CN114736987B - 苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定方法 - Google Patents

苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农作物品种鉴定技术领域，具体涉及苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定方法。所述方法利用11对稳定性高、重复性好、多态性强的核心SSR引物在不同苹果品种中扩增所得的等位基因数据，通过排序编码和字符串转换后，利用二维码转换器构建出苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的二维码分子身份证。该二维码分子身份证可对‘秦脆’和‘秦蜜’品种的分子特异性快速准确鉴定，以解决现有苹果品种难以有效鉴别区分的技术问题。该二维码化分子身份证可在分子水平上有效区分不同苹果品种，且不受环境和人为因素的干扰，能通过信息终端直接读取，为苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的品种鉴定、知识产权保护和标准化管理提供科学依据。

Description

苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定 方法
技术领域
本发明涉及农作物品种鉴定技术领域，具体涉及苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定方法。
背景技术
苹果(Malus domestica Borkh.)是世界性果品，由于其生态适应性强、果品营养价值高、耐贮性好且供应周期长，许多国家都将其列为主要消费果品。2011-2020年，我国苹果种植面积整体保持增长，产量稳定。目前我国苹果种植面积、总产量、人均占有量与出口量均居世界第一，已经成为世界上最大的苹果生产和消费国。然而我国苹果生产中，以‘富士’系苹果为主的主栽品种生产模式，导致苹果品种比例失调，品种结构组成单一化的问题日趋突出。长此以往，必将影响苹果产业抵御自然灾害的能力，严重影响苹果的产量和品质。同时这也与消费需求多元化趋势相悖。因此为了苹果产业的可持续发展，应将多元化、优化品种作为新品种选育的目标，增加早、中熟品种，满足市场对苹果的多样化消费需求，这也将对调整中国苹果产业构成产生深远的影响。
苹果新品种‘秦脆’是以‘长富2号’为母本，‘蜜脆’为父本杂交选育，并于2016年12月通过陕西省果树品种审定委员会审定的晚熟品种。‘秦蜜’与‘秦脆’同期审定，是在‘秦冠’ב蜜脆’中选育出的中晚熟苹果新品种。‘秦脆’果实质地脆、汁液多、口感风味俱佳，并且适应性、抗旱耐寒性以及对早期落叶病的抗性均优于母本‘长富2号’。而‘秦蜜’品种，克服了父本‘蜜脆’对肥水条件要求严格，采前落果的问题，且较母本‘秦冠’的果实质量大幅度提高，果面光洁着色鲜艳，可无套袋栽培。‘秦蜜’属于中熟品种，‘秦脆’属于晚熟品种，这在一定程度上可缓解苹果供应期高度集中的问题，起到调整品种结构的作用，另一方面，‘秦脆’的果实风味口感极佳，符合市场消费者的需求，‘秦蜜’无套袋栽培，可减少果农的劳动量，节约生产成本。因此，苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’具有广阔的市场前景。然而，对于苹果新品种的准确鉴定是对新品种保护和利用的前提，更是知识产权保护的必要手段。
DNA分子标记因其可直接反应基因组DNA间的差异，成为种质资源保护、种质鉴别和优良品种选育等研究领域中的一类重要的遗传标记技术。其中，SSR(simple sequencerepeat)即简单序列重复，又称为微卫星(microsatellite)，是一类长度在150bp左右，以1～4个核苷酸为基本单位的串联重复序列，是现今流行的分子标记技术之一。SSR标记中的串联重复单位数量的变化主要是由于DNA复制过程中的滑动导致，并且串联重复单位的重复次数在同一物种的不同品种或不同个体中存在较大的差异，从而构成丰富的多态性。SSR标记因具有分布广泛、数量丰富、稳定性好、多态性高、共显性、可实现自动化高通量基因分型检测的特点，目前成为苹果种质资源遗传多样性、基因型鉴定与品种保护、遗传图谱构建、基因定位以及辅助育种选择研究中的理想遗传标记技术。迄今为止，大约有300多个SSR标记从苹果基因组中被开发并发布于HiDRAS网站(http://www.hidras.unimi.it/)。随着基于SSR标记的指纹鉴定技术的日趋完善，构建苹果新品种的二维码分子身份证，对品种的区别、鉴定和对比提供了技术支持。‘秦脆’和‘秦蜜’是2016年12月通过陕西省果树品种审定委员会审定的苹果新品种，为了规范市场并保护育种者的权益，需要对苹果新品种进行科学准确的鉴定。因此利用SSR分子标记通过构建‘秦脆’和‘秦蜜’的二维码分子身份证对其品种分子特异性进行鉴定具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于开发一种苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定方法，以解决现有苹果品种难以有效鉴别区分的技术问题，可为苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的知识产权保护和标准化管理提供新途径。
本发明的第一个方面，提供苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建方法，包括以下步骤：
