CN115108889A - 一种利用真菌固态发酵提取大麻二酚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法，包括如下步骤，S1：利用蒸汽爆破对工业大麻花叶进行预处理；S2：微生物和孢子悬浮液的制备；S3：固体培养基的配置及灭菌；S4：微生物固态发酵大麻；S5：发酵产物的提取和纯化，本发明首先通过蒸汽爆破方法对工业大麻进行预处理，从而使大麻中纤维素、半纤维素大部分降解为可溶性小分子，增加大麻可观表面积和孔隙，更有利于后续微生物发酵大麻基质；然后采用真菌利用气相双动态固态发酵反应器对工业大麻进一步固态发酵，微生物生长代谢过程中产生一系列酶进一步促使大麻细胞壁糖类、蛋白质、纤维素等成分的分解，促进大麻二酚的转化，大大提高大麻二酚的提取率。
Description
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种利用真菌固态发酵提取工业大麻中大麻二酚的方法。
背景技术
大麻二酚(Cannabidiol,CBD)是一种从大麻中分离得到的具有生物活性的萜类酚类化合物，不同于四氢大麻酚(THC)，是非精神活性大麻素，具有抗氧化、抗炎、抗菌、神经保护和抗惊厥等多种药理活性，是一种多靶点化合物。
目前，大麻二酚的主要提取方法包括固液萃取法(SLE)和超临界流体CO2萃取法(SFE)。固液萃取法往往使用大量有机溶剂，提取的大麻产品存在溶剂残留问题；而超临界流体CO2萃取法提取率高，无溶剂残留，但是设备投入成本高，运行成本高，难以工业化扩大生产。相较于以上方法微生物发酵提取法，相较前两种方法，可以大量减少有机溶剂的使用，工艺简单，产品无溶剂残留，且运行成本较低，适于推广应用。
微生物发酵方法主要为液态发酵法和固态发酵法。微生物液态发酵由于整个发酵过程中工艺参数比较容易控制，更易工业化。而固态发酵更像微生物的自然栖息地，真菌生长在干燥的基质上发展菌丝形态，使基质穿透和气生菌丝。相较于液态发酵，发酵培养基更简单，不需要像液体发酵罐一样多，水的消耗量大大减少，整个过程更加环保。
固态发酵是以气相为连续相，液相及其覆盖的固相为固定相的三相生物反应系统。其具有节能、节水，环境友好的特点，在缓解液体发酵带来的废水量大、环境污染等瓶颈问题具有较大潜力。固体基质为微生物提供营养物质的同时，还为微生物提供满足其生长条件的空间，因此需要对固体基质进行预处理才能获得更好的发酵效果。固态发酵培养基预处理的方法包括球磨、超声等物理方法；酸碱化学试剂降解等化学方法。另外还有物理化学组合方法——蒸汽爆破。蒸汽爆破处理因效率高，环境友好的特点被应用于木质素原料的预处理中。目前还未有研究报道将该方法用于工业大麻预处理中。
目前已有专利申请关于提取大麻二酚的方法，主要包括：
(1)CN202010242812.2(公布日2020.07.17)，云南西草资源开发有限公司利用紫色硫细菌液态发酵大麻得到纯度大于80％的大麻二酚；
(2)CN201910200209.5(公布日2019.05.21)，黑龙江阳光工业大麻研究院利用混合真菌液态发酵大麻得到富含CBD的浸膏
(3)CN201910484684.X(公布日2019.07.23)，云南绿新生物药业有限公司利用内生真菌发酵床进行固体发酵，提高大麻二酚的提取率
(4)CN 201910773152.8(公布日2019.10.29)，李卫等利用超高压预处理汉麻，真菌固体发酵得到纯度为98％的大麻二酚固体
上述专利申请采用物理粉碎方法对物料进行预处理，粉碎效率低，不能使大麻细胞壁上的纤维素和半纤维素大分子降解为可溶性小分子，而且大麻表面积和孔隙度较小，不有利于真菌的生长。
上述文献(3)使用的填充床式固态发酵反应器，文献(4)使用的转鼓式固态发酵反应器，无法避免反应器中存在的微生物的剪切损伤，也无法有效保证微生物发酵效果。
发明内容
鉴于此，为解决现有大麻二酚提取技术效率低、工艺复杂，运行成本高，存在有机试剂残留等问答题，本发明提供了一种利用真菌固态发酵提取工业大麻中大麻二酚的方法，该方法成本较低、工艺简单、绿色环保。
本发明的提取方法首先通过蒸汽爆破方法对工业大麻进行预处理，从而使大麻中纤维素、半纤维素大部分降解为可溶性小分子，增加大麻可观表面积和孔隙，更有利于后续微生物发酵大麻基质；然后采用真菌利用气相双动态固态发酵反应器对工业大麻进一步固态发酵，微生物生长代谢过程中产生一系列酶进一步促使大麻细胞壁糖类、蛋白质、纤维素等成分的分解，促进大麻二酚的转化，大大提高大麻二酚的提取率；最后利用大孔树脂和硅胶层析柱得到大麻二酚纯化液，减压浓缩干燥后得到纯度98％大麻二酚固体。
