CN114292941B - 鉴别或辅助鉴别大豆油分含量的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鉴别或辅助鉴别大豆油分含量的分子标记、其特异性引物对及其在大豆育种中的应用。实验证明，无论是针对HJ117×Hobbit的RIL群体、HJ17×中黄13的RIL群体、HJ117×齐黄34的RIL群体，还是针对HJ117×徐豆16的RIL群体，使用本发明的分子标记和引物对分型，和油分含量测定结果对应的可解释的遗传变异率在27.98％‑57.34％，说明Chr15_15_3281983_A_G是与大豆油分含量相关的SNP分子标记，可用于鉴定或辅助鉴定大豆油分含量，可用于大豆油分含量品种的筛选，可用于大豆分子标记辅助育种，可用于高油分大豆的选育和培育。

Description

鉴别或辅助鉴别大豆油分含量的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中鉴别或辅助鉴别大豆油分含量的分子标记及其应用。

背景技术

大豆(Glycine max L.)作为重要的油分含量来源之一，以往的研究表明，大豆蛋白含量和油分含量的基因组是紧密相连的，同时也发现蛋白含量和油分含量往往呈现负相关的关系(Zhang,2019)。而一般用大豆的总蛋白油分含量来统一其蛋白含量和油分含量负相关性。大豆总蛋白油分含量也是大豆重要的品质性状之一，因此分析大豆总蛋白油分含量的遗传机制，能进一步解析大豆品质性状，从而提高大豆的品质。大多数的研究是运用单一环境利用两亲本衍生群体而进行QTL定位，由于蛋白含量和油分含量表现为复杂的数量性状，其遗传过程中容易发生较高的偏分离，容易降低遗传作图精度(田雨等，2020)，因此分析的时候往往需要通过一年多点或多年多点的数据来进行验证。目前国内外关于大豆品质性状的定位主要集中在研究蛋白含量或者油分含量(Cahoon,2009)，而目前对蛋白与油分的相互关系而进行的QTL分析相关的研究还相对较少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何准确鉴定大豆油分含量。

为了解决上述技术问题，本发明提供检测大豆基因组中SNP的多态性或基因型的物质在A1-A3中的任一种应用，所述SNP为Chr15_15_3281983_A_G，位于15号染色体上，为SEQ ID No.1的第30位核苷酸，其核苷酸种类为A或G；

A1、在鉴定或辅助鉴定大豆油分含量中的应用；

A2、在制备鉴定或辅助鉴定大豆油分含量产品中的应用；

A3、在大豆育种中的应用或在制备大豆育种产品中的应用。

所述大豆为纯系。

上述应用中，所述物质为下述任一种：

D1)所述物质含有扩增包括所述SNP在内的大豆基因组DNA片段的PCR引物；

D2)所述物质为含有D1)所述PCR引物的PCR试剂；

D3)所述物质为含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒；

D4)所述物质含有D1)所述PCR引物和限制性内切酶TaqI；

D5)所述物质为含有D2)所述PCR试剂和限制性内切酶TaqI的试剂。

上述应用中，所述PCR引物为P1和P2组成的引物对；所述P1为与SEQ ID No.1所示的双链DNA的第1-29位上游特异结合的单链DNA；所述P2为与SEQ ID No.1所示的双链DNA的第232-251位下游特异结合的单链DNA。

上述应用中，所述P1为SEQ ID No.2所示的单链DNA，所述P2为SEQ ID No.3所示的单链DNA。

上文中，所述检测大豆基因组中所述SNP的多态性或基因型(即等位基因)的物质可为通过下述至少一种方法确定所述SNP的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

本发明还提供产品，所述产品含有所述检测大豆基因组中所述SNP的多态性或基因型的物质，所述产品为C1)-C3)中任一种产品：

C1)检测与大豆油分含量相关的单核苷酸多态性或基因型的产品；

C2)鉴定或辅助鉴定大豆油分含量的产品；

C3)用于大豆育种的产品。

本发明还提供检测大豆基因组中所述SNP的多态性或基因型的方法。

本发明所提供的检测大豆基因组中所述SNP的基因组的方法为如下Ⅰ或Ⅱ：

Ⅰ、包括如下K1)和K2)：

K1)以待测大豆的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增得到PCR产物；

K2)检测步骤K1)得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定待测大豆所述SNP的基因组：

所述PCR产物对应SEQ ID No.1第30位的核苷酸只为G的所述待测大豆的基因组为GG；所述PCR产物对应SEQ ID No.1第30位的核苷酸只为A的所述待测大豆的基因组为AA；