S1、以‘秦脆’、‘秦蜜’的基因组DNA为模板，采用11对核心SSR引物分别进行PCR扩增，得到扩增产物，所述11对核心SSR引物的序列如SEQ ID NO.1-22所示；
S2、对S1中的PCR产物测序并分析统计不同SSR位点的等位基因信息；
S3、对S1的11对核心SSR引物进行固定顺序排序；
S4、对S2中不同SSR位点的等位基因进行分类标识；
S5、按照S3中的SSR引物排序，对‘秦脆’、‘秦蜜’在11个SSR位点上的等位基因信息，按照S4中的等位基因分类标识进行编码和字符串转换，得到的字符串即‘秦脆’、‘秦蜜’的分子身份证。
进一步的，S1中PCR反应体系为：50ng/μL的DNA模板0.6μL，正反向SSR引物各0.8μL，2×SanTaq PCR Mix预混液10μL，超纯去离子无菌水补充至20μL；PCR扩增程序为：预变性：94℃-3min；变性：94℃-40s；退火：60℃-50s；延伸：72℃-1min，从变性到延伸设置32个循环；总延伸：72℃-10min，最后4℃保存。
更进一步的，S2具体为采用毛细管电泳法测序和分析不同品种在不同SSR位点的等位基因片段大小，根据毛细管电泳峰图读取等位基因信息，进行基因分型。
更进一步的，S3中的排序参数为：SSR引物的遗传多态性高低。
更进一步的，S4具体为将每个SSR位点的等位基因按照分子量从小到大的顺序排列，每个等位基因从0开始依次赋值，若等位基因个数超过9，则从第10个等位基因开始以英文大写字母代替。
本发明的第二个方面，提供苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的二维码分子身份证构建方法，包括上述5的S1-S5，将S5中所得的字符串，利用二维码生成器生成二维码，即为苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的二维码分子身份证。
本发明的第三个方面，苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子特异性鉴定方法，其特征在于，包括上述的S1-S5，将‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证与待鉴定苹果的分子身份证，进行比对，若两者完全一致，则待鉴定苹果是‘秦脆’或‘秦蜜’品种，若不一致，则待鉴定苹果并非‘秦脆’或‘秦蜜’品种；
所述待鉴定苹果的分子身份证的获得方法是：以待鉴定苹果替代‘秦脆’和‘秦蜜’，执行上述的S1-S5。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1)SSR分子标记是基于基因组遗传信息的标记技术，可在苹果的不同发育阶段、不同组织均可检测，且不受环境影响，可随时采样进行苹果品种的鉴定；另外，SSR标记数量大且为共显性遗传，有利于对隐性基因的检测。
2)基于SSR标记构建的DNA分子身份证能够区分不同苹果品种的遗传差异。不同苹果品种的基因型遗传差异可形成独一无二的DNA分子身份证。从而DNA分子身份证可正确反映或标识苹果品种的特异性和真实性，为新品种的知识产权保护提供科学依据和技术支持。
3)本发明迎合了当今互联网发展趋势，将苹果品种的分子身份证进行二维码化，二维码化分子身份证可被扫码机器解读，摆脱了人工读取字符串的麻烦，从而实现不同苹果品种的快速身份信息识别。
附图说明
图1为‘秦脆’在CH01h10(a)，CH01f03b(b)和CH01h02(c)位点的等位基因峰图图谱。
图2为27个苹果品种基于DICE相似系数的亲缘关系进化树图。
图3为‘秦脆’的二维码分子身份证。
图4为‘秦蜜’的二维码分子身份证。
图5为27份苹果品种间的DICE相似系数，其中，1：倭锦；2：橘苹；3：君子兰；4：发现；5：爱尔星；6：嘉年华；7：弗洛里纳；8：长富二号；9：嘎啦；10：凯密欧；11：金冠；12：澳洲青苹；13：津轻；14：新红玉；15：红玉；16：瑞光；17：威赛克旭；18：红星；19：皮诺娃；20：普利玛；21：秦冠；22：红金；23：国光；24：蜜脆；25：秦脆；26：秦蜜；27：元帅。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例：
1.材料和方法
‘秦脆’是‘长富2号’ב蜜脆’杂交而得的晚熟苹果新品种，‘秦蜜’是以‘秦冠’为母本，‘蜜脆’为父本杂交获得的中晚熟苹果新品种，两个新品种于2016年12月通过陕西省果树品种审定委员会审定并定名。除两个新品种外，还选取了其亲本以及在世界苹果主产区内曾经有较大栽培面积的22个苹果品种(表1)。
春季采集27份供试苹果品种的健康幼嫩叶片3-5片，装于纸质信封内，记录好品种名称后放入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥处理，2天后取出。每个品种各称取0.05g冻干叶片，装入2ml离心管中，使用高通量植物组织研磨仪对叶片进行充分研磨成粉状。
11对核心SSR分子标记(表2或SEQ ID NO.1-22所示)的正向引物的5’端分别标记三种不同荧光染料(FAM,VIC和NED)中的一种，由生工生物工程(西安)有限公司合成。2×SanTaq PCR Mix预混液(包括MgCl2、dNTP、Taq DNA Polymerase、PCR buffer、loading和PCR增强剂)购自生工生物工程(西安)有限公司。
1.2方法
1.2.1苹果基因组DNA的提取
采用CTAB法提取苹果叶片的基因组DNA，1％琼脂凝胶电泳检测DNA的质量，Nanodrop TM ND-2000分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,DE,USA)定量DNA浓度并稀释到50ng/μL后，置于-20℃冰箱中备用。
