CN115141289B - 一种酸性三七多糖及其制备方法与应用 - Google Patents

一种酸性三七多糖及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酸性三七多糖及其制备方法与应用。所述的酸性三七多糖，来源于提取三七总皂苷之后的树脂洗脱液，分子量为2000‑2500kDa，结构中含有羧基基团。其制备方法包括浓缩、醇沉、活性炭脱色、树脂脱色、树脂分离、透析、干燥等步骤。所述酸性三七多糖具有美白、护肤、抗氧化的功效，可用作化妆品的原料。

Description

一种酸性三七多糖及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于化妆品领域，具体涉及一种酸性三七多糖及其制备方法与应用。
背景技术
三七多糖是一种极具开发利用价值的资源，其应用价值十分广阔。
现如今工业上三七多糖的提取方法多为利用提取三七总皂苷之后的残渣采用水提醇沉法提取，这个方法操作简单，经济便捷，对环境污染小，但此种方法只利用了工厂大生产下的三七渣，未能利用工厂大生产下的树脂洗脱液，造成损失，不利于三七资源的综合利用，二次利用废液提取纯化得到酸性三七多糖，可以有效提高三七运用，减少浪费。
申请号为201910584252.6的专利公开了一种酸性三七多糖及其提取纯化方法。该专利通过对提取过三七皂苷后的药渣进行再提取，得到酸性三七多糖，其得到的酸性多糖分子量为2500-3000kDa，单糖组成及摩尔比例为Rha:Ara:Man:Glc:Gal:GalA=0.038:0.045:0.002:0.016:0.031:0.868。并发现该多糖在保护酒精性肝损伤上效果显著。然而该专利并未对提取三七皂苷过程中产生的树脂洗脱废液进行分离纯化，也并未发现树脂洗脱废液中的三七多糖。
申请号为201710459344.2的专利公开了一种中性三七多糖的提取纯化方法及促进细胞增殖药理活性研究与应用。该专利以水提醇沉法制备三七粗多糖，采用DEAE阴离子交换柱纯化后，得到中性三七多糖。并发现该多糖可促进牙周膜干细胞和小鼠成骨细胞及人皮肤表皮细胞增殖。然而该专利并未得到酸性多糖，也并未进一步纯化和鉴定其结构组成。
申请号为201611189464.7的专利公开了一种小分子三七多糖提取物的制备方法及应用。该专利采用三氟乙酸或溶菌酶水解得到小分子多糖粗液，并通过阴阳离子交换柱层析、活性炭脱色、冷冻干燥制的小分子三七多糖提取物。然而该专利并未对多糖提取物进行进一步分离纯化，也未鉴定多糖组分和结构组成。
申请号为201210481377.4的专利公开了一种三七多糖提取物及其制备方法与制剂及应用。所述的三七多糖提取物是以提取三七总皂苷后的废渣未原料经提取、浓缩、精制、干燥、粉碎、检验步骤得到，并未对多糖提取物进一步分离纯化，也未对其结构进行鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种二次利用三七总皂苷工业生产中产生的树脂洗脱液废液制备三七多糖的方法，该三七多糖为酸性三七多糖，具有美白、护肤、抗氧化的功效，可用作化妆品的原料。
本发明所述的酸性三七多糖，来源于提取三七总皂苷之后的树脂洗脱液，分子量为2000-2500kDa，结构中含有羧基基团，因此该三七多糖为酸性三七多糖。该酸性三七多糖由阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成，其摩尔比为1:2.53:0.17:3.16:0.38:0.15。主链为α-1,4-Glcp，是分支程度较低的葡聚糖类多糖。
所述酸性三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
（1）将提取三七总皂苷的大孔树脂洗脱废液收集，浓缩得浓缩液；
（2）将浓缩液搅拌加入乙醇至乙醇浓度达80%以上，静置，过滤，滤渣用乙醇洗涤；
（3）将洗涤后滤渣用热水搅拌溶解，溶解后加入活性炭，加热，保温，趁热过滤，滤液保存；
（4）待滤液温度降低，将滤液通入脱色树脂，静态吸附，水洗脱，收集水洗液；
（5）将水洗液通入阴离子交换树脂，以纯化水及不同浓度的NaCl溶液梯度洗脱，收集各段洗脱液，减压浓缩；