Ⅱ、包括如下L1)和L2)：

L1)以待测大豆基因组DNA为模板，采用P1和P2组成的引物对进行PCR扩增得到PCR产物；

L2)下述L21)或L22)：

L21)以TaqI酶切步骤L1)所得的PCR产物，检测酶切产物的大小，根据所述酶切产物的大小确定待测大豆所述SNP的基因组：

所述酶切产物只为251bp的DNA片段的所述待测大豆的基因组为GG；所述酶切产物只为224bp的DNA片段和27bp的DNA片段的所述待测大豆的基因组为AA；

L22)检测步骤L1)得到的PCR产物的序列，根据所述序列确定待测大豆所述SNP的基因组：

所述PCR产物对应SEQ ID No.1第30位的核苷酸为G的所述待测大豆的基因组为GG；所述PCR产物对应SEQ ID No.1第30位的核苷酸为A的所述待测大豆的基因组为AA。

本发明还提供鉴定或辅助鉴定大豆油分含量的方法，包括以上述检测大豆基因组中所述的SNP的基因组的方法检测待测大豆基因组，根据待测大豆的基因组鉴定或辅助鉴定大豆的油分含量；基因组为GG的待测大豆油分含量高于或候选高于基因组为AA的待测大豆油分含量。

本发明所要解决的另一个技术问题是如何进行大豆育种。

为了解决上述技术问题，本发明提供了大豆育种的方法，包括以上述检测大豆基因组中所述的SNP的基因组的方法检测待测大豆基因组，选择基因组为GG的大豆作为亲本进行育种。

本发明还提供所述引物对的下述A1-A3的任一种应用：

A1、在鉴定或辅助鉴定大豆油分含量中的应用；

A2、在制备鉴定或辅助鉴定大豆油分含量产品中的应用；

A3、在大豆育种中的应用或在制备大豆育种产品中的应用。

上述应用，所述大豆育种为培育高油分大豆。

上文中，所述大豆为纯系。

本发明的一个实施例中，使用引物扩增包括SNP位点Chr15_15_3281983_A_G在内的大豆基因组DNA，以TaqI对反应产物进行酶切，酶切产物进行凝胶电泳确定了该SNP位点的核苷酸类型。实验证明，无论是针对HJ117×Hobbit的RIL群体、HJ17×中黄13的RIL群体、HJ117×齐黄34的RIL群体，还是针对HJ117×徐豆16的RIL群体，使用本发明的引物对SNP位点Chr15_15_3281983_A_G位点分型，和油分含量对应的可解释的遗传变异率在27.98％-57.34％，说明Chr15_15_3281983_A_G是与大豆油分含量相关的SNP分子标记，可用于鉴定或辅助鉴定大豆油分含量，可用于大豆油分含量品种的筛选，可用于大豆分子标记辅助育种，可用于高油分大豆的选育和培育。

附图说明

图1为本发明实施例1中HJ117为母本的后代群体油分性状的GWAS分析结果图。

图2为本发明实施例2中HJ117×Hobbit的RIL群体油分正态分布及标记选择效率图。

图3为本发明实施例2中HJ117×齐黄34的RIL群体油分正态分布及标记选择效率图。

图4为本发明实施例2中HJ117×中黄13的RIL群体油分正态分布及标记选择效率图。

图5为本发明实施例2中HJ117×徐豆16的RIL群体油分正态分布及标记选择效率图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中使用的大豆品种HJ117记载于非专利文献“郭静文，史晓蕾，刘茜，赵青松，邸锐，刘兵强，闫龙，王凤敏，张孟臣，赵宝华，杨春燕.基于转录组测序技术挖掘大豆蛋白质合成相关基因.2019年01期”，大豆品种Hobbit记载于非专利文献“李灿东，郭泰，王志新，郑伟，张振宇，郭美玲，刘忠堂.美国矮秆大豆hobbit资源利用及合98—1667的选育.2014年第7期”，大豆品种中黄13(国审豆2001008)、齐黄34(国审豆2013009)、徐豆16(国审豆2009020)为已审定品种，公众可以从河北省农林科学院粮油作物研究所(即申请人处)获得，以重复本申请实验。

实施例1、分子标记的获得与相关检测体系的构建

一、分子标记的获得

利用大豆品种HJ117为母本，与5～10品种进行杂交形成1000个左右后代的RIL群体材料，通过简化基因组测序的方法(SLAF)获得不同家系的多态性。进一步通过GWAS的方法对这1000个家系的油分含量进行GWAS定位分析，结果见图，共定位到两个显著的位点，其中在15号染色体上P值最小的位点是Chr15_15_3281983，为7.0921E-16，变异类型为A/G变异，其中G为增效基因型，在此将该功能位点命名为Chr15_15_3281983_A_G。

