CN116004467B - 一株耐高温的大肠杆菌及其在生产d-乳酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐高温的大肠杆菌及其在生产D‑乳酸中的应用。本发明提供的耐高温的大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.25786。实验证明，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300可以在高温(如47℃)条件下发酵生产D‑乳酸，且D‑乳酸的产量高(糖酸转化率达到0.95g/g)、纯度高(D‑乳酸光学纯度>99.5)。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株耐高温的大肠杆菌及其在生产D-乳酸中的应用。
背景技术
随着合成生物学的快速发展，已有大量工程化的微生物被用于发酵生产大宗化学品、精细化工品和天然产物等。在微生物细胞工厂创建时，不仅目标产物合成途径的选择至关重要，用于发酵生产的微生物的生理特性对产业化生产同样具有重要的价值。
大肠杆菌作为合成生物学和代谢工程中最常用的模式生物之一，具有遗传背景清晰、生长底物广泛、遗传操作工具全面和生长快等一系列优势。改善大肠杆菌生理耐受性对于大肠杆菌在工业生产中的应用具有重要的价值，例如大肠杆菌的最适生长温度为37℃，超过44℃后则大肠杆菌在基础培养基中的生长会受到显著抑制。然而在实际工业生产中，高温不仅可以有效减少发酵过程中的污染，而且还可以通过增加化合物的溶解度提高目标产物的产量。因此，提高大肠杆菌的耐高温能力具有重要价值。
D-乳酸是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成，例如利用D-乳酸制造除草剂骠马、除草剂威霸、除草剂Duplosan、钙拮抗剂降压药、皮考啉酸衍生物以及二甲四氯丙酸、氟系除草剂等。此外，以D-乳酸为原料的乳酸酯类在香料、合成树脂涂料、胶粘剂及印刷油墨等生产中应用广泛，在石油管道和电子工业的清洗等方面也有应用，还可用作医药、农药的原料和其它手性化合物合成的前体、中间体。创建抗逆性更好的工程菌株对于我国D-乳酸产业发酵保持先进性、实现菌种迭代升级具有重要价值。
发明内容
本发明的目的是生产D-乳酸。
本发明首先保护一株大肠杆菌，名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300，该菌株已于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.25786。大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300CGMCCNo.25786简称为大肠杆菌Dlac300或大肠埃希氏菌Dlac300。
本发明还保护一种菌剂，其可含有大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300。所述菌剂的用途可为生产D-乳酸。
本发明还保护所述菌剂的制备方法，可包括如下步骤：将大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300接种至培养基并进行培养，获得的菌液即为菌剂。
所述培养基可为实施例2中的发酵培养基或种子培养基。
本发明还保护大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300或上述任一所述菌剂在生产D-乳酸中的应用。
上述应用中，所述生产D-乳酸的条件可为25-50℃(如25-30℃、30-40℃、40-45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃)、厌氧培养。
上述应用中，所述生产D-乳酸的条件具体可为47℃、厌氧培养。
上述应用中，所述生产D-乳酸的培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20-200g/L(如20-100g/L、180-200g/L、180-200g/L、20g/L、100g/L、180g/L或200g/L)NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl0.15g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O1.5μg/L、CoCl2·6H2O0.1μg/L、CuCl2·2H2O0.1μg/L、ZnCl20.1μg/L、Na2MoO4·2H2O0.1μg/L、MnCl2·4H2O0.2μg/L,H3BO30.05μg/L。
上述应用中，厌氧培养即培养过程中没有通任何气体。
上述应用中，所述生产D-乳酸的过程中使用氨水(浓度可为3-7M)为中和剂，使发酵罐的pH值控制为6.0-8.0(如7.0)。
本发明还保护一种生产D-乳酸的方法，包括如下步骤：
(1)发酵培养大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300，得到发酵液；
(2)从发酵液中分离D-乳酸。
所述步骤(1)中，发酵培养的温度可为25-50℃(如25-30℃、30-40℃、40-45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃)。
所述步骤(1)中，发酵培养的温度具体可为47℃。
所述步骤(1)中，发酵培养为厌氧培养(即培养过程中没有通任何气体)。
上述任一所述生产D-乳酸的过程中使用氨水(浓度可为3-7M)为中和剂，使发酵罐的pH值控制为6.0-8.0(如7.0)。
上述任一所述方法中，所述生产D-乳酸的培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20-180g/L，NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl0.15g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O1.5μg/L、CoCl2·6H2O0.1μg/L、CuCl2·2H2O0.1μg/L、ZnCl20.1μg/L、Na2MoO4·2H2O0.1μg/L、MnCl2·4H2O0.2μg/L,H3BO30.05μg/L。