（6）透析：将上一步得到的含有所述酸性三七多糖的浓缩液，使用纯化水透析，透析后进行干燥，制得所述酸性三七多糖。
优选地，步骤（1）中，于45～65℃、-0.07～-0.05MPa条件下浓缩至原体积的1/5～1/4。
优选地，步骤（2）中，静置12～24h。
优选地，步骤（2）中，滤渣用3～4倍95%乙醇洗涤。
优选地，步骤（3）中，活性炭的用量为8～12%（重量百分比）。
优选地，步骤（3）中，加入活性炭后加热至80～90℃，保温30～60min。
优选地，步骤（4）中，滤液温度降至≤30℃。
优选地，步骤（4）中，静态吸附时间为60～120min。
优选地，步骤（5）中，NaCl溶液的浓度分别为0.1、0.2、0.3M。
优选地，步骤（5）中，将各段洗脱液在50～80℃下减压浓缩至原体积的1/10～1/8。
优选地，步骤（6）中，含有所述酸性三七多糖的浓缩液为0.2M NaCl溶液的洗脱液的浓缩液。
优选地，步骤（6）中，透析步骤为使用纯化水透析10～12h，每3～4h换一次水。
优选地，步骤（6）中，干燥方式为喷雾干燥或真空干燥。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
1、本发明的原料来源于提取三七总皂苷之后的树脂洗脱废液，进行了二次利用，使三七资源得到更充分高效的运用，减少资源浪费，同时减少生产过程中产生的环境污染。
2、使用生产过程中产生的树脂洗脱废液获取酸性三七多糖，比使用三七废渣提取酸性三七多糖可以减少提取的步骤，而提取过程需要消耗大量热能，相同收率情况下，100公斤三七多糖可以节约约400立方天然气。
3、本发明对三七多糖的脱色具有显著效果，通过活性炭和脱色树脂等脱色剂联用，三七多糖的脱色率可达到65.26%以上，更加方便添加运用到化妆品产品中。
4、本发明制得的酸性三七多糖对皮肤具有显著的美白护肤抗氧化功效，可用作化妆品原料。
附图及说明
图1为实施例1所述制备方法的工艺流程图。
图2为实施例1制得的酸性三七多糖离子色谱图（图中：A-混合单糖标准品色谱图，1-藻糖，2-阿拉伯糖，3-半乳糖，4-葡萄糖，5-木糖，6-甘露糖，7-果糖，8-核糖，9-半乳糖醛酸，10-葡萄糖醛酸，11-甘露糖醛酸；B-实施例1制得的酸性三七多糖色谱图）。
图3为实施例1制得的酸性三七多糖甲基化产物PMAA总离子流图。
图4为实施例1制得的酸性三七多糖的红外光谱图。
实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于实施例。
实施例1
一种酸性三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
1、将提取三七总皂苷的大孔树脂洗脱废液收集，于65℃、-0.07MPa条件下浓缩至原体积的1/5～1/4得浓缩液；
2、将浓缩液搅拌加入乙醇至乙醇浓度80%（体积百分比）以上，静置24h，过滤，滤渣用4倍95%乙醇洗涤；
3、将洗涤后滤渣使用5倍量热水搅拌溶解，溶解后加入12%（按滤渣重量百分比计）活性炭，加热至90℃，保温30min，趁热过滤，滤液保存；
4、待滤液温度降至≤30℃，将滤液通入脱色树脂（AB-8），静态吸附60min，水洗脱，收集水洗液；
5、将上一步脱色后水洗液通入LXP702阴离子交换树脂，以纯化水、0.1M、0.2M、0.3M NaCl溶液梯度洗脱，收集各段洗脱液，分别命名为NPPN（中性三七多糖）、APPN1、APPN2、APPN3，在80℃下减压浓缩至原体积的1/10；
6、透析：将上一步得到的APPN2浓缩液，使用纯化水透析12h，每4h换一次水，透析结束，将含有APPN2浓缩液进行喷雾干燥或直接真空干燥，制得所述酸性三七多糖。
