CN111423312A - 一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学药物中间体提取技术领域，公开了一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，将工业大麻的花、叶、麻糠中的一种或几种作为原料，经过烘干、粉碎，得到含水率不超过5％的大麻原料；向装有粉碎后的物料的透明有机玻璃罐体中加入水及培养好的紫色硫细菌发酵液，照射密闭静止24‑30小时，得到大麻发酵液；过滤发酵液除去残渣；低温减压浓缩，得到含大麻二酚的初提浸膏；然后通过大孔树脂除杂，通过硅胶柱层析纯化得到纯度大于80％的大麻二酚。本发明方法操作简单，成本低廉，具有良好的推广和应用价值。本发明也公开了以大麻二酚为主要成分，添加或不添加紫草素、精油等其它成分，具有治疗小儿红屁股、湿疹、尿疹、口水疹等作用。

Description

一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法及其应用
技术领域
本发明涉及化学药物中间体提取技术领域，具体地说，是涉及一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法及其应用。
背景技术
工业大麻又称汉麻，是大麻科大麻属1年生草本植物，具有较为广泛的应用。汉麻中非成瘾性成分大麻二酚具有保护神经、改善记忆力、抗炎、杀菌、镇痛、抗焦虑、抗精神病、抗氧化等作用，被广泛用于药品、保健品、功能饮料及化妆品等领域，具有较高的研究价值。
目前，大麻二酚的提取途径主要包括超临界萃取和有机溶剂萃取等方式进行提取。相较于有机溶剂萃取方法，利用微生物发酵法提取大麻二酚，可以减少有机溶剂的使用量，减少对环境的污染。虽然超临界提取技术的提取率较高，无溶剂残留，但设备投资大，效率较低，成本高、能耗高、难以实现工业化放大生产。使用光合细菌属中的紫色硫细菌来发酵提取大麻中的大麻二酚，产品中无四氢大麻酚成分，且工艺简单，成本较低，适于推广应用。
发明内容
本发明的目的在于解决上述问题，提供一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，并将提取的大麻二酚应用到治疗小儿红屁股、湿疹、尿疹、口水疹等，具有良好的治疗效果。
为了解决上述问题，本发明提供如下技术方案：
一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，包括如下步骤：
(1)将工业大麻的花、叶、麻糠中的一种或几种烘干后粉碎，过100目筛得工业大麻粉；
(2)向步骤(1)得到的工业大麻粉中加水得混合液，向混合液中倒入发酵好的紫色硫细菌发酵液，发酵培养24-30小时，得到大麻发酵液；
(3)将步骤(2)得到的大麻发酵液过滤，除去残渣，减压浓缩，通过大孔树脂除去大麻浸膏中的杂质，得到含大麻二酚的浓缩液；
(4)将步骤(3)得到的浓缩液通过硅胶柱层析纯化得到大麻二酚。
优选的，步骤(1)所述烘干为在55℃-65℃下真空低温烘干至含水量≤5％。
优选的，步骤(2)所述工业大麻粉与水的质量比为1:10-15。
优选的，步骤(2)所述紫色硫细菌发酵液与工业大麻水溶液的质量比为1:100-200。
优选的，步骤(2)所述发酵培养条件为：在密闭环境中，采用日光或60瓦白炽灯泡在30℃-40℃下发酵培养24-30小时。
优选的，所述发酵用透明有机玻璃作为发酵罐。
优选的，步骤(3)所述大孔吸附树脂型号为AB-8，树脂洗脱液为65-75％酒精溶液。
优选的，步骤(4)所述的硅胶柱层析洗脱剂为体积比为100:1的石油醚和乙酸乙酯。
本发明还提供一种利用紫色硫细菌发酵提取得到的大麻二酚的应用，以大麻二酚为主要成分，添加或不添加紫草素、精油等其它成分，具有治疗小儿红屁股、湿疹、尿疹、口水疹等作用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中利用紫色硫细菌可在有光照厌氧的环境下能够利用多种有机物作为底物，合成多种酶类如纤维素酶、果胶酶等破坏植物胞壁成分，使大麻中的活性成分大麻二酚释放出来，提高产率。
(2)本发明提取方法得到的大麻二酚检测不到四氢大麻酚成分，提取过程工艺简单，能够大规模的工业化生产。
