CN110205319B

CN110205319B - 一种简单有效提取植物病原真菌基因组dna的试剂和方法

Info

Publication number: CN110205319B
Application number: CN201910648326.8A
Authority: CN
Inventors: 赵爱春; 张帅; 朱攀攀; 寇敏; 刘长英; 郑莎
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-07-18
Also published as: CN110205319A

Abstract

本发明公开了一种简单有效提取植物病原真菌基因组DNA的试剂和方法，提取试剂包括溶液A和溶液B提取，其中溶液A各组分的浓度如下：200mM Tris‑HCl(pH8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5wt％SDS，1wt％β‑巯基乙醇，RNA酶8μL；溶液B为浓度5M醋酸钾；使用该试剂提取能够快速、有效地提取到纯度高、稳定性好的基因组并且可直接用于基因克隆以及基因组测序，为病原真菌分子生物学研究提供了一种高效可行的分子检测途径。

Description

一种简单有效提取植物病原真菌基因组DNA的试剂和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种简单有效提取植物病原真菌基因组DNA的方法。

背景技术

蚕桑产业在我国已有5000多年的历史，为中华民族经济发展和丝绸文化传播作出了巨大的贡献。作为桑树的果实-桑椹，由于它具有丰富的营养价值和药用价值被列为“药食同源果品”，近些年来成为食品加工业所重视的热点。但桑椹在生长成熟过程中，容易受到病虫害的侵害，导致产量与品质的下降。在西南地区，尤以桑椹肥大性菌-桑实杯盘菌的危害最为严重，桑椹一旦染病，会导致果桑大面积减产，给种植者带来巨大的经济损失。

为了尽可能减轻菌核病带来的危害，在分子生物学水平上研究桑实杯盘菌侵染桑椹的机制是极为迫切的。基因组DNA的提取是进行分子水平研究的基础，采用快速高效的提取方法就变得尤为重要。由于真菌具有坚硬的细胞壁结构，且含有各种复杂的多糖，一般会使得提取真菌基因组DNA过程繁琐且杂质较多。

公开号为CN109666671A的中国专利公开了提取植物病原真菌DNA的方法，该方法步骤简单，快速，但是该方法并不适用于桑椹病原真菌基因组DNA的提取。而且，传统的DNA提取方法如SDS和CTAB法操作步骤复杂、消耗时间过长、DNA质量不稳定，试剂盒法开支较大。因此，急需一种建立能够有效地去除蛋白质、多糖等杂质，快速使核酸分离出来的DNA提取试剂和提取方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种简单有效提取植物病原真菌基因组DNA的试剂；本发明的目的之二在于提供利用所述的试剂提取植物病原真菌基因组DNA的方法，该方法可提取到高浓度并适合分子检测的基因组DNA，具有耗时短、易操作、成本低等优点。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种简单有效提取植物病原真菌基因组DNA的试剂，包括溶液A和溶液B，所述溶液A各组分的浓度如下：pH8.0、200mM Tris-HCl，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5wt％SDS，1wt％β-巯基乙醇，RNA酶RNA酶8μg/ml；所述溶液B为浓度5M醋酸钾。

优选的，还包括异丙醇和体积分数为75％的乙醇。

2、利用所述的试剂提取植物病原真菌基因组DNA的方法，包括如下步骤：

(1)取提取材料，用液氮研磨至粉末状，然后加入溶液A，混匀，静置；

(2)向步骤(1)的溶液中加入溶液B，混匀，静置后离心收集上清；

(3)取步骤(2)离心所得上清，然后加入等体积的异丙醇，混匀，静置后离心收集沉淀；

(4)将步骤(3)所得沉淀用体积分数为75％的乙醇洗涤，离心收集沉淀，待乙醇挥发后加入水溶解。

本发明步骤(1)中，所述溶液A的加入量按每0.1g组织材料加入300μL溶液A。

本发明步骤(1)中，所述混匀为涡旋震荡1～2分钟，所述静置为静置10min。

本发明步骤(1)中，所述提取材料为桑椹肥大性菌核病-桑实杯盘菌。

本发明步骤(2)中，所述静置为静置10分钟，所述离心为12000rpm离心5min。

本发明步骤(3)中，所述静置为静置2min，所述离心为12000rpm离心5min。

本发明步骤(3)中，在加入等体积异丙醇后，在冰上静置2min。

本发明步骤(4)中，所述离心为12000rpm离心5min。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种简单有效提取植物病原真菌基因组DNA的方法，与现有的方法相比，具有如下优点：

