CN114057552A - 一种检测用大麻二酚标准物质的制备的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法。选取酚类物质基因相对表达量为7.0以上的工业大麻叶片并制浆，取5.0g该叶片浆样品与100mL质量分数80％的甲醇溶液，置于三角瓶中超声处理，时间15min、功率149W，然后在0.09MPa、65℃条件下，减压蒸馏除甲醇后备用。选取枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，制备复合直投式发酵剂。复合直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01％，36℃静止发酵24h。发酵液经离心后取上清液经正己烷萃取后氮吹干燥，然后经甲醇溶解取上清液备用。制备表面均匀分布羟基的活化硅胶固相萃取柱，将上述上清液经固相萃取柱分离后,获得一种检测用大麻二酚标准品,经测定纯度范围为92.2％‑98.5％。

Description

一种检测用大麻二酚标准物质的制备的方法
(一)技术领域
本发明涉及一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，具体涉及一种荧光定量PCR技术和一种生物发酵技术，结合固相萃取技术制备一种检测用大麻二酚标准物质，属生物和化学领域。
(二)背景技术
大麻是大麻科大麻属一年生草本植物，是我国传统经济作物，具有重要的工业及药用价值，在我国已有5000多年的栽培利用历史。大麻的产品利用涉及纺织、造纸、军需、化工、建材、食品及制药等多个方面。大麻素是大麻植株中特有的含烷基和单萜基团的次生代谢物。目前，自大麻植物中分离得到的大麻素有70多种，主要包括THC(tetrahydrocan-nabinol，四氢大麻酚)、CBD(cannabidiol，大麻二酚)、CBC(cannabichromene，大麻环萜酚)、CBN(cannabinol，大麻酚)、CBG(cannabigerol，大麻萜酚)及其丙基同系物THCV、CBDV、CBCV和CBGV等。其中的CBD是大麻中的非毒性和非成瘾性成分，能阻碍THC对人体神经系统的不利影响，是大麻酚类物质中最重要的生理活性成分之一，对于抗焦虑，镇痛、抗失眠、阿尔茨海默病和抗惊厥等有一疗效，并且具有治疗糖尿病、口腔疾病、风湿性疾病等生理活性功能，具有重要的临床应用前景。受遗传控制、生长环境和栽培条件影响，大麻CBD含量在个体之间存在差异，主要体现在大麻叶、种子和茎等部位中。研究发现大麻中CBD含量与大麻二酚酸合成酶基因(CBDAS)mRNA表达量之间呈正相关。目前大麻酚类物质含量的检测方法所用的标准物质均为化学合成，成本高、合成难度较大，限制了大麻酚类物质的检验，天然高纯度大麻酚类物质的制备尚属国内空白领域。
本发明利用荧光定量PCR，筛选CBD含量高的组织，采用生物发酵技术，将大麻中高分子纤维素水解后释放出大麻酚类物质，根据大麻二酚的分子量，制备COF修饰硅胶固定相，利用有机溶剂萃取，经色谱柱分离后获得一种纯度范围为92.2％-98.5％的检测用大麻二酚标准物质。该发明的实施填补了天然大麻二酚标准物质的制备的领域空白，实现我国对大麻酚类物质医药产品领域的初步突破。
(三)发明内容
本发明目的在于提供一种结合荧光定量PCR技术和生物发酵技术制备大麻二酚标准物质的方法。
本发明的目的是这样实现的：
1实验材料的选择
选取工业大麻叶片，液氮速冻，保存于－80℃。
1.1工业大麻叶片组织的RNA提取及反转录
提取工业大麻叶片的总RNA，浓度为415.6ng/μl，经DNase I消化处理后，反转录合成cDNA，反转录时体系中加入0.8μg RNA。并以此为模板进行荧光定量PCR反应。
1.2CBDAS的荧光定量PCR
以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，复孔重复三次。使用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR中CBDAS的引物为:
CBDAS F：5’－ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT－3’
CBDAS R：5’－TTAATGACGATGCCGTGGAAG－3’
内参基因18S的引物为:
18S F：5’－CGCTCCTACCGATTGAATGG－3’
18S R：5’－CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC－3’
反应体系：
SYBR Green，Mix和引物混合物配制:
Mix 10μl
Primer F+R 1μl
SYBR Green(16μl)96孔板配制：
Mix+引物 8μl
cDNA 8μl
反应条件：40个循环
Figure BDA0003365853400000021
溶解曲线：
60℃ 60s
95℃ 30s
60℃ 15s
大麻植株中CBD合成酶活性有高低之分，进而决定了CBD的含量差异。CBDAS参与CBD合成酶的生物合成过程，进而产生大麻植物中的CBD，所以利用荧光定量PCR可对CBDAS进行定量分析。以内参基因作为衡量标准，利用2-ΔΔCt法计算得出大麻叶片中CBDAS相对表达量为7.0以上即可作为提取实验材料。
2大麻二酚粗提物的制备
2.1实验材料的预处理
选取工业大麻的叶片，洗净粉碎成叶片浆，于4℃储存备用。
2.2超声处理
取5.0g叶片浆样品与100mL质量分数为80％的甲醇溶液，置于250mL三角瓶中，进行超声处理。超声时间15min、超声功率为149W，该步骤制备的浆液为超声处理液。
2.3超声处理液真空蒸馏去除甲醇
真空度0.09MPa，蒸馏温度65℃，当超声处理液体积低于蒸馏前体积的30％即可停止蒸馏。
3工业大麻叶片的高分子纤维素的水解
3.1菌种的选择及培养基的制备
A菌—枯草芽孢杆菌CICC10089(Bacillus subtilis)培养基为：NaCl 5.0g，牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.2。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
B菌—地衣芽孢杆菌CICC10831(Bacillus licheniformis)培养基为：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
3.2复合菌直投式发酵剂的制备
3.2.1菌种的活化
分别取10mL 0.9％的生理盐水于2只试管内，经121℃灭菌15分钟冷却至30℃，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。
3.2.2菌种的扩大培养
3.2.2.1母发酵剂的制备
分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内，121℃灭菌15分钟冷却至30℃，按培养基体积的10％接种3.2.1步骤中已经活化的菌种，在36℃培养箱内静止培养24h，作为母发酵剂。
3.2.2.2生产发酵剂的制备
分别取上述两种培养基，分装于2只500mL三角瓶内，每瓶200mL，121℃灭菌15分钟冷却至36℃，分别按2％体积比例接种母发酵剂，36℃培养24—28h，检测2株菌发酵液活菌数，各发酵液活菌数≥109个/mL，视同为发酵成熟，如果活菌数＜109个/mL，继续培养，直至达到109个/mL。
3.3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制备粉末冻干菌种。
3.4复合菌直投式发酵剂的制备
按各粉末冻干菌种重量，取A菌粉末3-5份，B菌粉末2-3份，充分混匀后制成复合菌直投式发酵剂，复合菌直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01％。
需要进一步说明的是：本发明中选用的菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，这些菌的活化、冻干方法不仅仅限于本发明所述的具体方法，培养基的成分也不限于此，其它常规技术和方法都是可以的，只要可以提高菌种的活力、并将其制备成冻干粉状而方便使用即可。
3.5复合菌直投式发酵剂水解工业大麻叶片中高分子纤维素
将经过2.3步骤处理获得的叶片浆按其重量的0.01％添加步骤3.4制备的复合菌直投式发酵剂，充分溶解后，36℃保温静止发酵24h。
4大麻二酚的纯化
4.1活化硅胶的制备