1.2.2SSR分析
1.2.2.1PCR反应体系：50ng/μL DNA模板0.6μL；正反向SSR引物各0.8μL；2×SanTaq PCR Mix预混液10μL；超纯去离子无菌水7.8μL，共计20μL。
1.2.2.2PCR反应条件
预变性：94℃-3min；变性：94℃-40s；退火：60℃-50s；延伸：72℃-1min，从变性到延伸设置32个循环；总延伸：72℃-10min，最后4℃保存。
1.2.2.3毛细管电泳分析
PCR反应结束后，按照表2进行PCR产物混合，混合比例为FAM:VIC:NED＝1:1:2，总量为20μL。然后将PCR产物混合液通过毛细管电泳经ABI3730 XL测序仪(AppliedBiosystems,Foster City,CA,USA)进行荧光检测，利用GeneMarker V2.2.0软件对扩增产物进行可视化，获取27份苹果样品在11个SSR位点的扩增片段长度(即等位基因)(表3和图1)。
1.2.3二维码分子身份证的构建
首先将11对核心SSR引物按遗传多态性(即等位基因的数目)由高到低排序。若两个SSR位点的等位基因数目相同，则按SSR名称的英文字母表顺序排序。例如：CH01h01和CH03g07均有5个等位基因，由于CH01h01中的h比CH03g07中的g在英文字母表中的排序靠前，则将CH01h01在11对SSR引物中的排序放在CH03g07的前面。因此，11对核心SSR引物在构建分子身份证中的顺序为：CH01h02，CH01h01，CH03g07，CH01f03b，CH01h10，CH02c09，CH01a09，CH01f02，CH02d08，CH05c06和CH04c07。然后，再将每个SSR位点的等位基因按照扩增片段的长度从小到大进行排序。每个等位基因从0开始依次赋值，若等位基因个数超过9，则从第10个等位基因开始以大写英文字母A、B、C……代替(表4)。例如，CH01h02在27份苹果品种中存在以下等位基因位点：238、246、248、250、252，这些等位基因分别用0、1、2、3、4赋值。最后按照11个SSR位点的固定顺序，将27份苹果品种在11个SSR位点上的等位基因进行字符转换，以此获得一串字符，为该品种的分子身份证号(表5)。将每份苹果品种的分子身份证号码通过在线二维码转换器(https://cli.im/)转化为分子数据二维码，所得二维码即为该品种的二维码分子身份证。其中，苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的二维码分子身份证为图3，图4所示。
2.结果分析
2.1SSR扩增产物多态性分析
采用11对核心SSR分子标记在27份苹果品种中共检测到85个等位基因位点，多态性等位基因数为5(CH01h02)～12(CH04c07)，平均每对引物检测到7.727个等位基因(Na)，有效等位基因数(Ne)为3.08(CH01h10)～6.438(CH04c07)之间，平均值为4.843。观察杂合度(Ho)为0.692(CH01h10、CH03g07)～0.962(CH04c07)之间，平均值为0.832。期望杂合度(He)为0.675(CH01h10)～0.845(CH04c07)，平均值为0.782。无偏杂合度期望值(uHe)为0.689(CH01h10)～0.861(CH04c07)，平均值为0.798。香浓多样性指数(I)为1.371(CH01h10)～2.112(CH04c07)，平均值为1.712。11个SSR位点的Ho均较低于He，导致Wright固定指数(F)值呈负值，平均值为-0.062，说明供试苹果品种间有杂合子过量现象，但过量不明显，供试材料仍接近于Hardy-Weinberg平衡(表6)。
2.2 27个苹果品种亲缘关系聚类分析
根据供试材料在11个核心SSR位点扩增出的等位基因信息，计算不同品种间的DICE相似系数(图5)，并采用UPGMA法对供试材料进行聚类分析，构建亲缘关系树状图(图2)。在DICE相似系数0.36处，除了‘国光’(‘Ralls’)和‘发现’(‘Discovery’)各自独立形成分支外，其余的24个品种聚类，据父母本遗传背景信息，我们发现其中至少有9个品种是以‘金冠’(‘Golden Delicious’)为亲本，3个品种以‘元帅’(‘Delicious’)为亲本，2个品种以‘橘苹’(‘Cox's Orange Pippin’)为亲本(表1)。由于许多现代苹果栽培品种有着共同的祖先，具有极其近似的血统，如果苹果育种家在育种中，只局限利用上述“骨干亲本”进行杂交选育新品种，会导致苹果品种的遗传多样性的逐渐丢失，促使病虫害和非生物胁迫的产生。苹果新品种‘秦脆’与‘长富二号’在DICE相似系数0.7处紧密聚类，而‘秦蜜’以0.65的相似系数与‘蜜脆’聚类，说明‘秦脆’更多的遗传了其母本‘长富二号’的特性，而‘秦蜜’则更多的遗传了其父本‘蜜脆’的特性。在相似系数为1时，‘红星’(‘Starking Delicious’)和‘元帅’(‘Delicious’)品种聚类。‘红星’是‘元帅’品种的浓条红型芽变，因SSR无法区分芽变品种，两者在11个核心SSR位点具完全相同的SSR基因型。
2.3二维码分子身份证对苹果新品种知识产权的保护
依据11个核心SSR位点的固定顺序，‘秦脆’在相应SSR位点获得的等位基因按照等位基因的赋值标准可分别转换为1/3、1/2、0/2、5/5、0/2、3/3、2/5、0/3、0/4、2/6和3/7，即获得字符串为1312025502332503042637的分子身份证。‘秦蜜’则为0/1、1/3、0/3、3/5、2/2、1/6、2/6、4/4、2/3、0/6和3/6，字符串0113033522162644230636为其分子身份证。再利用二维码技术将编码字符串转化成其独特的二维码标识即为‘秦脆’和‘秦蜜’的二维码分子身份证(图3和图4)。