本发明的技术方案如下：
一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法，包括如下步骤：，
S1：利用蒸汽爆破对工业大麻花叶进行预处理；
称取一定重量的大麻花叶装入汽爆罐中，关闭阀门后通入蒸汽；罐压升至设定的压力和温度后，维持一定的时间，然后，瞬间释放罐中的压力，汽爆后的物料随蒸汽流进入汽爆接收罐；收集汽爆后的物料，利用去离子水洗涤汽爆物料三次，用纱布过滤，收集固体，然后在烤箱中烘干并储存在干燥处；
所述蒸汽爆破罐组件包括：一台蒸汽发生器、一台反应罐和一部汽爆接收罐；
S2：微生物和孢子悬浮液的制备
准备菌种，所述菌种包括长枝木霉、细黄链霉菌、链霉素链霉菌；将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基培养，用含有吐温-20的无菌水洗涤平板并适当稀释获得孢子悬浮液备用；
S3：固体培养基的配置及灭菌
配置含80％的汽爆预处理后的大麻花叶，并额外添加硫酸铵、尿素、蛋白胨作为固态发酵氮源；用含0.3％硫酸镁、0.03％硫酸铁的营养液调整体系中含水量为60％；制备的培养基于需高压蒸汽灭菌一定时间；
S4：微生物固态发酵大麻
待上述步骤S3中物料冷却后接入3.3×106/g干基的孢子，装入气相双动态固态发酵器进行固态发酵，设置参数如下：周期脉动的高压为0.2Mpa，维持20s，常压维持时间为20min，发酵温度为28℃，发酵48～72h；
S5：发酵产物的提取和纯化
将上述步骤S4中固态发酵后的物料，转移至提取罐，加入乙醇多次提取，合并提取液，真空减压浓缩回收溶剂，得到工业大麻提取浸膏；
将上述工业大麻提取浸膏溶于乙醇，离心取上清液上大孔树脂D300、D101、HP-20、HD-2或C18硅胶层析柱，流动相为乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的体积比为40：60～20:80，进行分离，收集大麻二酚馏分，减压浓缩后得到大麻二酚纯化液，减压干燥的到大麻二酚成品。
优选地，步骤S1中设定的压力为1.1MPa～1.5MPa，温度为181～201℃，维持一定的时间为3～5min，烤箱温度设定为50℃，去离子水的质量为3-4倍大麻花叶初始质量。
优选地，步骤S2中，将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，孢子悬浮液浓度为107/mL。
优选地，步骤S3中，制备的培养基于121℃高压蒸汽灭菌30min。
优选地，步骤S4中，以1～2倍的体积加入乙醇,提取3～4次，每次3～5h,提取温度30～60℃，合并提取液，真空减压浓缩回收溶剂，得到工业大麻提取浸膏，浸膏得率10～25％，HPLC检测大麻二酚含量大于50mg/g。
本发明采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明的大麻二酚提取方法成本较低、工艺简单且绿色环保。
(2)本发明通过蒸汽爆破方法对工业大麻进行预处理，较物理粉碎方法更加高效，本发明蒸汽爆破原理：蒸汽爆破处理过程包括高温蒸煮和压力释放两个阶段。高温蒸煮阶段，物料在高温蒸汽环境中发生类酸性降解，纤维素和半纤维素大分子部分降解为可溶性小分子。在压力释放阶段，罐体内的蒸汽被迅速释放，细胞内外压差导致其爆破而产生结构破坏。因此，汽爆处理后的物料组分发生降解，物理结构因发生撕裂而变得松散。这些变化导致原料的可及表面积和孔隙度增加，更加有利于后续微生物固态发酵。
(3)本发明使用了新型微生物发酵反应器——气相双动态固态发酵反应器对工业大麻进一步固态发酵，气相双动态固态发酵反应器利用气体脉动和内循环两种方式使水分、氧气、二氧化碳和热量在固体基质内部小尺度周转，在较大程度上避免了其他反应器中存在的微生物的剪切损伤，从而使微生物发酵效果更好。
(4)本发明采用真菌利用气相双动态固态发酵反应器对工业大麻进一步固态发酵，微生物生长代谢过程中产生一系列酶进一步促使大麻细胞壁糖类、蛋白质、纤维素等成分的分解，促进大麻二酚的转化，大大提高了大麻二酚的提取率；最后利用大孔树脂和硅胶层析柱得到大麻二酚纯化液，减压浓缩干燥后得到纯度98％大麻二酚固体。
附图说明
图1本发明大麻成品液相色谱图
图2本发明的工艺流程图
