CN113832196B - 生物酶催化的手性2,3-蒎烷二醇的合成 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机合成、精细化学品、医药中间体领域,具体涉及一种生物酶催化的手性2,3‑蒎烷二醇的合成方法。该方法使用商业化的α‑蒎烯为原料,以双加氧酶为催化剂,实现2,3‑蒎烷二醇的高选择性合成。该生物酶催化的方法,条件温和,操作简便,污染小,绿色安全,无金属残留,产物的非对映异构体比例高,特别适合医药和化妆品活性物的合成,具有良好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于有机合成、精细化学品、医药中间体领域,具体涉及一种生物酶催化的手性 2,3-蒎烷二醇的合成方法。
背景技术
蒎烷二醇是一种双环单萜二醇,已被证明可诱导S91黑色素瘤和PC12嗜铬细胞瘤细胞 分化,从而提供可能的治疗和非日光晒黑使用。另外,手性2,3-蒎烷二醇还是合成一类蛋白 酶抑制剂的重要中间体。
目前,恶性肿瘤仍然是威胁人们生命的主要疾病之一,从肿瘤死亡率看,我国每年肿瘤 患者死亡率全国合计约每十万人有119.54人死于肿瘤病因,也就是说全国肿瘤死亡人数每年 约有154万人。癌症的治疗目前虽然已经取得了很大的进步,但还未能从根本上得到彻底治 愈癌症患者。目前上市的抗癌药物虽然有一定的疗效,但它们大多是细胞毒药物,具有严重 的副作用,因此如何从有效的肿瘤靶点出发来研究靶向性的新型抗癌药物成为当务之急。
泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway,简称UPP)能够调控参与细胞周期控制 的蛋白质的水平,这一途径与癌症、心脑血管疾病及神经系统退行性疾病的发病都有重要关 系。使用一些有效的抑制剂来抑制这一途径过度降解重要蛋白质将会为上述疾病的治疗提供 新的思路。
手性2,3-蒎烷二醇正是合成这一蛋白酶抑制剂的重要中间体。随着人们对抗癌药物的研 发和生产的日益重视,手性2,3-蒎烷二醇的市场需求量也在逐年增加,价格也逐渐升高。
现阶段,制备手性2,3-蒎烷二醇的方法主要有以下几种:
1、α-蒎烯在四氧化锇的作用下,生成2,3-蒎烷二醇。此方法需要用到剧毒物质四氧化 锇,因四氧化锇易挥发,使用时对人体和环境危害性较大。
2、以脯氨酸硼酯为原料,用拆分剂将其分解为2,3-蒎烷二醇,或α-羟基酮为原料合成 2,3-蒎烷二醇,这两种方法所用的原料价格都很贵,合成成本高。
3、以α-蒎烯为原料,用高锰酸钾氧化生成2,3-蒎烷二醇,但该类方法往往收率很低, 产品的纯度和对映体纯度都不高。
本发明提供一种生物酶催化的手性2,3-蒎烷二醇的合成方法。该方法的特点在于以α- 蒎烯为原料,在双加氧酶催化下,实现手性2,3-蒎烷二醇的高选择性、高效合成。该生物酶 催化的方法,条件温和,操作简便,污染小,绿色安全,无金属残留,产物的非对映异构体 比例高,特别适合医药和化妆品活性物的合成,具有良好的工业应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物酶催化的手性2,3-蒎烷二醇的合成方法,手性2,3-蒎 烷二醇的结构式为选用已经在市场上商业化的α-蒎烯为起 始原料,加入含双加氧酶的水相缓冲溶液,发生反应,得到最终产物手性2,3-蒎烷二醇,该 方法原料易得,价格便宜,反应条件温和,无金属残留,工艺条件稳定,操作简单,产品纯 度和对映体纯度较高,适用于规模化生产,是一种简单易行绿色环保的方法。
本发明的技术方案:一种生物酶催化的手性2,3-蒎烷二醇的合成方法,其特征在于具体 步骤如下:在反应容器中依次加入所述的水相缓冲溶液、α-蒎烯和双加氧酶,搅拌均匀,在 25-4℃和氮气吹扫的条件下,HPLC检测反应进程,当转化率达90-99%时,调节反应体系 pH至2-3,硅藻土过滤,并在滤液中加入乙酸乙酯进行多次萃取,旋转蒸发脱去溶剂后得到 手性2,3-蒎烷二醇,其结构式为
优选地,所述双加氧酶的基因来自高温单胞菌属Thermomonospora curvata,通过连接质 粒pET-28a构建表达载体,并转化进入表达菌E.coli BL21(DE3)中表达得到。
优选地,在起始反应体系中,所述α-蒎烯和双加氧酶的投料质量比为1:(0.05~0.2)。
优选地,所述的缓冲溶液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液,pH为9.0~10.0。