上述任一所述方法中，“发酵培养大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300，得到发酵液”具体包括种子液的制备和发酵液的制备两个部分。
种子液的制备方法包括：向规格为500ml的三角瓶中加入150ml种子培养基或向规格为250ml的三角瓶中加入100ml种子培养基，115℃灭菌15min。冷却后接种大肠杆菌Dlac300，47℃、250rpm培养12小时，得到种子液。
所述种子培养基可由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20g/L，NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl0.15g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O1.5μg/L、CoCl2·6H2O0.1μg/L、CuCl2·2H2O0.1μg/L、ZnCl20.1μg/L、Na2MoO4·2H2O0.1μg/L、MnCl2·4H2O0.2μg/L,H3BO30.05μg/L。
发酵液的制备方法可包括：向规格为5L厌氧罐中加入3L发酵培养基(将种子培养基中葡萄糖的浓度调整为180g/L，其它成分和浓度均不变)，115℃灭菌15min。之后将种子液接种于发酵培养基，得到OD550nm为0.2的发酵体系；47℃、200rpm发酵培养2天，得到发酵液。
发酵液的制备方法可包括：向规格为500ml厌氧罐中加入250ml发酵培养基(将种子培养基中葡萄糖的浓度调整为100g/L，其它成分和浓度均不变)，115℃灭菌15min。之后将种子液按照终浓度为OD550nm＝0.1的接种量接种于发酵培养基，47℃、150rpm发酵培养2天，得到发酵液。
实验证明，大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300可以在高温(如47℃)条件下发酵生产D-乳酸，且D-乳酸的产量高(糖酸转化率达到0.95g/g)、纯度高(D-乳酸光学纯度>99.5)。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为D-乳酸的合成与细胞生长的偶联。
图2为大肠杆菌Dlac206菌株的高温驯化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
大肠杆菌Dlac206已于2013年06月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.7679。同时大肠杆菌Dlac206记载于2021年05月28日公开的公开号为CN112852693B的中国发明专利。
种子培养基的溶质及其浓度为葡萄糖20g/L、NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl0.15g/L、FeCl3·6H2O1.5mg/L、CoCl2·6H2O0.1mg/L、CuCl2·2H2O0.1mg/L、ZnCl20.1mg/L、Na2MoO4·2H2O0.1mg/L、MnCl2·4H2O0.2mg/L和H3BO30.05mg/L，溶剂为水；115℃灭菌15min。
实施例1、大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300CGMCCNo.25786的获得和保藏
一、大肠杆菌Dlac300的获得
本发明的发明人前期通过代谢工程和代谢驯化相结合获得了大肠杆菌Dlac206，其可以在42℃的条件下高效生产D-乳酸。为了进一步满足适应实际工业化生产的需求，本发明的发明人基于D-乳酸合成和细胞生长偶联的原理(见图1)，继续通过代谢驯化提高大肠杆菌Dlac206对高温的耐受性，意在突破大肠杆菌在44℃以上温度条件下在基础培养基中生长受抑制的限制，获得能够在45℃以上发酵生产D-乳酸的大肠杆菌。具体的，大肠杆菌Dlac206中D-乳酸合成是厌氧发酵时唯一消耗NADH从而促使糖酵解驯化持续运转并提供细胞生长所需能量的途径。因此，在厌氧发酵条件下，基于还原力平衡原理实现D-乳酸合成和细胞生长的偶联，基于这种偶联，从大肠杆菌Dlac206出发通过进化代谢技术同步提高大肠杆菌的D-乳酸生产能力和耐高温能力。
具体步骤如下：
1、第1代：将大肠杆菌Dlac206接种至装有250mL代谢驯化培养基的发酵罐，得到OD550nm为0.05的发酵体系；43℃发酵培养24h，得到发酵液。
2、第2代—第15代：将上一代的发酵液接种至装有250mL代谢驯化培养基的发酵罐，得到OD550nm为0.05的发酵体系；43℃发酵培养24h，得到发酵液。
3、第16代—第45代：将上一代的发酵液接种至装有250mL代谢驯化培养基的发酵罐，得到OD550nm为0.05的发酵体系；44℃发酵培养24h，得到发酵液。
4、第46代—第85代：将上一代的发酵液接种至装有250mL代谢驯化培养基的发酵罐，得到OD550nm为0.05的发酵体系；45℃发酵培养24h，得到发酵液。
5、第86代—第130代：将上一代的发酵液接种至装有250mL代谢驯化培养基的发酵罐，得到OD550n为0.05的发酵体系；46℃发酵培养24h，得到发酵液。
6、第130代—第150代：将上一代的发酵液接种至装有250mL代谢驯化培养基的发酵罐，得到OD550nm为0.05的发酵体系；47℃发酵培养24h，得到发酵液。
7、第150代—第180代：将上一代的发酵液接种至装有250mL代谢驯化培养基的发酵罐，得到OD550nm为0.05的发酵体系；47℃发酵培养12h，得到发酵液。
上文中，代谢驯化培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖120g/L、NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl0.15g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O2.4μg/L、CoCl2·6H2O0.3μg/L、CuCl2·2H2O0.15μg/L、ZnCl20.3μg/L、Na2MoO4·2H2O0.3μg/L、MnCl2·4H2O0.5μg/L和H3BO30.072μg/L。
所用发酵罐的规格为500mL。
整个发酵过程中，使用5M氨水为中和剂，控制pH值为7.0。
检测每代获得的发酵液的OD550nm。检测结果见图2。
7、从第180代获得的发酵液中分离大肠杆菌，得到大肠杆菌Dlac300。
二、大肠杆菌Dlac300的保藏