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例以购买中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)的“长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)，保藏编号5.1236”、“细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)，保藏编号4.6556”、“链霉素链霉菌(Streptomyces streptomycini)，保藏编号4.617”为例进行说明，其他型号的长枝木霉、细黄链霉菌和链霉素链霉菌同样适用于本发明方法。
参见附图2本发明的工艺流程图，本发明的具体实施例如下：
实施例1
一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法,包括如下步骤：
步骤一、对工业大麻花叶进行蒸汽爆破预处理
称取250g大麻花叶装入汽爆罐中，关闭阀门后通入蒸汽。罐压升至设定的压力后(1.1MPa,181℃)，维持一定的时间5min，然后，瞬间释放罐中的压力，汽爆后的物料随蒸汽流进入汽爆接收罐。收集汽爆后的物料，利用4倍大麻花叶初始质量的去离子水洗涤汽爆物料三次，用纱布过滤，收集固体，然后在50℃的烤箱中烘干并储存在干燥处。
步骤二、微生物和孢子悬浮液的制备
细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号4.6556。将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，用含有吐温-20的无菌水洗涤平板并适当稀释获得107/mL的孢子悬浮液，备用。
步骤三、固体培养基的配置及灭菌
配置含80％的汽爆预处理后的大麻花叶，并额外添加硫酸铵、尿素、蛋白胨等作为固态发酵氮源。用含0.3％硫酸镁、0.03％硫酸铁的营养液调整体系中含水量为60％。制备的培养基于121℃高压蒸汽灭菌30min。
步骤四、微生物固态发酵大麻
待上述步骤(三)中物料冷却后接入3.3×106/g干基的孢子，装入气相双动态固态发酵器进行固态发酵，设置参数如下：周期脉动的高压为0.2Mpa，维持20s，常压维持时间为20min，发酵温度为28℃，发酵72h。
步骤五、发酵产物的提取和纯化
将上述步骤(四)固态发酵后的物料，转移至提取罐，以1～2倍的体积加入乙醇,提取3～4次，每次3～5h,提取温度30～60℃，合并提取液，真空减压浓缩回收溶剂，得到工业大麻提取浸膏，浸膏得率10～25％，HPLC检测大麻二酚含量大于50mg/g。
将上述大麻浸膏溶于乙醇，离心取上清液上大孔树脂(D101)，流动相为乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的体积比为(40：60～20:80)进行分离，收集大麻二酚馏分，减压浓缩后得到大麻二酚纯化液，减压干燥的到大麻二酚成品，HPLC检测大麻二酚含量大于98％，未检测四氢大麻酚(THC)。
实施例2
一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法,包括如下步骤：
步骤一、对工业大麻花叶进行蒸汽爆破预处理
称取250g大麻花叶装入汽爆罐中，关闭阀门后通入蒸汽。罐压升至设定的压力后(1.3MPa,191℃)，维持一定的时间4min，然后，瞬间释放罐中的压力，汽爆后的物料随蒸汽流进入汽爆接收罐。收集汽爆后的物料，利用4倍大麻花叶初始质量的去离子水洗涤汽爆物料三次，用纱布过滤，收集固体，然后在50℃的烤箱中烘干并储存在干燥处。
步骤二、微生物和孢子悬浮液的制备
长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号5.1236。将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，用含有吐温-20的无菌水洗涤平板并适当稀释获得107/mL的孢子悬浮液，备用。
步骤三、固体培养基的配置及灭菌
配置含80％的汽爆预处理后的大麻花叶，并额外添加硫酸铵、尿素、蛋白胨等作为固态发酵氮源。用含0.3％硫酸镁的营养液调整体系中含水量为60％。制备的培养基于121℃高压蒸汽灭菌30min。
步骤四、微生物固态发酵大麻
待上述步骤(三)中物料冷却后接入3.3×106/g干基的孢子，装入气相双动态固态发酵器进行固态发酵，设置参数如下：周期脉动的高压为0.2Mpa，维持20s，常压维持时间为20min，发酵温度为28℃，发酵72h。
步骤五、发酵产物的提取和纯化