优选地,具体实施过程如下:在反应容器中依次加入所述的水相缓冲溶液、α-蒎烯和双 加氧酶,搅拌均匀,在25-45℃和氮气吹扫的条件下,HPLC检测反应进程,当转化率达90-99% 时,调节反应体系pH至2-3,硅藻土过滤,并在滤液中加入乙酸乙酯进行多次萃取,旋转蒸 发脱去溶剂后得到手性2,3-蒎烷二醇。
由于上述技术方案的运用,本发明与现有技术相比具有下列优点:本发明采用了生物酶 催化的方法,底物稳定性好,酶转化率高,产物的非对映异构体比例高,条件温和,操作简 便,污染小,绿色安全,无金属残留,且产物的纯度高,特别适合医药和化妆品活性物的合 成。
附图说明
图1为样品色谱图
具体实施方式
实施例1(培养基与试剂配置)
(1)Luria-Bertani(LB)培养基:Tryptone 10g·L-1,Yeast extract 5g·L-1,NaCl 10 g·L-1,Agarose 20g·L-1(固体培养基用),5.0mol·L-1NaOH调pH至7.0(约加入1‰ 的量),121℃灭菌20min.
(2)50mg·mL-1氨苄青霉素溶液(Amp):1g氨苄青霉素溶于20mL灭菌去离子水,用0.22μm 滤膜(Agela)过滤除菌,分装至灭菌eppendorf管,每只1mL,-20℃保存备用。使用前,加 入1‰的量,即终浓度为50μg·mL-1。
(3)50mg·mL-1卡那霉素溶液(Kan):1g卡那霉素溶于20mL灭菌去离子水,用0.22μm滤膜(Agela)过滤除菌,分装至灭菌eppendorf管,每只1mL,-20℃保存备用。使用前, 加入1‰的量,即终浓度为50μg·mL-1。
(4)200mg·mL-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG):2g IPTG溶于灭菌去离子水,用0.22 μm滤膜过滤除菌,分装至灭菌eppendorf(EP)管,每只1mL,-20℃保存备用。
(5)蛋白质电泳电级缓冲液:3g三羟甲基氨基甲烷(Tris),14.4g甘氨酸,1.0gSDS, pH=8.3,用去离子水定容至1L,室温保存。
(6)蛋白质电泳染色缓冲液:2.5g考马斯亮蓝R250,454mL无水乙醇,46mL冰醋酸,454mL去离子水,搅拌使充分溶解,抽滤出去颗粒。室温避光保存。
(7)蛋白质电泳脱色液:50mL无水乙醇,75mL冰醋酸,875mL去离子水,混匀,须 现配现用。
(8)16%SDS-PAGE分离胶(10mL):3.3mL去离子水,4mL Acr(40%),2.5mL 1MTris-HCl(pH 8.8),100μL 10%SDS,100μL 10%APS,10μL TEMED。
(9)5%SDS-PAGE浓缩胶(5ml):2.42mL去离子水,0.5mL Acr(40%),1.0mL,0.5MTris-HCl(pH 6.8),40μL 10%SDS,40μL 10%APS,5μL TEMED。
(10)甘氨酸-氢氧化钠缓冲液:分别配制200mM甘氨酸溶液与200mM氢氧化 钠溶液,混合成pH为9和10的缓冲液,稀释使得终浓度50mM。
实施例2(目的基因的扩增)
在NCBI数据库中通过数据检索,从基因组T.curvata(DSM43183)中获取了目的基因序列, 并以其为模板通过引物设计软件Primer 5.0设计了引物。引物序列如下:
Sense primer:5'-TTGAGGAGAATTCGTGACGTTGATCCGAG-3'(SEQ ID No.1)
Anti-sense primer:5'-TATAACTCGAGTCACTTGGTCGGGGGGAT-3'(SEQ ID No.2)
上游引物内切酶位点为EcoR Ⅰ,下游引物内切酶位点为Xho I
设计引物并进行PCR操作,PCR操作时,采用100μL的总反应体系,体系组成如下
组分 | 体积(μL) |
5×PS Buffer | 20 |
基因组DNA | 4 |
dNTPs(脱氧核糖核苷酸三磷酸) | 8 |
上游引物 | 2 |
下游引物 | 2 |
Prime star | 1 |
DMSO | 5 |
去离子水 | 58 |
PCR条件:①预变性98℃,5min;
②变性94℃,30s;退火45~55℃,5s;延伸72℃,56s;循环30次;
③延伸72℃,5min;
④4℃,1h(此阶段可随时终止PCR)。
实施例3(重组质粒的构建)