称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3＝v/v)，浸泡12h，在机械搅拌下回流24h除去金属离子，然后用G5砂芯漏斗过滤，用高纯水反复冲洗至中性，最后用丙酮洗涤两次，在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水，即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶，储于干燥器备用。
4.2COF修饰硅胶固定相
将180mg四-(4-氨基苯)乙烯和192.6mg 4,4'-联苯二甲醛溶解在9mL 1,4-二氧六环中，完全溶解后，加入到4.1制备的活化硅胶中，在超声条件下向其中缓慢滴加0.3mL6mol/L的醋酸，所得的混合液在常温条件下放置72h后，用N,N-二甲基乙酰胺和1,4-二氧六环交替洗涤，充分去除未反应的原料和杂质，洗干净的COF在60℃下真空干燥10h，最终获得橙黄色COF粉末。将得到的固体粉末用高纯水，乙醇，丙酮，三氯化碳分别洗涤3次，去除上层未连接到硅胶表面的COF，最终得到所需要的硅胶固定相。
4.3色谱柱的填装
将制得的COF修饰的硅胶固定相按照匀浆法(四氯化碳作为匀浆液，甲醇作为顶替液)装入清洗干净的不锈钢管色谱柱(4.6*150mm，5μm)中。称量2.5g COF修饰的硅胶加到100ml的烧杯中，接着加入50ml的四氯化碳。超声15min后快速倒入装柱机，打开泵，使压力迅速上升调整到25MP，保持10min，之后调整到40MP 40min后，关泵缓缓地降压。当压力降为零后，小心的卸下色谱柱，装上筛板与柱接头。标明方向(与装柱方向保持一致)，柱子填料的名称，色谱柱的尺寸以及装柱的日期。新装的色谱柱用甲醇以0.2ml/min的流速冲洗12h，之后缓慢的增加流速直至1ml/min，待柱压稳定后开始使用。
4.4大麻二酚标准物质的制备
称取60mg COF吸附剂装入固相萃取小柱中(3ml规格)，两端用聚丙烯筛板固定填料，制得标准化固相萃取柱。称取5.0g(精确到0.1g)发酵后的样品于50ml离心管中，加入50ml正己烷，涡旋混合2min；接着超声提取5min，6000r/min离心3min，取上清液于40℃水浴中氮吹至干。然后加入3ml甲醇，超声涡旋各1min，静置取上清液备用。COF固相萃取柱依次用3ml甲醇活化、3ml水平衡，取上述上清液过柱,弃去上清液，用3ml水淋洗固相萃取柱，然后用3ml丙酮溶液洗脱并超声30min，收集洗脱液，于40℃水浴氮气吹干，用流动相定容至1ml，滤液过0.22μm有机滤膜，即得到大麻二酚标准物质。用HPLC归一化法对大麻二酚标准物质进行均匀性、稳定性分析，采用质量平衡法进行定值,采用LC-MS法对有机杂质进行定性分析，电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机残留和水分等杂质的含量。最终确定制备的大麻二酚标准物质纯度范围为92.2％-98.5％。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述：
实施例一：
1.实验材料的选择
选取工业大麻叶片，液氮速冻，保存于－80℃。
1.1工业大麻叶片组织的RNA提取及反转录
提取工业大麻叶片的总RNA，浓度为415.6ng/μl，经DNase I消化处理后，反转录合成cDNA，反转录时体系中加入0.8μg RNA。并以此为模板进行荧光定量PCR反应。
1.2CBDAS的荧光定量PCR
以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，复孔重复三次。使用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR中CBDAS的引物为:
CBDAS F：5’－ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT－3’
CBDAS R：5’－TTAATGACGATGCCGTGGAAG－3’
内参基因18S的引物为:
18S F：5’－CGCTCCTACCGATTGAATGG－3’
18S R：5’－CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC－3’
反应体系：
SYBR Green，Mix和引物混合物配制:
Mix 10μl
Primer F+R 1μl
SYBR Green(16μl)96孔板配制：