将上述步骤(四)固态发酵后的物料，转移至提取罐，以1～2倍的体积加入乙醇,提取3～4次，每次3～5h,提取温度30～60℃，合并提取液，真空减压浓缩回收溶剂，得到工业大麻提取浸膏，浸膏得率10～25％，HPLC检测大麻二酚含量大于60mg/g。
将上述大麻浸膏溶于乙醇，离心取上清液上大孔树脂(D101)，流动相为乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的体积比为(40：60～20:80)进行分离，收集大麻二酚馏分，减压浓缩后得到大麻二酚纯化液，减压干燥的到大麻二酚成品，HPLC检测大麻二酚含量大于98％，未检测四氢大麻酚(THC)。
实施例3
一种真菌发酵提取大麻二酚的方法,包括如下步骤：
步骤一、对工业大麻花叶进行蒸汽爆破预处理
称取250g大麻花叶装入汽爆罐中，关闭阀门后通入蒸汽。罐压升至设定的压力后(1.3MPa,191℃)，维持一定的时间4min，然后，瞬间释放罐中的压力，汽爆后的物料随蒸汽流进入汽爆接收罐。收集汽爆后的物料，利用4倍大麻花叶初始质量的去离子水洗涤汽爆物料三次，用纱布过滤，收集固体，然后在50℃的烤箱中烘干并储存在干燥处。
步骤二、微生物和孢子悬浮液的制备
链霉素链霉菌(Streptomyces streptomycini)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号4.617。将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，用含有吐温-20的无菌水洗涤平板并适当稀释获得107/mL的孢子悬浮液，备用。
步骤三、固体培养基的配置及灭菌
配置含80％的汽爆预处理后的大麻花叶，并额外添加硫酸铵、尿素、蛋白胨等作为固态发酵氮源。用含0.3％硫酸镁的营养液调整体系中含水量为60％。制备的培养基于121℃高压蒸汽灭菌30min。
步骤四、微生物固态发酵大麻
待上述步骤(三)中物料冷却后接入3.3×106/g干基的孢子，装入气相双动态固态发酵器进行固态发酵，设置参数如下：周期脉动的高压为0.2Mpa，维持20s，常压维持时间为20min，发酵温度为28℃，发酵72h。
步骤五、发酵产物的提取和纯化
将上述步骤(四)固态发酵后的物料，转移至提取罐，以1～2倍的体积加入乙醇,提取3～4次，每次3～5h,提取温度30～60℃，合并提取液，真空减压浓缩回收溶剂，得到工业大麻提取浸膏，浸膏得率10～25％，HPLC检测大麻二酚含量大于55mg/g。
将上述大麻浸膏溶于乙醇，离心取上清液上大孔树脂(D101)，流动相为乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的体积比为(40：60～20:80)进行分离，收集大麻二酚馏分，减压浓缩后得到大麻二酚纯化液，减压干燥的到大麻二酚成品，HPLC检测大麻二酚含量大于98％，未检测四氢大麻酚(THC)。
实施例4
一种真菌发酵提取大麻二酚的方法,包括如下步骤：
步骤一、对工业大麻花叶进行蒸汽爆破预处理
称取250g大麻花叶倒入耐高温高压塑料袋，装入汽爆罐中，关闭阀门后通入蒸汽。罐压升至设定的压力后(1.1MPa,181℃)，维持一定的时间6min，然后，瞬间释放罐中的压力，汽爆后，将装有物料的塑料袋取出，自然冷却，利用3倍大麻花叶初始质量的去离子水洗涤汽爆物料三次，用纱布过滤，收集固体，然后在50℃的烤箱中烘干并储存在干燥处。
步骤二、微生物和孢子悬浮液的制备
链霉素链霉菌(Streptomyces streptomycini)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号4.617。将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，用含有吐温-20的无菌水洗涤平板并适当稀释获得107/mL的孢子悬浮液，备用。
步骤三、固体培养基的配置及灭菌
配置含80％的汽爆预处理后的大麻花叶，并额外添加硫酸铵、尿素、蛋白胨等作为固态发酵氮源。用含0.3％硫酸镁的营养液调整体系中含水量为60％。制备的培养基于121℃高压蒸汽灭菌30min。
步骤四、微生物固态发酵大麻
待上述步骤(三)中物料冷却后接入3.3×106/g干基的孢子，装入气相双动态固态发酵器进行固态发酵，设置参数如下：周期脉动的高压为0.2Mpa，维持20s，常压维持时间为20min，发酵温度为28℃，发酵72h。
步骤五、发酵产物的提取和纯化
