CN113430290B - 检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用 - Google Patents

检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于烟草黑胫病检测技术领域。针对烟草黑胫病菌检测难度大的问题，本发明提供一种基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用、检测烟草黑胫病菌的PCR引物对、试剂盒及方法。探针基因如SEQ ID NO:1所示；引物对如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。提取发病烟草的基因组DNA，通过PCR克隆该特异基因，如果能克隆到目的片段，则说明是黑胫病菌侵染，如果不能克隆到目的片段，则说明不是黑胫病菌侵染。

Description

检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用
技术领域
本发明属于烟草黑胫病检测技术领域，具体涉及一种检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用。
背景技术
烟草黑胫病是烟草上的重要根茎病害，给烟草生产造成巨大损失。在大田中烟草上的根部病害主要有黑胫病、青枯病、根黑腐病等。其中黑胫病属于卵菌病害，青枯病属于细菌病害，根黑腐病属于真菌病害。由于这几种病害的症状相似，难于辨别，给病害防治造成很大困难。传统的病害鉴定常以生物学鉴定为主，过程复杂，准确度差。本发明运用分子生物学技术对对田间黑胫病进行鉴定，提高了病害鉴定的准确性和效率。
发明内容
针对烟草黑胫病菌检测难度较大的上述问题，本发明提供一个基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用、检测烟草黑胫病菌的PCR引物对、试剂盒及方法。本发明的目的基因只在黑胫病菌基因组内存在，可以作为检测黑胫病的探针基因；根据目的基因序列设计引物，提取发病烟草的基因组DNA，通过PCR克隆该特异基因，如果能克隆到目的片段，则说明是黑胫病菌侵染，如果不能克隆到目的片段，则说明不是黑胫病菌侵染。
本发明是通过以下步骤实现的：
一个基因片段在检测烟草黑胫病菌中作为探针基因的应用，所述基因片段如SEQID NO:1所示。
本发明还提供一种检测烟草黑胫病菌的PCR引物对，其正向引物序列如SEQ IDNO:2所示；反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供一种检测烟草黑胫病菌的试剂盒，包括权利要求2所述的引物对。
进一步的，所述试剂盒还还包括Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs和ddH2O。
本发明还提供一种检测烟草黑胫病菌的方法：从烟草植株上刮取发病组织，提取DNA，以所提取的DNA为模板，利用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，若出现540bpDNA条带，则待测样本为烟草黑胫病菌。
进一步的，上述方法的PCR扩增反应条件为：94℃变性1min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。
本发明通过烟草黑胫病菌一个特异基因(SEQ ID NO:1)可以有效鉴别黑胫病菌，该基因只在黑胫病菌中表达，青枯病和根黑腐病菌基因组里都不包含该基因。
本发明的引物对的扩增特异性好，扩增产物干净杂带少，电泳检测时间短，条带清晰好判断。
附图说明
图1为探针基因在不同物种基因组DNA中的检测情况，1-烟草黑胫病菌；2-烟草青枯病菌；3-烟草根黑腐病菌；4-烟草品种K326；5-烟草品种革新3号；6-烟草花叶病毒(TMV，侵染烟草，引起花叶病毒病)；7-黄瓜花叶病毒(CMV，侵染烟草，引起花叶病毒病)；
图2为应用例PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例
(一)实验所用材料
烟草黑胫病菌，烟草青枯病菌，烟草根黑腐病菌，烟草品种K326，烟草品种革新3号，烟草TMV，烟草CMV
(二)实验所用试剂和仪器
北京全式金公司真菌DNA提取试剂盒、北京全式金公司细菌DNA提取试剂盒、北京全式金公司植物DNA提取试剂盒、10×PCR Buffer、dNTP Mix、PCR polymorase、loadingbuffer、DNA marker、移液器(0.1μl-1000μl)、Eppendorf台式离心机、Milli-Q超纯水机、GRANT SUB Aqua Plus数字控温水浴锅、SANYO SIM-F140 AY65制冰机和TOMY SS-325自动灭菌锅、Applied Biosystems的VeritiTM多重控温PCR仪、BIO-RAD电泳槽及电压仪、普通冰箱等。
(三)目的基因HJR1204的序列(SEQ ID NO:1)：
ATGCGGTTTTACTACACCCTGCTTGCAACTGTAGCCGCACTTCTGGTCCACAGCAATGCTTTACCGGCAGCGGCAGAAACTAGCCTGAACCAGTTGACAGCAGTCGATGGGGCCACCACCACGAGTCAGCGCTTTTTACGTCGACACATCGATTCGGAAACTACGGACAACGAGGAACGGCTTAACTCGGGCCCCATCGTCCTCGATACCGCTAAGAAGATCGACGACTTATTCGAAGTCGAAAAGCTCGACAAAATTCTCGACCCCAAAATGGCCGACAAATTCCTGGATGGGAAGACGTTTTTTGGCTGGTTGGATAAGAGCGCACTTGATGAGGCCCTTAACGGGAACATCGCCCAGAAGACGAAAGTTTTCGAGCATTGGCGTGAGAAAAGATTGAGACCGAAGGCGTTAACCAAGGTCCTCACAACCGATCCCGCCGTAAGAAAGAAGTACAAGTTTGTCTACGAAATGTACGACAGCTACATCAAATACGTAGCACGGAAAAAACTTTCTGGTCTTAAGAGAAACAGAGGTGACTAG
步骤1：设计引物如下：
5′引物：5’ATGCGGTTTTACTACACCCT 3’(SEQ ID NO:2)；
3′引物：5’CTAGTCACCTCTGTTTCTCT 3’(SEQ ID NO:3)。
步骤2、烟草黑胫病菌基因组DNA的提取
刮取燕麦培养基上培养14天的烟草黑胫病菌菌丝，利用北京索莱宝公司真菌DNA提取试剂盒提取烟草黑胫病DNA。具体步骤如下：
1、样品的处理：取50-100mg烟草黑胫病菌菌丝，倒入适量的液氮，立即研磨重复3次，使样品研成粉末，加200ul溶液A，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡，约5min。
2、加入20ul 10mg/ml的蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴消化，30min。消化期间可颠倒离心管混匀数次，12000rpm离心2min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。