Mix+引物 8μl
cDNA 8μl
反应条件：40个循环
Figure BDA0003365853400000061
溶解曲线：
60℃ 60s
95℃ 30s
60℃ 15s
大麻植株中CBD合成酶活性有高低之分，进而决定了CBD的含量差异。CBDAS参与CBD合成酶的生物合成过程，进而产生大麻植物中的CBD，所以利用荧光定量PCR可对CBDAS进行定量分析。以内参基因作为衡量标准，利用2-ΔΔCt法计算得出大麻叶片中CBDAS相对表达量为7.0以上即可作为提取实验材料。
2大麻二酚粗提物的制备
2.1实验材料的预处理
选取工业大麻的叶片，洗净粉碎成叶片浆，于4℃储存备用。
2.2超声处理
取5.0g叶片浆样品与100mL质量分数为80％的甲醇溶液，置于250mL三角瓶中，进行超声处理。超声时间15min、超声功率为149W，该步骤制备的浆液为超声处理液。
2.3超声处理液真空蒸馏去除甲醇
真空度0.09MPa，蒸馏温度65℃，当超声处理液体积低于蒸馏前体积的30％即可停止蒸馏。
3工业大麻叶片的高分子纤维素的水解
3.1菌种的选择及培养基的制备
A菌—枯草芽孢杆菌CICC10089(Bacillus subtilis)培养基为：NaCl 5.0g，牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.2。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
B菌—地衣芽孢杆菌CICC10831(Bacillus licheniformis)培养基为：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
3.2复合菌直投式发酵剂的制备
3.2.1菌种的活化
分别取10mL 0.9％的生理盐水于2只试管内，经121℃灭菌15分钟冷却至30℃，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。
3.2.2菌种的扩大培养
3.2.2.1母发酵剂的制备
分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内，121℃灭菌15分钟冷却至30℃，按培养基体积的10％接种3.2.1步骤中已经活化的菌种，在36℃培养箱内静止培养24h，作为母发酵剂。
3.2.2.2生产发酵剂的制备
分别取上述两种培养基，分装于2只500mL三角瓶内，每瓶200mL，121℃灭菌15分钟冷却至36℃，分别按2％体积比例接种母发酵剂，36℃培养24-28h，检测2株菌发酵液活菌数，各发酵液活菌数≥109个/mL，视同为发酵成熟，如果活菌数＜109个/mL，继续培养，直至达到109个/mL。
3.3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制备粉末冻干菌种。
3.4复合菌直投式发酵剂的制备
按各粉末冻干菌种重量，取A菌粉末3份，B菌粉末2份，充分混匀后制成复合菌直投式发酵剂，复合菌直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01％。
需要进一步说明的是：本发明中选用的菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，这些菌的活化、冻干方法不仅仅限于本发明所述的具体方法，培养基的成分也不限于此，其它常规技术和方法都是可以的，只要可以提高菌种的活力、并将其制备成冻干粉状而方便使用即可。
3.5复合菌直投式发酵剂水解工业大麻叶片中高分子纤维素
将经过2.3步骤处理获得的叶片浆按其重量的0.01％添加步骤3.4制备的复合菌直投式发酵剂，充分溶解后，36℃保温静止发酵24h。
4大麻二酚的纯化
4.1活化硅胶的制备
称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3＝v/v)，浸泡12h，在机械搅拌下回流24h除去金属离子，然后用G5砂芯漏斗过滤，用高纯水反复冲洗至中性，最后用丙酮洗涤两次，在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水，即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶，储于干燥器备用。