(1)快速而高效地提取大量基因组DNA，总时长可控制在一个小时以内；

(2)提取基因组DNA纯度高，完整性和稳定性好，适合直接用于分子检测。OD值均在1.8～2.1之间，浓度在500～1000ng/μL。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为本发明方法提取的桑实杯盘菌基因组DNA电泳示意图，1-7桑实杯盘菌菌丝体DNA，上样量3μL。

图2为利用本发明方法提取的桑实杯盘菌基因组DNA对18S LSU rRNA序列进行扩增，序列全长为612bp，1-7桑实杯盘菌菌丝体DNA，上样量10μL。

图3为分别利用NanaDrop2000超微量分光光度计对实施例1和对比实施例方法提取的桑实杯盘菌基因组进行浓度与质量检测(a、b、c为实施例1方法提取结果，d、e、f为对比实施例提取结果)。

图4为实施利1和对比实施例的方法提取的桑实杯盘菌基因组DNA电泳示意图；a、b、c为利用实施例1方法提取的基因组示意图；d、e、f为对比实施例方法提取的基因组示意图，上样量3μL。

图5为实施利1和对比实施例方法提取的桑实杯盘菌基因组DNA对18S LSU rRNA序列进行扩增，序列全长为612bp，上样量10μL。

图6为实施利1和对比实施例方法提取的桑实杯盘菌基因组DNA对大片段基因序列进行扩增，序列全长为1941bp，上样量为10μL。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明实施例的材料为桑椹肥大性菌核病-桑实杯盘菌，由本实验室保存。

使用的试剂如下：溶液A：200mM Tris-HCl(pH8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5wt％SDS，1wt％β-巯基乙醇，RNA酶8μL，溶液B：5M KAC，ddH₂O，异丙醇，75％无水乙醇。

实施例1

一种简单有效提取植物病原真菌基因组DNA的方法，包括如下步骤：

(1)取桑椹肥大性菌核病-桑实杯盘菌0.2g，用液氮研磨至粉末状，迅速转移至已灭菌的离心管中；

(2)加入600μL溶液A，涡旋震荡1～2分钟，静置10min；溶液A配方如下：200mMTris-HCl(pH8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5wt％SDS，1wt％β-巯基乙醇，RNA酶8μL。

(3)在步骤(2)的离心管中加入260μL溶液B，混匀，静置10min，12000rpm离心5min；溶液B配方为：5M KAC；

(4)取步骤(3)离心管中的上清至一新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，静置2min，12000rpm离心5min；

(5)弃去步骤(4)离心管中上清，加入400μL 75％无水乙醇洗涤沉淀3次，12000rpm离心5min；

(6)弃去步骤(5)离心管中的乙醇，用移液枪吸取残留乙醇。待乙醇成分完全干燥后，加入ddH₂O溶解，-20℃保存。

提取得到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。结果显示，提取得到的基因组DNA浓度高。

利用提取的DNA18S LSU rRNA序列进行扩增，扩增引物具体如下：

18SLSU-F：5’-gcatatcaagcggaggaaaag-3’(SEQ ID NO.1)；

18SLSU-R：5’-ggtccgtgtttcaagacgg-3’(SEQ ID NO.2)；

扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。结果显示，扩增获得序列长度为612bp的片段，且条带亮度高，无降解，表明提取的DNA完整性好，3次重复结果可以看出提取的DNA稳定性好。