(3)采用本发明方法提取的大麻二酚添加紫草、精油等其他组分，具有叠加的抗菌效果，可用于治疗小儿红屁股、湿疹、尿疹、口水疹等疾病。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。
实施例1
一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，包括如下步骤：
(1)将工业大麻的花和叶在55℃下真空低温烘干至含水量≤5％后粉碎，过100目筛得工业大麻粉；
(2)向步骤(1)得到的工业大麻粉中加入其质量10倍的水得混合液，向混合液中倒入发酵好的紫色硫细菌发酵液，其中紫色硫细菌发酵液与工业大麻水溶液的质量比为1:100，在密闭环境中，采用日光或60瓦白炽灯泡在30℃下发酵培养30小时，得到大麻发酵液；
(3)将步骤(2)得到的大麻发酵液过滤，除去残渣，减压浓缩，通过大孔树脂除去大麻浸膏中的部分杂质，得到含大麻二酚的浓缩液；经高效液相色谱分析所得大麻二酚浓缩液中大麻二酚含量大于60％，且未发现四氢大麻酚；
(4)将步骤(3)得到的浓缩液通过硅胶柱层析纯化，以体积比为100:1的石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到油状物大麻二酚，经高效液相色谱检测所得大麻二酚纯度大于95％；且无四氢大麻酚杂质。
本实施例使用的高效液相色谱条件如下：
C18反相柱：4.6×150mm5μm
柱温：40℃
检测波长：220nm
洗脱方式：等度洗脱
流速：1ml/min
进样量：20μL
流动相：甲醇:0.1％甲酸＝80:20。
实施例2
一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，包括如下步骤：
(1)将工业大麻的花和麻糠在60℃下真空低温烘干至含水量≤5％后粉碎，过100目筛得工业大麻粉；
(2)向步骤(1)得到的工业大麻粉中加入其质量12倍的水得混合液，向混合液中倒入发酵好的紫色硫细菌发酵液，其中紫色硫细菌发酵液与工业大麻水溶液的质量比为1:150，在密闭环境中，采用日光或60瓦白炽灯泡在35℃下发酵培养26小时，得到大麻发酵液；
(3)将步骤(2)得到的大麻发酵液过滤，除去残渣，减压浓缩，通过大孔树脂除去大麻浸膏中的杂质，得到含大麻二酚的浓缩液；经高效液相色谱分析所得大麻二酚浓缩液中大麻二酚含量大于63％，且未发现四氢大麻酚；
(4)将步骤(3)得到的浓缩液通过硅胶柱层析纯化，以体积比为100:1的石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到油状物大麻二酚，经高效液相色谱检测所得大麻二酚纯度大于95％；且无四氢大麻酚杂质。
本实施例使用的高效液相色谱条件如下：
C18反相柱：4.6×150mm5μm
柱温：40℃
检测波长：220nm
洗脱方式：等度洗脱
流速：1ml/min
进样量：20μL
流动相：甲醇:0.1％甲酸＝80:20。
实施例3
一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，包括如下步骤：
(1)将工业大麻的花、叶和麻糠在65℃下真空低温烘干至含水量≤5％后粉碎，过100目筛得工业大麻粉；
(2)向步骤(1)得到的工业大麻粉中加入其质量15倍的水得混合液，向混合液中倒入发酵好的紫色硫细菌发酵液，其中紫色硫细菌发酵液与工业大麻水溶液的质量比为1:200，在密闭环境中，采用日光或60瓦白炽灯泡在40℃下发酵培养24小时，得到大麻发酵液；
(3)将步骤(2)得到的大麻发酵液过滤，除去残渣，减压浓缩，通过大孔树脂除去大麻浸膏中的杂质，得到含大麻二酚的浓缩液；经高效液相色谱分析所得大麻二酚浓缩液中大麻二酚含量大于66％，且未发现四氢大麻酚；
(4)将步骤(3)得到的浓缩液通过硅胶柱层析纯化，以体积比为100:1的石油醚和乙酸乙酯作为洗脱剂，减压浓缩得到大麻二酚纯化液，将大麻二酚纯化液50℃真空干燥得到油状物大麻二酚，经高效液相色谱检测所得大麻二酚纯度大于95％；且无四氢大麻酚杂质。
本实施例使用的高效液相色谱条件如下：
C18反相柱：4.6×150mm5μm
柱温：40℃
检测波长：220nm
洗脱方式：等度洗脱
流速：1ml/min
进样量：20μL
流动相：甲醇:0.1％甲酸＝80:20。
对比例1