4.2COF修饰硅胶固定相
将180mg四-(4-氨基苯)乙烯和192.6mg 4,4'-联苯二甲醛溶解在9mL 1,4-二氧六环中，完全溶解后，加入到4.1制备的活化硅胶中，在超声条件下向其中缓慢滴加0.3mL6mol/L的醋酸，所得的混合液在常温条件下放置72h后，用N,N-二甲基乙酰胺和1,4-二氧六环交替洗涤，充分去除未反应的原料和杂质，洗干净的COF在60℃下真空干燥10h，最终获得橙黄色COF粉末。将得到的固体粉末用高纯水，乙醇，丙酮，三氯化碳分别洗涤3次，去除上层未连接到硅胶表面的COF，最终得到所需要的硅胶固定相。
4.3色谱柱的填装
将制得的COF修饰的硅胶固定相按照匀浆法(四氯化碳作为匀浆液，甲醇作为顶替液)装入清洗干净的不锈钢管色谱柱(4.6*150mm，5μm)中。称量2.5g COF修饰的硅胶加到100ml的烧杯中，接着加入50ml的四氯化碳。超声15min后快速倒入装柱机，打开泵，使压力迅速上升调整到25MP，保持10min，之后调整到40MP 40min后，关泵缓缓地降压。当压力降为零后，小心的卸下色谱柱，装上筛板与柱接头。标明方向(与装柱方向保持一致)，柱子填料的名称，色谱柱的尺寸以及装柱的日期。新装的色谱柱用甲醇以0.2ml/min的流速冲洗12h，之后缓慢的增加流速直至1ml/min，待柱压稳定后开始使用。
4.4大麻二酚标准物质的制备
称取60mg COF吸附剂装入固相萃取小柱中(3ml规格)，两端用聚丙烯筛板固定填料，制得标准化固相萃取柱。称取5.0g(精确到0.1g)发酵后的样品于50ml离心管中，加入50ml正己烷，涡旋混合2min；接着超声提取5min，6000r/min离心3min，取上清液于40℃水浴中氮吹至干。然后加入3ml甲醇，超声涡旋各1min，静置取上清液备用。COF固相萃取柱依次用3ml甲醇活化、3ml水平衡，取上述上清液过柱,弃去上清液，用3ml水淋洗固相萃取柱，然后用3ml丙酮溶液洗脱并超声30min，收集洗脱液，于40℃水浴氮气吹干，用流动相定容至1ml，滤液过0.22μm有机滤膜，即得到大麻二酚标准物质。用HPLC归一化法对大麻二酚标准物质进行均匀性、稳定性分析，采用质量平衡法进行定值,采用LC-MS法对有机杂质进行定性分析，电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机残留和水分等杂质的含量。最终确定制备的大麻二酚标准物质纯度范围为92.2％-98.5％。
实施例二：
1.实验材料的选择
选取工业大麻叶片，液氮速冻，保存于－80℃。
1.1工业大麻叶片组织的RNA提取及反转录
提取工业大麻叶片的总RNA，浓度为415.6ng/μl，经DNase I消化处理后，反转录合成cDNA，反转录时体系中加入0.8μg RNA。并以此为模板进行荧光定量PCR反应。
1.2CBDAS的荧光定量PCR
以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，复孔重复三次。使用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR中CBDAS的引物为:
CBDAS F：5’－ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT－3’
CBDAS R：5’－TTAATGACGATGCCGTGGAAG－3’
内参基因18S的引物为:
18S F：5’－CGCTCCTACCGATTGAATGG－3’
18S R：5’－CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC－3’
反应体系：
SYBR Green，Mix和引物混合物配制:
Mix 10μl
Primer F+R 1μl
SYBR Green(16μl)96孔板配制：
Mix+引物 8μl
cDNA 8μl
反应条件：40个循环
Figure BDA0003365853400000091
溶解曲线：
60℃ 60s
95℃ 30s
60℃ 15s
大麻植株中CBD合成酶活性有高低之分，进而决定了CBD的含量差异。CBDAS参与CBD合成酶的生物合成过程，进而产生大麻植物中的CBD，所以利用荧光定量PCR可对CBDAS进行定量分析。以内参基因作为衡量标准，利用2-ΔΔCt法计算得出大麻叶片中CBDAS相对表达量为7.0以上即可作为提取实验材料。