对比实施例

按照实施例1的方法，区别为加入提取液的配方如下：0.5wt％SDS，0.1M、pH9.3Tris-HCl，1.0M NaCl，10M EDTA，按公开号为CN109666671A的方法提取，提取后利用NanaDrop2000超微量分光光度计检测。同时以实施例1的方法作为对照，结果如图3所示。结果显示，实施例1的方法提取的DNA OD值均在1.8～2.1之间，基因组平均浓度为409.9ng/μl；对比实施例提取的DNA OD值在0.56～1.6之间(表1)，浓度在229.7ng/μl。

表1.不同提取方法基因组OD比值统计表

上表为三组重复的平均值

从表1可以看出，使用实施例提取的基因组要优于对比例所提取基因组，符合高纯度基因组的要求，杂质少、纯度高更利于之后的分子检测。

图3为用实例1和对比例材料均定量为0.05g，提取产物用NanaDrop2000超微量分光光度计对实施例1和对比实施例方法提取的桑实杯盘菌基因组进行浓度与质量检测。

然后将对照方法提取的DNA与实施例1方法提取的DNA进行电泳检测，结果如图4所示。结果显示，使用实施例1的方法提取DNA电泳检测有明显条带，而对比实施例的方法无明显条带，表明对比实施例的方法不适合提取植物病原真菌基因组DNA。

将对照方法提取的DNA与实施例1方法提取的DNA作为模板，扩增18S LSU rRNA序列，结果如图5所示。结果显示，使用实施例1方法提取的DNA能够扩增获得612bp的产物，且条带更亮；而对比实施例方法提取的DNA仅有一个样条带亮度高，表明实施例1的方法提取的基因组DNA质量更高，有利于产物扩增。

将对照方法提取的DNA与实施例1方法提取的DNA作为模板，扩增Asm基因，其扩增引物如下：

Asm-F：5’-atgaaccacggtcctcaagat-3’(SEQ ID NO.3)；

Asm-R：5’-ttaccggcgtcgttgtgtaatg-3’(SEQ ID NO.4)；

结果如图6所示。结果显示，使用方法提取的DNA能够扩增获得全长1941bp的目标产物，而对比实施例的方法无法扩增得到目的条带。表明实施例1的方法提取的基因组DNA纯度高、稳定性好，可直接用于基因克隆以及基因组测序，为病原真菌分子生物学研究提供了一种高效可行的分子检测途径。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种简单有效提取植物病原真菌基因组DNA的试剂和方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 1

gcatatcaag cggaggaaaa g 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 2

ggtccgtgtt tcaagacgg 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 3

atgaaccacg gtcctcaaga t 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence )

<400> 4

ttaccggcgt cgttgtgtaa tg 22

Claims

1.提取植物病原真菌基因组DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）取提取材料，用液氮研磨至粉末状，然后加入溶液A，混匀，静置；所述溶液A各组分的浓度如下：pH8.0、200mM Tris-HCl，250mM NaCl，25mM EDTA，0.5wt% SDS，1wt% β-巯基乙醇，RNA酶8μg/ml；所述混匀为涡旋震荡1~2分钟，所述静置为静置10min；所述提取材料为桑椹肥大性菌核病-桑实杯盘菌；

（2）向步骤（1）的溶液中加入溶液B，混匀，静置后离心收集上清；溶液B为浓度5M醋酸钾；所述静置为静置10分钟，所述离心为12000rpm离心5min；

（3）取步骤（2）离心所得上清，然后加入等体积的异丙醇，混匀，静置后离心收集沉淀；所述静置为静置2min，所述离心为12000rpm离心5min；

（4）将步骤（3）所得沉淀用体积分数为75%的乙醇洗涤，离心收集沉淀，待乙醇挥发后加入水溶解。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述溶液A的加入量按每0.1g组织材料加入300μL溶液A。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，在加入等体积异丙醇后，在冰上静置2min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述离心为12000rpm离心5min。