使用限制性核酸内切酶EcoR I和Xhol I对双加氧酶基因进行双酶切,反应体系如下:
按照比例混合均匀,置于37℃恒温培养箱酶切5h,用DNA纯化回收试剂盒进行溶液回收 并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测回收结果,详细步骤参见试剂盒,回收的双酶切产物置于-20℃ 冰箱保存。
同样使用限制性核酸内切酶EcoR I和Xhol I对pET28a质粒进行双酶切,体系如下:
按比例混合后,置于37℃下酶切3h后,再向体系中加入0.5μL Fast AP与5.5μLFast AP Buffer,进行去磷酸化,反应0.5h。用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测质粒酶切结果,DNA纯化 回收试剂盒进行回收,详细步骤参见试剂盒,回收产物置于-20℃冰箱保存。
用T4DNA连接酶对双酶切后回收的质粒片段和目的基因进行连接,体系如下:
基因和质粒按照5:1的浓度比加入体系中,25℃条件下连接酶反应0.5h。连接后的产物 可直接转化感受态细胞。
感受态细胞的制备:
(1)接取10μL待复苏菌种于6mL LB培养基中,过夜培养
(2)将培养产物转接大瓶LB培养基中,37℃培养2h至OD600约为0.4左右,于超净台中用离心筒收集菌液,高速冷冻大容量离心机5000rpm 8min离心。
(3)于超净台中弃去上清液,加入25mL冰浴预冷的0.1M CaCl2溶液,冰浴30min。
(4)再进行5000rpm×10min离心,弃上清。
(5)加入2~3mL冰浴预冷的0.1M CaCl2-50%甘油1:1混合液重悬菌体,每管100μL分 装于1.5mL Ep管中,保存于-70℃超低温冰箱。
重组质粒转化
将冷藏于超低温冰箱的每管约100μL的克隆菌感受态细胞E.coli DH5α拿出,立即放置冰 盒中冰浴5min,在超净工作台中向感受态细胞加入连接产物,冰浴30min。接着42℃水 浴热激90s,随后在超净台中向其中加400μL已灭菌的LB培养基,置于37℃摇床150rpm转速震荡培养45min。
培养后的菌液用离心机4000rpm,6min温和离心,而后在超净台中将大部分上清液倒掉, 剩余小部分将菌体涂布于含1/1000卡那霉素(Kan)的LB平板上,37℃恒温箱倒置培养过 夜。
实施例4(菌种的诱导表达及保存)
(1)双加氧酶的诱导
挑取过夜培养的菌种,待其过夜摇菌后加入1‰的抗性卡那霉素以及1%的过夜培养菌种, 37℃、220rpm振荡培养至OD600值为0.6-0.8后,加入36μL的IPTG诱导剂(异丙基-β-D- 硫代吡喃半乳糖苷),再迅速降温到22℃,以180rpm的振荡速度连续振荡培养15h。
(2)诱导产物的保存
首先将诱导后的酶液平均分成四小管,在8000rpm,5min条件下离心,去掉上清液,在试 管中加入4mL的水,进行重旋和超声波破壁,在10000rpm,20min条件下离心操作后,通过过滤得到上清液,放置在-20℃条件下保存。
实施例5(酶蛋白的纯化)
重组菌因构建在pET-28a中,产生的目标蛋白带有His-tag标签,因此目的蛋白(双加氧 酶)可以采取镍柱进行亲和层析纯化。具体纯化过程如下。
(1)冲洗:在进行纯化前先用低浓度咪唑以v=1000μL/min冲洗镍柱1小时。
(2)过滤:将实施例4破壁及离心后的菌液加入带有0.22μm过滤膜的50mL注射器中, 滤液过滤至离心管,准备上样。
(3)上样:上样前先用止水夹夹住橡皮管,后暂停仪器,将已过滤好的上清液代替低浓度 咪唑,调节流速至v=239μL/min,再开启机器,打开止水夹进行上样。注意计算好上样的 时间,防止柱子吸空影响纯化。
(4)静置:待上样完全,夹紧止水夹,关闭开关,静置1小时,让酶吸附充分。
(5)冲洗蛋白:用低浓度咪唑以v=1000μL/min冲洗柱子,观察核酸蛋白检测仪的读数 从而判断杂蛋白是否洗脱干净。待冲洗干净后,换高浓度咪唑进行冲洗,观察核酸蛋白显示 仪指数,收集高浓度蛋白。
(6)透析:将收集好的蛋白置于透析袋中,在纯净的冰水中进行透析。每隔3h换一次水, 一共透析12h。
实施例6(2,3-蒎烷二醇的合成)
于100mL三口烧瓶中,依次加入0.1M pH 9.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液40mL,α-蒎烯 4克、双加氧酶0.2克,于25℃,200rpm搅拌桨搅拌,0.01MPa氮气吹扫的条件下,反应24h,HPLC检测转化率95%。加入盐酸调节pH至2-3,硅藻土过滤,加入等体积乙酸乙酯萃取两次,旋转蒸发得到产物2,3-蒎烷二醇3.8克。