2大麻二酚粗提物的制备
2.1实验材料的预处理
选取工业大麻的叶片，洗净粉碎成叶片浆，于4℃储存备用。
2.2超声处理
取5.0g叶片浆样品与100mL质量分数为80％的甲醇溶液，置于250mL三角瓶中，进行超声处理。超声时间15min、超声功率为149W，该步骤制备的浆液为超声处理液。
2.3超声处理液真空蒸馏去除甲醇
真空度0.09MPa，蒸馏温度65℃，当超声处理液体积低于蒸馏前体积的30％即可停止蒸馏。
3工业大麻叶片的高分子纤维素的水解
3.1菌种的选择及培养基的制备
A菌—枯草芽孢杆菌CICC10089(Bacillus subtilis)培养基为：NaCl 5.0g，牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.2。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
B菌—地衣芽孢杆菌CICC10831(Bacillus licheniformis)培养基为：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0。经121℃灭菌15分钟冷却备用。
3.2复合菌直投式发酵剂的制备
3.2.1菌种的活化
分别取10mL 0.9％的生理盐水于2只试管内，经121℃灭菌15分钟冷却至30℃，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用。
3.2.2菌种的扩大培养
3.2.2.1母发酵剂的制备
分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内，121℃灭菌15分钟冷却至30℃，按培养基体积的10％接种3.2.1步骤中已经活化的菌种，在36℃培养箱内静止培养24h，作为母发酵剂。
3.2.2.2生产发酵剂的制备
分别取上述两种培养基，分装于2只500mL三角瓶内，每瓶200mL，121℃灭菌15分钟冷却至36℃，分别按2％体积比例接种母发酵剂，36℃培养24-28h，检测2株菌发酵液活菌数，各发酵液活菌数≥109个/mL，视同为发酵成熟，如果活菌数＜109个/mL，继续培养，直至达到109个/mL。
3.3粉末冻干菌种的制备
将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制备粉末冻干菌种。
3.4复合菌直投式发酵剂的制备
按各粉末冻干菌种重量，取A菌粉末5份，B菌粉末3份，充分混匀后制成复合菌直投式发酵剂，复合菌直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01％。
需要进一步说明的是：本发明中选用的菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，这些菌的活化、冻干方法不仅仅限于本发明所述的具体方法，培养基的成分也不限于此，其它常规技术和方法都是可以的，只要可以提高菌种的活力、并将其制备成冻干粉状而方便使用即可。
3.5复合菌直投式发酵剂水解工业大麻叶片中高分子纤维素
将经过2.3步骤处理获得的叶片浆按其重量的0.01％添加步骤3.4制备的复合菌直投式发酵剂，充分溶解后，36℃保温静止发酵24h。
4大麻二酚的纯化
4.1活化硅胶的制备
称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3＝v/v)，浸泡12h，在机械搅拌下回流24h除去金属离子，然后用G5砂芯漏斗过滤，用高纯水反复冲洗至中性，最后用丙酮洗涤两次，在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水，即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶，储于干燥器备用。
4.2COF修饰硅胶固定相
将180mg四-(4-氨基苯)乙烯和192.6mg 4,4'-联苯二甲醛溶解在9mL 1,4-二氧六环中，完全溶解后，加入到4.1制备的活化硅胶中，在超声条件下向其中缓慢滴加0.3mL6mol/L的醋酸，所得的混合液在常温条件下放置72h后，用N,N-二甲基乙酰胺和1,4-二氧六环交替洗涤，充分去除未反应的原料和杂质，洗干净的COF在60℃下真空干燥10h，最终获得橙黄色COF粉末。将得到的固体粉末用高纯水，乙醇，丙酮，三氯化碳分别洗涤3次，去除上层未连接到硅胶表面的COF，最终得到所需要的硅胶固定相。