Chr15_15_3281983_A_G是大豆基因组内的一个二等位多态性的SNP位点，位于15号染色体上，具体为SEQ ID No.1的第30位，核苷酸种类为G或A(以字母R表示)。

二、分子标记相关引物的设计

根据SNP位点的位置，在基因组上将上下游各30bp的序列提取出来，根据序列使用“dCAPS Finder”程序(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计dCAPS引物(Neffet al.,2002)，在SNP位置附近引入单核苷酸错配，使得限制内切酶在扩增的PCR产物中对以其中一亲本为模板扩增的序列之一产生识别位点(Li et al.,2012)。

针对SNP位点Chr15_15_3281983_A_G，具体使用的引物为F和R，序列如下:

F(前引物)：5’-CCATTTGTTCTGCTGTAAGATTTGATTCG-3’(如SEQ ID No.2所示)；

R(后引物)：5’-AGCTGTTGGGTGAAAGCATA-3’(如SEQ ID No.3所示)。

使用的内切酶是TaqI，TaqI的识别位点为TCGA。当Chr15_15_3281983_A_G的核苷酸种类为AA时，SEQ ID No.1的第27-30位为TCGA，可被TaqI识别并酶切；当Chr15_15_3281983_A_G的核苷酸种类为GG时，SEQ ID No.1的第27-30位为TCGG，不能被TaqI识别。

三、分子标记检测体系的构建

构建分子标记检测体系如下：

提取待测大豆的基因组DNA，以F和R组成的引物对进行PCR扩增，PCR的反应体系和程序如表1所示：

表1 PCR反应体系

成分	用量
		10×Ex Tag HS buffer	2.5μL
0.2mM dNTP	2.0μL
		Template	1.0μL
Primer-F(10μM)	0.5μL
		Primer-R(10μM)	0.5μL
Ex Taq HS	0.2μL
		ddH<sub>2</sub>O	18.3μL
Total	25μL

PCR反应程序：95℃2min，95℃30s，53℃30s，72℃30s，72℃10min，16℃延长，共30cycles。

扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，有单一性条带的产物以TaqI酶切检测。使用的内切酶体系见表2：

表2酶切体系

成分	用量
		10×NEB Buffer	2.5μL
限制性内切酶	1.0μL
		PCR产物	10μL
ddH<sub>2</sub>O	11.5μL
		Total	25μL

在酶的工作温度下酶切30min，然后在3％琼脂糖凝胶电泳中检测消化产物，并在凝胶成像系统中观察结果：消化产物中条带变小，为224bp，表明待测大豆的SNP位点Chr15_15_3281983_A_G的基因组为AA，即待测大豆为AA型家系；消化产物条带大小与消化前一致，为251bp，表明待测大豆的SNP位点Chr15_15_3281983_A_G的基因组为GG，即待测大豆为GG型家系。

实施例2、分子标记相关片段或引物在鉴定待测大豆油分含量中的应用

为了进一步证实标记Chr15_15_3281983后代选择高油分材料中的效应。随机选用4个RIL(Recombinant Inbred Lines)群体，分别为HJ117×Hobbit的RIL群体、HJ17×中黄13的RIL群体、HJ117×齐黄34的RIL群体和HJ117×徐豆16的RIL群体进行油分含量增效验证，具体如下：

一、鉴定HJ117×Hobbit的RIL群体的油分含量增效情况

实验材料为以HJ117为母本，以Hobbit为父本杂交，之后选F2群体的个体多代自交产生HJ117×Hobbit的RIL群体，群体中每个株系都是相对纯合的。在HJ117×Hobbit的RIL群体中选147个随机家系进行如下实验：

1、测定待测大豆的油分含量

测定147个随机家系的油分含量采用近红外分析仪进行测定，结果见表3的第2列。

在HJ117×Hobbit的RIL群体中，147个随机家系的油分百分含量分布符合正态分布(见图2的A图)，群体的变异范围在17.79±2.02％之间，说明油分含量由多基因控制。

2、标记Chr15_15_3281983_A_G的测定

以实施例1中第三部分构建的分子标记检测体系对HJ117×Hobbit的RIL群体中的上述147个随机家系以及亲本HJ117和Hobbit进行检测，具体大豆油分含量与Chr15_15_3281983_A_G的基因组的对应关系见表3：

