任一所述一种大麻二酚的高效提取方法，其特征在于，所述哈茨木霉购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.12165：
所述多粘芽孢杆菌购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCCNo.10122。
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| GR01 | Patent grant | ||
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