4.3色谱柱的填装
将制得的COF修饰的硅胶固定相按照匀浆法(四氯化碳作为匀浆液，甲醇作为顶替液)装入清洗干净的不锈钢管色谱柱(4.6*150mm，5μm)中。称量2.5g COF修饰的硅胶加到100ml的烧杯中，接着加入50ml的四氯化碳。超声15min后快速倒入装柱机，打开泵，使压力迅速上升调整到25MP，保持10min，之后调整到40MP 40min后，关泵缓缓地降压。当压力降为零后，小心的卸下色谱柱，装上筛板与柱接头。标明方向(与装柱方向保持一致)，柱子填料的名称，色谱柱的尺寸以及装柱的日期。新装的色谱柱用甲醇以0.2ml/min的流速冲洗12h，之后缓慢的增加流速直至1ml/min，待柱压稳定后开始使用。
4.4大麻二酚标准物质的制备
称取60mg COF吸附剂装入固相萃取小柱中(3ml规格)，两端用聚丙烯筛板固定填料，制得标准化固相萃取柱。称取5.0g(精确到0.1g)发酵后的样品于50ml离心管中，加入50ml正己烷，涡旋混合2min；接着超声提取5min，6000r/min离心3min，取上清液于40℃水浴中氮吹至干。然后加入3ml甲醇，超声涡旋各1min，静置取上清液备用。COF固相萃取柱依次用3ml甲醇活化、3ml水平衡，取上述上清液过柱,弃去上清液，用3ml水淋洗固相萃取柱，然后用3ml丙酮溶液洗脱并超声30min，收集洗脱液，于40℃水浴氮气吹干，用流动相定容至1ml，滤液过0.22μm有机滤膜，即得到大麻二酚标准物质。用HPLC归一化法对大麻二酚标准物质进行均匀性、稳定性分析，采用质量平衡法进行定值,采用LC-MS法对有机杂质进行定性分析，电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机残留和水分等杂质的含量。最终确定制备的大麻二酚标准物质纯度范围为92.2％-98.5％。
荧光定量PCR中CBDAS的引物为:
CBDAS F：5’－ ATGAAGTGCTCAACATTCTTCT－3’
CBDAS R：5’－TTAATGACGATGCCGTGGAAG－3’
内参基因18S的引物为:
18S F：5’－CGCTCCTACCGATTGAATGG－3’
18S R： 5’－CCTTGTTACGACTTCTCCTTCC－3’

Claims (8)

1.一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：选取酚类物质基因相对表达量为7.0以上的工业大麻叶片并制浆，取5.0g该叶片浆样品与100mL质量分数80％的甲醇溶液，置于三角瓶中超声处理，时间15min、功率149W，然后在0.09MPa、65℃条件下，减压蒸馏除甲醇后备用，选取枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，制备复合直投式发酵剂，复合直投式发酵剂的添加量为发酵物料重量的0.01％，36℃静止发酵24h，发酵液经离心后取上清液经正己烷萃取后氮吹干燥，然后经甲醇溶解取上清液备用，制备表面均匀分布羟基的活化硅胶固相萃取柱，将上述上清液经固相萃取柱分离后,获得一种检测用大麻二酚标准物质,经检测纯度范围为92.2％-98.5％。
2.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：PCR反应体系和条件为：
反应体系：
SYBR Green，Mix和引物混合物配制:
Mix 10μl
Primer F+R 1μl
SYBR Green(16μl)96孔板配制：
Mix+引物 8μl
cDNA 8μl
反应条件：40个循环
Figure FDA0003365853390000011
溶解曲线：
60℃ 60s
95℃ 30s
60℃ 15s。