表3待测大豆分子标记检测结果

Chr15_15_3281983_A_G标记对这些家系进行分型的结果见图2的B图，显示AA和GG型家系的平均油分含量分别为16.93％和18.45％，该标记在群体中可解释的遗传变异率为37.53％，GG型家系的平均蛋白含量显著高于AA型家系的平均蛋白含量(P＜0.05)。表明利用该标记在该群体中可以有效提高选择高油分家系选出的效率。

二、鉴定HJ117×齐黄34的RIL群体的油分含量增效情况

实验材料为以HJ117为母本，以齐黄34为父本杂交，之后选F2群体的个体多代自交产生HJ117×齐黄34的RIL群体，群体中每个株系都是相对纯合的。在HJ117×齐黄34的RIL群体中选161个随机家系进行如下实验：

1、测定待测大豆的油分含量

测定161个随机家系的油分含量采用近红外分析仪进行测定，结果见表4的第2列。

在HJ117×齐黄34的RIL群体中，161个随机家系的油分百分含量分布符合正态分布(见图3的A图)，群体的变异范围在17.41±1.37％之间，说明油分含量由多基因控制。

2、标记Chr15_15_3281983_A_G的测定

以实施例1中第三部分构建的分子标记检测体系对HJ117×齐黄34的RIL群体中的上述161个随机家系以及亲本HJ117和齐黄34进行检测，具体大豆油分含量与Chr15_15_3281983_A_G的基因组的对应关系见表4：

表4待测大豆分子标记检测结果

Chr15_15_3281983_A_G标记对这些家系进行分型的结果见图3的B图，显示AA和GG型家系的平均油分含量分别为16.86％和17.95％，该标记在群体中可解释的遗传变异率为39.64％，GG型家系的平均蛋白含量显著高于AA型家系的平均蛋白含量(P＜0.05)。表明利用该标记在该群体中可以有效提高选择高油分家系选出的效率。

三、鉴定HJ117×中黄13的RIL群体的油分含量增效情况

实验材料为以HJ117为母本，以中黄13为父本杂交，之后选F2群体的个体多代自交产生HJ117×中黄13的RIL群体，群体中每个株系都是相对纯合的。在HJ117×中黄13的RIL群体中选151个随机家系进行如下实验：

1、测定待测大豆的油分含量

测定151个随机家系的油分含量采用近红外分析仪进行测定，结果见表5的第2列。

在HJ117×中黄13的RIL群体中，151个随机家系的油分百分含量分布符合正态分布(见图4的A图)，群体的变异范围在17.76±1.83％之间，说明油分含量由多基因控制。

2、标记Chr15_15_3281983_A_G的测定

以实施例1中第三部分构建的分子标记检测体系对HJ117×中黄13的RIL群体中的上述151个随机家系以及亲本HJ117和中黄13进行检测，具体大豆油分含量与Chr15_15_3281983_A_G的基因组的对应关系见表5：

表5待测大豆分子标记检测结果

Chr15_15_3281983_A_G标记对这些家系进行分型的结果见图4的B图，显示AA和GG型家系的平均油分含量分别为16.99％和18.02％，该标记在群体中可解释的遗传变异率为27.98％，GG型家系的平均蛋白含量显著高于AA型家系的平均蛋白含量(P＜0.05)。表明利用该标记在该群体中可以有效提高选择高油分家系选出的效率。

四、鉴定HJ117×徐豆16的RIL群体的油分含量增效情况

实验材料为以HJ117为母本，以徐豆16为父本杂交，之后选F2群体的个体多代自交产生HJ117×徐豆16的RIL群体，群体中每个株系都是相对纯合的。在HJ117×徐豆16的RIL群体中选178个随机家系进行如下实验：

1、测定待测大豆的油分含量

测定178个随机家系的油分含量采用近红外分析仪进行测定，结果见表6的第2列。

在HJ117×徐豆16的RIL群体中，178个随机家系的油分百分含量分布符合正态分布(见图5的A图)，群体的变异范围在17.81±1.60％之间，说明油分含量由多基因控制。

2、标记Chr15_15_3281983_A_G的测定

以实施例1中第三部分构建的分子标记检测体系对HJ117×徐豆16的RIL群体中的上述178个随机家系以及亲本HJ117和徐豆16进行检测，具体大豆油分含量与Chr15_15_3281983_A_G的基因组的对应关系见表6：

表6待测大豆分子标记检测结果

Chr15_15_3281983_A_G标记对这些家系进行分型的结果见图5的B图，显示AA和GG型家系的平均油分含量分别为16.85％和18.68％，该标记在群体中可解释的遗传变异率为57.34％，GG型家系的平均蛋白含量显著高于AA型家系的平均蛋白含量(P＜0.05)。表明利用该标记在该群体中可以有效提高选择高油分家系选出的效率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 河北省农林科学院粮油作物研究所