步骤一分离的大肠杆菌Dlac300已于2022年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.25786。大肠杆菌Dlac300的全称为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300CGMCCNo.25786，简称为大肠杆菌Dlac300。
实施例2、大肠杆菌Dlac300在发酵生产D-乳酸中的应用
一、大肠杆菌Dlac300在500mL发酵罐中发酵生产D-乳酸
本步骤中的种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20g/L，NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl0.15g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O1.5μg/L、CoCl2·6H2O0.1μg/L、CuCl2·2H2O0.1μg/L、ZnCl20.1μg/L、Na2MoO4·2H2O0.1μg/L、MnCl2·4H2O0.2μg/L,H3BO30.05μg/L；
115℃灭菌15min。
本步骤中的发酵培养基：将种子培养基中葡萄糖的浓度调整为100g/L，其它成分和浓度均不变；115℃灭菌15min。
1、种子培养
规格为250ml的三角瓶中加入100ml种子培养基，然后接种大肠杆菌Dlac300，47℃、250rpm培养12小时，得到种子液。
2、发酵培养
规格为500ml厌氧罐中加入250ml发酵培养基，然后将种子液按照终浓度为OD550nm＝0.1的接种量接种于发酵培养基，47℃、150rpm发酵培养2天，得到发酵液。
发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有通任何气体，即厌氧培养。
整个发酵过程中，使用5M氨水为中和剂，使发酵罐的pH值控制为7.0。
3、完成步骤2后，使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪检测发酵液中的组分；采用AminexHPX—87H有机酸分析柱(Biorad公司)检测发酵液中葡萄糖和有机酸的浓度；采用SUMICHIRALOA-6000手性柱(日本SumikaChemicalAnalysis Service公司)分析乳酸光学纯度。
检测结果表明，步骤2得到的发酵液中，D-乳酸的产量达到91.3g/L，糖酸转化率达到0.95g/g，D-乳酸光学纯度>99.7％。
二、大肠杆菌Dlac300在5L发酵罐中发酵生产D-乳酸
本步骤中的种子培养基由以下成分组成(溶剂为水)：
大量元素：葡萄糖20g/L，NH4H2PO40.87g/L、(NH4)2HPO42.63g/L、MgSO4·7H2O0.18g/L、甜菜碱-HCl0.15g/L；
微量元素：FeCl3·6H2O1.5μg/L、CoCl2·6H2O0.1μg/L、CuCl2·2H2O0.1μg/L、ZnCl20.1μg/L、Na2MoO4·2H2O0.1μg/L、MnCl2·4H2O0.2μg/L,H3BO30.05μg/L；
115℃灭菌15min。
本步骤中的发酵培养基：将种子培养基中葡萄糖的浓度调整为180g/L，其它成分和浓度均不变；115℃灭菌15min。
1、种子培养
规格为500ml的三角瓶中加入150ml种子培养基，之后接种大肠杆菌Dlac300，47℃、250rpm培养12小时，得到种子液。
2、发酵培养
规格为5L厌氧罐(上海保兴，BIOTECH-5BG)中加入3L发酵培养基，之后将种子液接种于发酵培养基，得到OD550nm为0.2的发酵体系；47℃、200rpm发酵培养2天，得到发酵液。
发酵液为发酵罐内所有物质。培养过程中没有通任何气体，即厌氧培养。
整个发酵过程中，使用5M氨水为中和剂，使发酵罐的pH值控制为7.0。
3、完成步骤2后，使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪检测发酵液中的组分；采用AminexHPX—87H有机酸分析柱(Biorad公司)检测发酵液中葡萄糖和有机酸的浓度；采用SUMICHIRALOA-6000手性柱(日本SumikaChemicalAnalysis Service公司)分析乳酸光学纯度。
检测结果表明，步骤3得到的发酵液中，D-乳酸产量达152.5g/L，糖酸转化率达到0.95g/g，D-乳酸光学纯度>99.5％。
上述结果表明，大肠杆菌Dlac300可以在高温(47℃)条件下发酵生产D-乳酸，且D-乳酸的产量高、纯度高。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.25786。
2.一种菌剂，其含有权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300。
3.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300接种至培养基并进行培养，获得的菌液即为菌剂。
4.权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300或权利要求2所述菌剂在生产D-乳酸中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述生产D-乳酸的条件为25-50℃、厌氧培养。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述生产D-乳酸的条件为47℃、厌氧培养。
7.一种生产D-乳酸的方法，包括如下步骤：
(1)发酵培养权利要求1所述大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)Dlac300，得到发酵液；
(2)从发酵液中分离D-乳酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，发酵培养的温度为25-50℃。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，发酵培养的温度为47℃。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，发酵培养为厌氧培养。
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