一个SSR标记的身份同一性概率(PID)反映了两个个体在该SSR基因座上共享相同基因型的概率，而区分力(PD＝1-PID)计算的是两个个体在该SSR基因座上拥有不同基因型的概率。本发明入选的11个SSR引物的总PID平均值为0.082，最高值在CH01h10位点为0.156，最低值在CH04c07位点为0.041。11个位点的累积PID值在非相关基因型中为4.139×10-13，而在全同胞基因型为2.229×10-5。11个SSR的PD值均大于0.80，均值为0.918。说明入选的11个SSR位点有很强的遗传多态性，可准确区分不同苹果品种。
苹果新品种是苹果产业可持续发展和多元化发展的重要基础。近年来，农业新品种的知识产权保护备受重视。然而，苹果品种的准确鉴定是知识产权保护的首要条件。本发明利用11对核心SSR荧光引物在27份苹果品种扩增产生的遗传多态性信息(即等位基因)差异用数字转换为字符串，即为苹果品种的分子身份证。再将该字符串通过二维码转换器转换为二维码，能够通过信息终端直接读取，可不受环境和人为因素的干扰，快速有效的区分不同苹果品种，为苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的品种准确鉴定和知识产权保护提供科学依据。
表1.供试27份苹果品种的名称及其来源信息
Figure BDA0003664681650000091
Figure BDA0003664681650000101
表2.用于构建二维码身份证的11对核心SSR荧光引物及其混合测序组合
Figure BDA0003664681650000102
Figure BDA0003664681650000111
表3. 27份供试苹果品种在11个SSR位点的等位基因信息表
Figure BDA0003664681650000112
Figure BDA0003664681650000121
Figure BDA0003664681650000131
Figure BDA0003664681650000141
*：‘红星’是‘元帅’品种的浓条红型芽变，因SSR无法区分芽变品种，两者在11个核心SSR位点具相同SSR基因型。
表4. 11个SSR位点的等位基因赋值标准
Figure BDA0003664681650000142
表5. 27个苹果品种的分子身份证
Figure BDA0003664681650000143
Figure BDA0003664681650000151
*：‘红星’是‘元帅’品种的浓条红型芽变，因SSR无法区分芽变品种；两者在11个核心SSR位点具相同SSR基因型。
表6. 11对核心SSR引物在26份苹果栽培品种中的遗传多态性
Figure BDA0003664681650000152
Figure BDA0003664681650000161
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建与品种鉴定方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aataagcatt caaagcaatc cg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttccaaa tcgagtttcg tt 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcaaagata ggtagatata tgcca 25
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aggagggatt gtttgtgcac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gagaagcaaa tgcaaaaccc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctccccggct cctattctac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agagcttcga gcttcgtttg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
atcttttggt gctcccacac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tccaaaatgg cgtacctctc 20
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcagacactc actcactatc tctc 24
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
accacattag agcagttgag g 21
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctggtttgtt ttcctccagc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gatgtggttc cagaagctac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cacatgcatg aaaagcatat 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggccttccat gtctcagaag 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cctcatgccc tccactaaca 20