经三氟乙酸水解，离子色谱法检测其单糖组成，其离子色谱图如图2所示，该酸性三七多糖由阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成，其摩尔比为1:2.53:0.17:3.16:0.38:0.15。经离子色谱分析，组成该多糖的单糖除有中性糖外，还有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，表明该多糖为酸性多糖。将该糖糖醛酸还原后再进行甲基化分析，由总离子图（图3）可见，该酸性多糖主要由10种糖残基构成，经二级质谱图鉴定，分别为T-Linked Araf（0.92%），T-Linked Glcp（7.11%），T-Linked Galp（2.53%），1,3-Linked Galp（3.05%），1,4-Linked Glcp（64.25%），1,6-Linked Galp（7.29%），1,4,6-Linked Glcp（4.90%），1,3,6Linked Galp（6.17%），糖醛酸的连接方式为T-Linked Glc-ACp（0.81%），1,4-Linked Gal-ACp（3.34%）。由红外光谱分析（FT-IR，图4）分析，该多糖主链为α-1,4-Glcp，是分支程度较低的葡聚糖类多糖，可能含有少量HG、AG类型的果胶结构域。
实施例2
一种酸性三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
1、将提取三七总皂苷的大孔树脂洗脱废液收集，于55℃、-0.06MPa条件下浓缩至原体积的1/5得浓缩液；
2、将浓缩液搅拌加入乙醇至乙醇浓度80%（体积百分比）以上，静置18h，过滤，滤渣用3.5倍乙醇洗涤；
3、将洗涤后滤渣用热水搅拌溶解，溶解后加入10%（按滤渣重量百分比计）活性炭，加热至85℃，保温45min，趁热过滤，滤液保存；
4、待滤液温度降至25℃，将滤液通入脱色树脂，静态吸附90min，水洗脱，收集水洗液；
5、将上一步脱色后水洗液通入阴离子交换树脂，以纯化水、0.1M、0.2M、0.3M NaCl溶液梯度洗脱，收集各段洗脱液，分别命名为NPPN（中性三七多糖）、APPN1、APPN2、APPN3，在65℃下减压浓缩至原体积的1/9；
6、透析：将上一步得到的APPN2浓缩液，使用纯化水透析11h，每3.5h换一次水，透析结束，将含有APPN2浓缩液进行喷雾干燥，制得所述酸性三七多糖。
实施例3
一种酸性三七多糖的制备方法，包括以下步骤：
1、将提取三七总皂苷的大孔树脂洗脱废液收集，于45℃、-0.05MPa条件下浓缩至原体积的1/4得浓缩液；
2、将浓缩液搅拌加入乙醇至乙醇浓度80%（体积百分比）以上，静置12h，过滤，滤渣用3倍95%乙醇洗涤；
3、将洗涤后滤渣用热水搅拌溶解，溶解后加入8%（按滤渣重量百分比计）活性炭，加热至80℃，保温60min，趁热过滤，滤液保存；
4、待滤液温度降至20℃，将滤液通入脱色树脂，静态吸附120min，水洗脱，收集水洗液；
5、将上一步脱色后水洗液通入阴离子交换树脂，以纯化水、0.1M、0.2M、0.3M NaCl溶液梯度洗脱，收集各段洗脱液，分别命名为NPPN（中性三七多糖）、APPN1、APPN2、APPN3，在50℃下减压浓缩至原体积的1/8；
6、透析：将上一步得到的APPN2浓缩液，使用纯化水透析10h，每3h换一次水，透析结束，将含有APPN2浓缩液直接真空干燥，制得所述酸性三七多糖。
应用实施例1——所述酸性三七多糖体外抗氧化功效评估（DPPH自由基清除能力）
1、试验材料
（1）仪器与材料
主要试剂：DPPH、抗坏血酸（VC）、无水乙醇、磷酸缓冲盐溶液（PBS）
主要仪器：酶标仪、混匀仪
（2）测试样品
样品经PBS稀释后备用，样品浓度梯度设置（%，V/V）：3.13、6.25、12.50、25.00、50.00。
2、试验方法——体外DPPH自由基清除试验
将样品配制成相应浓度的待测液，按照表1中各试剂添加量配制反应体系，混匀，每个浓度设置3个复孔，1个背景对照孔。
Figure SMS_1
将反应体系置于室温，避光反应20min。反应结束后，依次取反应液200μl加入96孔板，于517nm下读取吸光度OD值，按照下式计算样品对DPPH自由基的清除率。
Figure SMS_2
式中：C1-空白有DPPH体系吸光度值
C2-空白无DPPH体系吸光度值
T1-样品组有DPPH体系吸光度值
T2-样品组无DPPH体系吸光度值
3、试验结果——体外DPPH自由基清除试验结果
Figure SMS_3
4、结论
样品（所述酸性三七多糖）在3.13-50.00%（V/V）浓度下能够提高DPPH自由基的清除率。且与阴性对照组相比具有统计学差异（p＜0.01）。样品具有清除DPPH自由基的能力，具有抗氧化功效。