将紫色硫细菌发酵液换成酿酒酵母发酵液(此例选用果酒酵母发酵菌液，其他酿酒酵母发酵液的效果与此大致相同)，其余条件与实施例3完全相同，经高效液相色谱检测所得大麻二酚纯度大于95％；但含有四氢大麻酚杂质。
对比例2
将紫色硫细菌发酵液换成双歧杆菌发酵菌液，其余条件与实施例3完全相同，经高效液相色谱检测所得大麻二酚纯度大于95％；但含有四氢大麻酚杂质。
临床试验
1.实验产品
产品1：将实施例3制备的大麻二酚添加姜黄精油，按照重量份比为1：1制备成婴幼儿皮肤乳膏。
产品2：将实施例3制备的大麻二酚添加紫草、桉树精油，按照重量份比为1：3：1制备成婴幼儿皮肤乳膏。
2.对婴幼儿湿疹的效果实验
通过临床试用产品1和产品2的乳膏验证对婴幼儿湿疹治疗效果，选取60名婴幼儿湿疹受试志愿者，年龄1-18个月，平均随机分为3组，每组20名。一组：每天使用产品1，连续使用7天；二组：每天使用产品2，连续使用7天；对比组：每天使用市售的湿疹产品，连续使用7天。对比使用前后治疗效果，结果见表1。
评价标准：
无效：湿疹无明显改善情况，甚至加重；
有效：湿疹颜色变淡、睡眠质量变好；
治愈：湿疹消退。
表1婴儿湿疹的治疗效果
治愈/人 有效/人 无效/人 总有效率/％
产品1 13 7 0 100
产品2 16 4 0 100
市售产品 10 6 4 80
3.对婴幼儿尿布疹、红屁股的效果实验
临床儿科随诊对22例患有尿布性皮炎的患儿进行试用治疗，年龄2-18个月，随机分为两组，两组分别采用产品1和产品2的皮肤乳膏，嘱每次排便后，温水清洗患儿臀部后，用柔软清洁毛巾吸干水，然后涂抹皮肤乳膏，另嘱家长勤换尿布，使用2天后，两组患儿的皮肤充血或红肿消退，持续使用1周后，所有患儿均痊愈。说明本发明实施例提供的皮肤乳膏治疗婴儿尿布性皮炎的有效率为100％，而且见效快，2天后即可明显改善婴儿皮肤充血或红肿症状，持续使用7天后即可痊愈。
综上所述，采用本发明方法提取的大麻二酚制备成婴幼儿皮肤乳膏，对于小儿红屁股、湿疹、尿疹、口水疹等具有良好的治疗效果，且无任何毒副作用，无皮肤过敏现象。
按照上述实施例，便可很好地实现本发明。值得说明的是，基于上述结构设计的前提下，为解决同样的技术问题，即使在本发明上做出的一些无实质性的改动或润色，所采用的技术方案的实质仍然与本发明一样，故其也应当在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将工业大麻的花、叶、麻糠中的一种或几种烘干后粉碎，过100目筛得工业大麻粉；
(2)向步骤(1)得到的工业大麻粉中加水得混合液，向混合液中倒入发酵好的紫色硫细菌发酵液，发酵培养24-30小时，得到大麻发酵液；
(3)将步骤(2)得到的大麻发酵液过滤，除去残渣，减压浓缩，通过大孔树脂除去大麻浸膏中的杂质，得到含大麻二酚的浓缩液；
(4)将步骤(3)得到的浓缩液通过硅胶柱层析纯化得到大麻二酚。
2.根据权利要求1所述的利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤(1)所述烘干为在55℃-65℃下真空低温烘干至含水量≤5％。
3.根据权利要求1所述的利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤(2)所述工业大麻粉与水的质量比为1:10-15。
4.根据权利要求1所述的利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤(2)所述紫色硫细菌发酵液与工业大麻粉的质量比为1:100-200。
5.根据权利要求1所述的利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤(2)所述发酵培养条件为：在密闭环境中，采用日光或60瓦白炽灯泡在30℃-40℃下发酵培养24-30小时。
6.根据权利要求1所述的利用紫色硫细菌发酵提取大麻二酚的方法，其特征在于，步骤(3)所述大孔吸附树脂型号为AB-8，树脂洗脱液为65-75％酒精溶液。
7.根据权利要求1所述的，其特征在于，步骤(4)所述的硅胶柱层析洗脱剂为体积比为100:1的石油醚和乙酸乙酯。
8.一种利用权利要求1-7任一项所述方法制备的大麻二酚的应用，其特征在于，用于治疗小儿红屁股、湿疹、尿疹、口水疹。
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