将上述步骤(四)固态发酵后的物料，转移至提取罐，以1～2倍的体积加入乙醇,提取3～4次，每次3～5h,提取温度30～60℃，合并提取液，真空减压浓缩回收溶剂，得到工业大麻提取浸膏，浸膏得率10～25％，HPLC检测大麻二酚含量大于45mg/g。
将上述大麻浸膏溶于乙醇，离心取上清液上大孔树脂(D101)，流动相为乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的体积比为(40：60～20:80)进行分离，收集大麻二酚馏分，减压浓缩后得到大麻二酚纯化液，减压干燥的到大麻二酚成品，HPLC检测大麻二酚含量大于98％，未检测四氢大麻酚(THC)。
对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请创造构思的前提下，还可以对本发明的实施例做出若干变型和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (5)
1.一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：，
S1：利用蒸汽爆破对工业大麻花叶进行预处理；
称取一定重量的大麻花叶装入汽爆罐中，关闭阀门后通入蒸汽；罐压升至设定的压力和温度后，维持一定的时间，然后，瞬间释放罐中的压力，汽爆后的物料随蒸汽流进入汽爆接收罐；收集汽爆后的物料，利用去离子水洗涤汽爆物料三次，用纱布过滤，收集固体，然后在烤箱中烘干并储存在干燥处；
所述蒸汽爆破罐组件包括：一台蒸汽发生器、一台反应罐和一部汽爆接收罐；
S2：微生物和孢子悬浮液的制备
准备菌种，所述菌种包括长枝木霉、细黄链霉菌、链霉素链霉菌；将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基培养，用含有吐温-20的无菌水洗涤平板并适当稀释获得孢子悬浮液备用；
S3：固体培养基的配置及灭菌
配置含80％的汽爆预处理后的大麻花叶，并额外添加硫酸铵、尿素、蛋白胨作为固态发酵氮源；用含0.3％硫酸镁、0.03％硫酸铁的营养液调整体系中含水量为60％；制备的培养基于需高压蒸汽灭菌一定时间；
S4：微生物固态发酵大麻
待上述步骤S3中物料冷却后接入3.3×106/g干基的孢子，装入气相双动态固态发酵器进行固态发酵，设置参数如下：周期脉动的高压为0.2Mpa，维持20s，常压维持时间为20min，发酵温度为28℃，发酵48～72h；
S5：发酵产物的提取和纯化
将上述步骤S4中固态发酵后的物料，转移至提取罐，加入乙醇多次提取，合并提取液，真空减压浓缩回收溶剂，得到工业大麻提取浸膏；
将上述工业大麻提取浸膏溶于乙醇，离心取上清液上大孔树脂D300、D101、HP-20、HD-2或C18硅胶层析柱，流动相为乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的体积比为40：60～20:80，进行分离，收集大麻二酚馏分，减压浓缩后得到大麻二酚纯化液，减压干燥的到大麻二酚成品。
2.根据权利要求1所述的一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤S1中设定的压力为1.1MPa～1.5MPa，温度为181～201℃，维持一定的时间为3～5min，烤箱温度设定为50℃，去离子水的质量为3-4倍大麻花叶的初始质量。
3.根据权利要求1-2任一项所述的一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤S2中，将试管中的菌种涂布于土豆葡萄糖琼脂培养基中于28℃培养7天，孢子悬浮液浓度为107/mL。
4.根据权利要求1-2任一项所述的所述的一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤S3中，制备的培养基于121℃高压蒸汽灭菌30min。
5.根据权利要求1-2任一项所述的所述的一种真菌固态发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤S4中，以1～2倍的体积加入乙醇,提取3～4次，每次3～5h,提取温度30～60℃，合并提取液，真空减压浓缩回收溶剂，得到工业大麻提取浸膏，浸膏得率10～25％，HPLC检测大麻二酚含量大于50mg/g。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20220927 |