实施例7(2,3-蒎烷二醇的合成)
于100mL三口烧瓶中,依次加入0.1M pH 10.0甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液40mL,α-蒎 烯4克、双加氧酶0.5克,于25℃,200rpm搅拌桨搅拌,0.01MPa氮气吹扫的条件下,反应24h,HPLC检测转化率95%。加入盐酸调节pH至2-3,硅藻土过滤,加入等体积乙酸乙酯 萃取两次,旋转蒸发得到产物2,3-蒎烷二醇3.9克。
实施例8(所合成2,3-蒎烷二醇的非对映异构体比例的测定)
1.1仪器和设备
高效液相色谱仪(HPLC),四元泵,自动进样器,柱温箱,蒸发光散射检测器(ELSD)。分析天平,精度0.1mg,超声波清洗器,移液器,容量瓶10mL。
1.2试剂和材料
流动相的配制:超纯水。
1.3分析步骤
1.3.1样品处理
1.3.1.1供试品溶液配制:
精密称取上述实施例制备的2,3-蒎烷二醇100.00mg(精确至0.01mg),置于10mL容量瓶中,用超纯水超声溶解并稀释至刻度,0.45μm过滤膜过滤。
1.3.2色谱条件
色谱柱:ASTEC Chirobiotic T手性柱786615(0.46mm×250mm,5μm)
柱温:35℃;
流速:0.5mL/min
流动相:A乙腈,B水
洗脱程序:0-20min,95%A-5%B等度洗脱
1.3.3测定
取供试品溶液5μL注入高效液相色谱仪,记录色谱图如附图1所示,按外标法以峰面积 大概计算(1R,2R,3S,5R)和(1R,2S,3R,5R)非对映异构体的含量,结果如下所示:
Peak Results
Name | RT | Area | Height | Amount | Units | |
1 | 42.639 | 19558 | 754 | |||
2 | 44.240 | 1129 | 37 |
其中(1R,2R,3S,5R)构型的非对映异构体含量达95%,表明本发明提供的合成方法具有优 异的非对映选择性。
序列表
<110> 镇江中智化学科技有限公司
<120> 生物酶催化的手性2,3-蒎烷二醇的合成
<130> 2021
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttgaggagaa ttcgtgacgt tgatccgag 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tataactcga gtcacttggt cggggggat 29
Claims (3)
1.一种生物酶催化的手性2,3-蒎烷二醇的合成方法,其特征在于具体步骤如下:在反应容器中依次加入所述的水相缓冲溶液,pH为9 .0~10.0,α-蒎烯和双加氧酶,搅拌均匀,在25-45℃和氮气吹扫的条件下,HPLC检测反应进程,当转化率达90-95%时,调节反应体系pH至2-3,硅藻土过滤,并在滤液中加入乙酸乙酯进行多次萃取,旋转蒸发脱去溶剂后得到手性2,3-蒎烷二醇,其结构式为或/>,所述双加氧酶的基因来自高温单胞菌属 Thermomonospora curvata,通过连接质粒 pET-28a 构建表达载体,并转化进入表达菌 E.coli BL21(DE3)中表达得到,所述双加氧酶的基因序列以Thermomonosporacurvata DSM43183菌株的基因组为模板通过引物设计软件 Primer 5.0 设计引物,PCR扩增获得,引物序列如下:
Sense primer:5'-TTGAGGAGAATTCGTGACGTTGATCCGAG -3'
Anti-sense primer:5'-TATAACTCGAGTCACTTGGTCGGGGGGAT -3'。
2.根据权利要求1所述一种生物酶催化的手性2,3-蒎烷二醇的合成方法,其特征在于,在起始反应体系中,所述α-蒎烯和双加氧酶的投料质量比为1:(0.05~0.2)。
3.根据权利要求1所述一种生物酶催化的手性2,3-蒎烷二醇的合成方法,其特征在于,所述的缓冲溶液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。
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