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ttatgtacca actttgctaa cctc 24
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
agaagcagca gaggaggatg 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
attggaactc tccgtattgt gc 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
atcaacagta gtggtagccg gt 22
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gaaagacttg cagtgggagc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggagtgggtt tgagaaggtt 20

Claims (5)

1.苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以‘秦脆’、‘秦蜜’的基因组DNA为模板，采用11对核心SSR引物分别进行PCR扩增，得到扩增产物，所述11对核心SSR引物的序列如SEQ ID NO.1 - 22所示；
S2、对S1中的PCR产物测序并分析统计不同SSR位点的等位基因信息；
S3、将S1的11对核心SSR引物按遗传多态性由高到低排序；
S4、对S2中不同SSR位点的等位基因进行分类标识；具体为将每个SSR位点的等位基因按照分子量从小到大的顺序排列，每个等位基因从0开始依次赋值，若等位基因个数超过9，则从第10个等位基因开始以英文大写字母代替；
S5、按照S3中的SSR引物排序，对‘秦脆’、‘秦蜜’在11个SSR位点上的等位基因信息，按照S4中的等位基因分类标识进行编码和字符串转换，得到的字符串即‘秦脆’、‘秦蜜’的分子身份证。
2.根据权利要求1所述苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建方法，其特征在于，S1中PCR反应体系为：50 ng/ μL的DNA模板0.6 μL，正反向SSR引物各0.8 μL，2 ×SanTaq PCR Mix预混液10 μL，超纯去离子无菌水补充至20 μL；PCR扩增程序为：预变性：94℃ - 3 min；变性：94 ℃ - 40 s；退火：60 ℃ - 50 s；延伸：72 ℃ - 1 min，从变性到延伸设置32个循环；总延伸：72 ℃ - 10 min，最后4 ℃保存。
3.根据权利要求2所述苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证构建方法，其特征在于，S2具体为采用毛细管电泳法测序和分析‘秦脆’、‘秦蜜’在不同SSR位点的等位基因片段大小，根据毛细管电泳峰图读取等位基因信息，进行基因分型。
4.苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的二维码分子身份证构建方法，其特征在于，包括权利要求3的S1 - S5，将S5中所得的字符串，利用二维码生成器生成二维码，即为苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的二维码分子身份证。
5.苹果新品种‘秦脆’和‘秦蜜’的分子特异性鉴定方法，其特征在于，包括权利要求3的S1 - S5，将‘秦脆’和‘秦蜜’的分子身份证与待鉴定苹果的分子身份证进行比对，若两者完全一致，则待鉴定苹果是‘秦脆’或‘秦蜜’品种，若不一致，则待鉴定苹果并非‘秦脆’或‘秦蜜’品种；
所述待鉴定苹果的分子身份证的获得方法是：以待鉴定苹果替代‘秦脆’和‘秦蜜’，执行权利要求3的S1 - S5。
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CN104651495A (zh) * 2015-01-16 2015-05-27 中国农业科学院郑州果树研究所 基于ssr基因型生成果树ssr分子身份证号码的方法
CN111218522A (zh) * 2020-02-20 2020-06-02 山西省农业科学院生物技术研究中心 一种用荧光ssr分子标记构建苹果新品种‘赤霞’分子身份证的方法及应用
AU2020102481A4 (en) * 2020-09-29 2020-11-12 Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences Method for Preparing Molecular ID Cards of Apple Germplasm Resource

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苹果新品种‘赤霞’和栽培品种遗传多样性分析和分子身份证构建;侯丽媛;《分子植物育种》;20200925;第18卷(第22期);第7588-7599页 *
部分苹果属种质遗传多样性分析及分子身份证构建;侯丽媛;《山西农业科学》;20200812;第48卷(第8期);第1171-1179页 *

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