3.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：直投式发酵剂采用这样方法制备：分别取10mL 0.9％的生理盐水于2只试管内，经121℃灭菌15分钟冷却至30℃，将2株菌安瓶内的冻干菌粉末在无菌状态下全部倒入0.9％的生理盐水中，震荡使其溶解，在30℃恒温箱中静止活化30分钟，备用；分别取200mL上述两种培养基于2只500mL三角瓶内，121℃灭菌15分钟冷却至30℃，按培养基体积的10％接种2.2.1步骤中已经活化的菌种，在36℃培养箱内静止培养24h，作为母发酵剂；分别取上述两种培养基，分装于2只500mL三角瓶内，每瓶200mL，121℃灭菌15分钟冷却至36℃，分别按2％体积比例接种母发酵剂，36℃培养24-28h，检测2株菌发酵液活菌数，各发酵液活菌数≥109个/mL，视同为发酵成熟，如果活菌数＜109个/mL，继续培养，直至达到109个/mL；将成熟的生产发酵剂在无菌条件下导入玻璃安瓶中，液面高度低于1cm，加盖瓶塞后放入-30℃冰柜速冻，冻结后将玻璃安瓶用托盘乘装，放入冻干机进行冷冻干燥，制备粉末冻干菌种。
4.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：微生物发酵法制备叶片浆水解液：将叶片浆按其重量的0.01％添加复合菌直投式发酵剂，充分溶解后，36℃保温静止发酵24h。
5.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：活化硅胶采用这样方法制备：称取6.0g多孔硅胶浸入120ml盐酸/水(1:3＝v/v)，浸泡12h，在机械搅拌下回流24h除去金属离子，然后用G5砂芯漏斗过滤，用高纯水反复冲洗至中性，最后用丙酮洗涤两次，在70℃条件下真空干燥10h除去表面溶剂和水，即得到表面均匀分布羟基的活化硅胶。
6.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：COF修饰硅胶固定相采用这样方法制备：将180mg四-(4-氨基苯)乙烯和192.6mg 4,4'-联苯二甲醛溶解在9mL 1,4-二氧六环中，完全溶解后，加入到4.1制备的活化硅胶中，在超声条件下向其中缓慢滴加0.3mL 6mol/L的醋酸，所得的混合液在常温条件下放置72h后，用N,N-二甲基乙酰胺和1,4-二氧六环交替洗涤，充分去除未反应的原料和杂质，洗干净的COF在60℃下真空干燥10h，最终获得橙黄色COF粉末；将得到的固体粉末用高纯水，乙醇，丙酮，三氯化碳分别洗涤3次，去除上层未连接到硅胶表面的COF，最终得到所需要的硅胶固定相。
7.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：色谱柱采用这样方法填装：将制得的COF修饰的硅胶固定相按照匀浆法(四氯化碳作为匀浆液，甲醇作为顶替液)装入清洗干净的不锈钢管色谱柱(4.6*150mm，5μm)中，称量2.5g COF修饰的硅胶加到100ml的烧杯中，接着加入50ml的四氯化碳，超声15min后快速倒入装柱机，打开泵，使压力迅速上升调整到25MP，保持10min，之后调整到40MP 40min后，关泵缓缓地降压。当压力降为零后，小心的卸下色谱柱，装上筛板与柱接头；标明方向(与装柱方向保持一致)，柱子填料的名称，色谱柱的尺寸以及装柱的日期；新装的色谱柱用甲醇以0.2ml/min的流速冲洗12h，之后缓慢的增加流速直至1ml/min，待柱压稳定后开始使用。
8.根据权利要求1所述一种检测用大麻二酚标准物质的制备方法，其特征是：大麻二酚采用这样方法纯化：称取60mg COF吸附剂装入固相萃取小柱中(3ml规格)，两端用聚丙烯筛板固定填料，制得标准化固相萃取柱；称取5.0g(精确到0.1g)发酵后的样品于50ml离心管中，加入50ml正己烷，涡旋混合2min；接着超声提取5min，6000r/min离心3min，取上清液于于40℃水浴中氮吹至干；然后加入3ml甲醇，超声涡旋各1min，静置取上清液备用；COF固相萃取柱依次用3ml甲醇活化、3ml水平衡，取上述上清液过柱，待上清液流出后，用3ml水淋洗固相萃取柱，最后用3ml丙酮溶液洗脱并超声30min，收集洗脱液，于40℃水浴氮气吹干，用流动相定容至1ml，滤液过0.22μm有机滤膜，即得到大麻二酚标准物质。用HPLC归一化法对大麻二酚标准物质进行均匀性、稳定性分析，采用质量平衡法进行定值,采用LC-MS法对有机杂质进行定性分析，电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机残留和水分等杂质的含量。最终确定制备的大麻二酚标准物质纯度范围为92.2％-98.5％。
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