3、在上清中加入200ul溶液B，充分混匀。如出现白色沉淀，可放55℃水浴5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的DNA量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，增加消化时间。
4、再加入200ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2分钟。
5、12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
6、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前确保已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
7、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8、12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验，如酶切、PCR等。
9、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心1min。
10、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。
参照上述方法，利用试剂盒分别提取烟草青枯病基因组DNA，烟草根黑腐病菌基因组DNA，烟草品种K326基因组DNA，烟草品种革新3号基因组DNA，烟草TMV基因组DNA，烟草CMV基因组DNA。
步骤3、PCR扩增目的基因
分别以提取的7个基因组DNA为模板，应用设计的特异性引物通过PCR来扩增目的基因。
PCR反应体系：
Figure BDA0003114381960000041
总体积50μl，反应条件如下：94℃变性1min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min；4℃保温。得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增得到的目的片段。
步骤4、通过凝胶电泳检测
制备70毫升1％琼脂糖凝胶：称取0.7克琼脂糖置于锥型瓶中，加入70毫升1XTAE，微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，加入1微升核酸染色剂，即成1.0％琼脂糖凝胶液，然后倒入制胶板，插入梳子，冷却凝固后即可用来使用。将制好的胶放入电泳槽中，添加1XTAE，电泳缓冲液至没过胶为止。
将7个PCR反应产物用移液枪加入上样孔，每个样品加7μl，marker为全式金生物技术有限公司的Trans2K Plus DNA Marker,180V跑15分钟后，取出凝胶在凝胶成像系统进行观察拍照。
凝胶电泳检测结果显示(图1)，只有以黑胫病菌DNA为模板的PCR产物检测到了目的基因片段，大小为540bp,其他6个都没有扩增到目的基因，证明了该目的基因只在黑胫病菌基因组内存在，在其他6个基因组内都不存在，可以作为检测黑胫病的探针基因。
应用例
从田间随机选取10株表现茎秆发黑，叶片枯萎症状的烟草植株，将10个样品分别编号为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10；用镊子小心刮取发病组织，提取DNA。用所提DNA为模板，引物为：5’ATGCGGTTTTACTACACCCT 3’和5’CTAGTCACCTCTGTTTCTCT 3’，进行PCR扩增，并将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，具体步骤参照实施例所述。
凝胶电泳结果如图2所示。从图2中可以看出，样品3，5，7，8，9中有黑胫病菌感染，而样品1，2，4，6，10中则未检测到黑胫病菌。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所）
<120> 检测烟草黑胫病的探针基因、引物对、试剂盒及应用
<141> 2021-06-08
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 543
<212> DNA
<213> Phytophthora parasitica
<400> 1
atgcggtttt actacaccct gcttgcaact gtagccgcac ttctggtcca cagcaatgct 60
ttaccggcag cggcagaaac tagcctgaac cagttgacag cagtcgatgg ggccaccacc 120
acgagtcagc gctttttacg tcgacacatc gattcggaaa ctacggacaa cgaggaacgg 180
cttaactcgg gccccatcgt cctcgatacc gctaagaaga tcgacgactt attcgaagtc 240
gaaaagctcg acaaaattct cgaccccaaa atggccgaca aattcctgga tgggaagacg 300
ttttttggct ggttggataa gagcgcactt gatgaggccc ttaacgggaa catcgcccag 360
aagacgaaag ttttcgagca ttggcgtgag aaaagattga gaccgaaggc gttaaccaag 420
gtcctcacaa ccgatcccgc cgtaagaaag aagtacaagt ttgtctacga aatgtacgac 480
agctacatca aatacgtagc acggaaaaaa ctttctggtc ttaagagaaa cagaggtgac 540
tag 543
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgcggtttt actacaccct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ctagtcacct ctgtttctct 20

Claims (4)

1.一个基因片段在制备检测烟草黑胫病菌的试剂盒中的应用，其特征在于，所述基因片段如SEQ ID NO:1所示，所述试剂盒包括PCR引物对，所述PCR引物对包含的正向引物序列如SEQ ID NO:2所示；反向引物序列如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，从烟草植株上刮取发病组织，提取DNA，以所提取的DNA为模板，进行PCR扩增，并将PCR产物进行凝胶电泳，若出现543bpDNA条带，则待测样本为烟草黑胫病菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，PCR扩增反应条件为： 94°C变性1min；94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸50s，35个循环；72°C延伸10min；4°C保温。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括Taq DNA 聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs 和ddH2O。
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