应用实施例2——所述酸性三七多糖体外美白功效评估（络氨酸酶活性抑制）
1、试验材料
（1）仪器与材料
细胞：小鼠黑素瘤细胞（B16F10）购自协和医学院细胞资源中心
主要试剂：磷酸缓冲盐溶液（PBS）、DMEM培养基、抗坏血酸葡糖苷（AA2G）、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、CCK-8试剂盒、DMSO、左旋多巴、TritonX-100
主要仪器：酶标仪、混匀仪、CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、水浴锅、超低温冰箱
（2）测试样品
样品为水溶性样品，用DMEM培养基将样品稀释，样品浓度梯度设置（%，V/V）：0.04、0.08、0.10。
2、试验方法——细胞络氨酸酶抑制试验
收集对数生长期细胞，按照细胞密度为1x104个/孔接种至96孔板。在培养箱（37℃，5%CO2）中培养24h后，加入1%抗坏血酸葡糖苷（AA2G）作为阳性对照，以未处理细胞作为阴性对照，每组设置3个平行。
加药后培养箱（37℃，5%CO2）中继续培养48h，弃去培养基，PBS洗2次，每孔加入100μl 0.5% TritonX-100，放-80℃冰箱裂解2h，取出96孔板，室温自然融化后，每孔加入50μl10mmol/ L左旋多巴，于37℃孵育2h，475nm下读取吸光度值并计算细胞络氨酸酶活性抑制率。
3、试验结果——细胞络氨酸酶活性抑制结果
Figure SMS_4
Figure SMS_5
4、结论
细胞络氨酸酶活性抑制试验中，经0.04%、0.08%、0.10%（V/V）样品（所述酸性三七多糖）处理的细胞络氨酸酶活性抑制率提高且与阴性对照组相比具有统计学差异（p＜0.01）。样品具有抑制细胞络氨酸酶活性的作用，具有美白功效。

Claims (8)

1.一种酸性三七多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将提取三七总皂苷的大孔树脂洗脱废液收集，浓缩得浓缩液；
（2）将浓缩液搅拌加入乙醇至乙醇浓度达80%以上，静置，过滤，滤渣用乙醇洗涤；
（3）将洗涤后滤渣用热水搅拌溶解，溶解后加入活性炭，加热，保温，趁热过滤，滤液保存；
（4）待滤液温度降低，将滤液通入脱色树脂，静态吸附，水洗脱，收集水洗液；
（5）将水洗液通入LXP702阴离子交换树脂，以纯化水、0.1M NaCl溶液、0.2M NaCl溶液、0.3M NaCl溶液梯度洗脱，收集0.2M NaCl溶液的洗脱液，减压浓缩；
（6）透析：将上一步得到的含有所述酸性三七多糖的浓缩液，使用纯化水透析，透析后进行干燥，制得所述酸性三七多糖。
2.根据权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，于45～65℃、-0.07～-0.05MPa条件下浓缩至原体积的1/5～1/4。
3.根据权利要求1 所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，按滤渣重量百分比计，活性炭的用量为8～12%，加入活性炭后加热至80～90℃，保温30～60min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，滤液温度降至≤30℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，将洗脱液在50～80℃下减压浓缩至原体积的1/10～1/8。
6.由权利要求1-5任意一项所述的制备方法制得的酸性三七多糖，其特征在于，分子量为2000-2500kDa，结构中含有羧基基团。
7.根据权利要求6所述的酸性三七多糖，其特征在于，所述酸性三七多糖由阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成，其摩尔比为1:2.53:0.17:3.16:0.38:0.15，主链为α-1,4-Glcp。
8.权利要求6所述的酸性三七多糖在作为化妆品的原料中的应用。
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