<120> 鉴别或辅助鉴别大豆油分含量的分子标记及其应用

<130> GNCSY212831

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 251

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccatttgttc tgctgtaaga tttgattccr cagaaatatc ttcatgatat gctaccagtg 60

cattctcaag aaaactaaca atcatgcgaa ctgatccaaa agctgcatcc ataaatatgt 120

caacctgtca tataatttca cgattagcca tagcacaaac aaatattatc agaaaataag 180

taaaataata ttgctaagag acatatttgt cagatgtaat aaaaccactc atatgctttc 240

acccaacagc t 251

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccatttgttc tgctgtaaga tttgattcg 29

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctgttggg tgaaagcata 20

Claims (7)

1.检测大豆基因组中SNP的多态性或基因型的物质在A1-A3中的任一种应用，其特征在于，所述SNP为SEQ ID No.1第30位核苷酸，其核苷酸种类为A或G；

A1、在鉴定大豆油分含量中的应用；

A2、在制备鉴定大豆油分含量产品中的应用；

A3、在高油分大豆育种中的应用或在制备高油分大豆育种产品中的应用；

所述大豆属于HJ117×Hobbit的RIL群体、HJ117×中黄13的RIL群体、HJ117×齐黄34的RIL群体或HJ117×徐豆16的RIL群体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为下述任一种：

D1）所述物质含有扩增包括所述SNP在内的大豆基因组DNA片段的PCR引物；

D2）所述物质为含有D1）所述PCR引物的PCR试剂；

D3）所述物质为含有D1）所述PCR引物或D2）所述PCR试剂的试剂盒；

D4）所述物质含有D1）所述PCR引物和限制性内切酶TaqI；

D5）所述物质为含有D2）所述PCR试剂和限制性内切酶TaqI的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述PCR引物为扩增SEQ ID No.1所示DNA片段的引物对。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述引物对由P1和P2组成；所述P1为SEQID No.2所示的单链DNA，所述P2为SEQ ID No.3所示的单链DNA。

5.检测大豆基因组中权利要求1中所述的SNP的基因型的方法，其特征在于：为如下Ⅰ或Ⅱ：

Ⅰ、包括如下K1）和K2）：

K1）以待测大豆的基因组DNA为模板，采用权利要求3中所述的引物对进行PCR扩增得到PCR产物；

K2）检测步骤K1）得到的PCR产物，根据所述PCR产物确定待测大豆所述SNP的基因型：

所述PCR产物对应SEQ ID No.1第30位的核苷酸只为G的所述待测大豆的基因型为GG；所述PCR产物对应SEQ ID No.1第30位的核苷酸只为A的所述待测大豆的基因型为AA；

Ⅱ、包括如下L1）和L2）：

L1）以待测大豆基因组DNA为模板，采用权利要求4中所述的P1和权利要求4中所述的P2组成的引物对进行PCR扩增得到PCR产物；

L2）下述L21）或L22）：

L21）以TaqI酶切步骤L1）所得的PCR产物，检测酶切产物的大小，根据所述酶切产物的大小确定待测大豆所述SNP的基因型：

所述酶切产物只为251bp的DNA片段的所述待测大豆的基因型为GG；所述酶切产物只为224bp的DNA片段和27bp的DNA片段的所述待测大豆的基因型为AA；

L22）检测步骤L1）得到的PCR产物的序列，根据所述序列确定待测大豆所述SNP的基因型：

所述PCR产物对应SEQ ID No.1第30位的核苷酸只为G的所述待测大豆的基因型为GG；所述PCR产物对应SEQ ID No.1第30位的核苷酸只为A的所述待测大豆的基因型为AA。

6.鉴定大豆油分含量的方法，其特征在于，以权利要求5的方法检测待测大豆基因型，根据待测大豆的基因型鉴定大豆的油分含量；基因型为GG的待测大豆油分含量高于基因型为AA的待测大豆油分含量；

所述大豆属于HJ117×Hobbit的RIL群体、HJ117×中黄13的RIL群体、HJ117×齐黄34的RIL群体或HJ117×徐豆16的RIL群体。

7.高油分大豆育种的方法，其特征在于：以权利要求5的方法检测待测大豆基因型，选择基因型为GG的大豆作为亲本进行育种；

所述大豆属于HJ117×Hobbit的RIL群体、HJ117×中黄13的RIL群体、HJ117×齐黄34的RIL群体或HJ117×徐豆16的RIL群体。

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