CN103614456B - 鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物，以及应用该特异性引物鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的方法，是使用权利要求1所述微卫星标记特异性引物进行PCR扩增，将扩增结果进行电泳来进行鉴别的。本发明首次筛选到30个微卫星标记引物，通过基因扩增及电泳分析，将新疆各彩色棉的特异、特征引物及组合引物指纹图谱与数字信息相结合，提高了各品种与其他品种的鉴别能力，可有效为育种者提供品种知识产权及权益的保护。

Description

鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物及其应用。

背景技术

目前对棉花品种的真实性纯度的鉴定依然采用品种形态特征鉴定，精度不高，速度慢，对操作人员经验等要求高，不能适应育种工作迅速发展和种子生产经营及种植需要。目前，DNA指纹技术发展日新月异，研究较多的有RFLP、RAPD、AFLP、SSR（SimpleSequenceRepeat，微卫星DNA又叫简单重复序列）等分子标记技术，其中SSR为共显性分子标记，具有多态性丰富和PCR结果重现性高等优点。与其它遗传标记相比，SSR具有可直接检测DNA分子结构变异、反映研究材料本质差异、灵敏度高、稳定性好、操作简单等优点，在遗传多样性分析、种质鉴定、DNA指纹图谱构建、基因定位和分子标记育种等研究领域应用广泛。

分子标记鉴定技术已经成功构建了油菜、玉米、甘蔗、水稻、小麦等作物品种的DNA指纹图谱。棉花指纹图谱构建的研究已有一些报道，但有关于新疆彩色棉品种指纹图谱的构建未见报道。由于用于分子标记的引物目前还在不断开发中且分子标记引物扩增到的等位基因数目会随着建库材料的增加而增加，在有限的建库材料中进行指纹分析可能会引起引物多态性的降低，会出现一些特异的等位基因位点，但随着建库材料的增多在进行指纹分析时引物多态性可能会增高，特异或特征的基因位点就更加唯一。

特异引物是指：具有特异的等位基因位点，是该品种具有的唯一特有的等位基因位点，仅用这一对特异引物就可以直接、明显区分本品种与其它品种。特征引物是指：某个品种1对引物的指纹信息就可以区分该品种与其它品种。

本发明利用SSR分子标记技术，对我国新疆自治区截至到2012年审定的23个彩色棉新品种进行DNA指纹图谱分析，利用NTSYS-pcV2.10软件，采用Jaccard系数计算23个新彩棉品种遗传相似系数，遗传相似系数变化范围是0.3781-0.9298，平均为0.5511，表明，23个新彩棉品种间存在着丰富的遗传多样性，且各材料经严格自交纯化。利用各材料的特异引物或特征引物或组合引物，以及18对核心引物的数字指纹代码、可简便、快速、准确地鉴别品种的纯度及真实性，可为种子管理及经营单位提供快速、准确、科学的鉴定方法，为育种者保护了品种的知识产权和提供了育种理论指导。

发明内容

本发明提供一种鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物，应用该特异性引物能准确的对新疆彩色棉系列1至23号品种进行区分。

本发明提供了鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的微卫星标记特异性引物，其特征在于：

鉴别新彩棉1号品种的微卫星标记组合引物为：BNL1317、CGR6410、DPL0296；

鉴别新彩棉2号品种的微卫星标记组合引物为：DPL0528、NAU3468；

鉴别新彩棉3号品种的微卫星标记特异性引物为：CGR6932、NAU2265；

鉴别新彩棉4号品种的微卫星标记特异性引物为：DPL0376、SHIN0376、NAU2437；

鉴别新彩棉5号品种的微卫星标记组合引物为：CGR6932、TMB2295；

鉴别新彩棉6号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU1233；

鉴别新彩棉7号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU1362、NAU3995、DPL0917；

鉴别新彩棉8号品种的微卫星标记特异性引物为：MGHES44、BNL3261、BNL3255；

鉴别新彩棉9号品种的微卫星标记特异性引物为：MGHES44、HAU1001、NAU3110、NAU1042；

鉴别新彩棉10号品种的微卫星标记特异性引物为：TMB2295；

鉴别新彩棉11号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU1125；

鉴别新彩棉12号品种的微卫星标记组合引物为：BNL1317、TMB2295、BNL1421；

鉴别新彩棉13号品种的微卫星标记组合引物为：TMB2295、NAU3995、HAU1001、CGR6932；

鉴别新彩棉14号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU3110、NAU3995；

鉴别新彩棉15号品种的微卫星标记组合引物为：TMB2295、NAU3110；

鉴别新彩棉16号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU3995、CGR6410；

鉴别新彩棉17号品种的微卫星标记组合引物为：DPL0296、BNL1317；

鉴别新彩棉18号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU3468；

鉴别新彩棉19号品种的微卫星标记特异性引物为：BNL1421；

鉴别新彩棉20号品种的微卫星标记特异性引物为：HAU1001；

鉴别新彩棉21号品种的微卫星标记组合引物为：GH132、MGHES44、TMB2295；

鉴别新彩棉22号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU3995、BNL1317、GH132、NAU1233、HAU2022、BNL119、NAU2277、NAU874、NAU3100、DPL0296；

鉴别新彩棉23号品种的微卫星标记组合引物为：NAU934、NAU2437。

本发明的第二个目的是提供一种鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种的方法，是使用权利要求1所述微卫星标记特异性引物进行PCR扩增，将扩增结果进行电泳来进行鉴别的。

进一步地，所述PCR扩增的条件为：

94℃3min；

94℃50sec,

（53～63）℃45sec,

72℃1min,35个循环；

72℃10min；

4℃10min。

进一步地，所述鉴别分为应用组合引物和应用特异性引物或特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别两种；

其中，所述应用组合引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：按照组合引物中的先后顺序对新疆彩色棉系列1至23号品种DNA进行PCR扩增、电泳，对电泳结果进行分析，最终鉴别得到相对应的新疆彩色棉系列品种；

所述应用特异性引物或特征引物进行PCR扩增、电泳后对结果进行鉴别的具体方法是：应用特异性引物或特征引物对新疆彩色棉系列1至23号品种DNA进行PCR扩增、电泳，对电泳结果进行分析，找出电泳条带与其他电泳条带位置不同的，即为相对应的新疆彩色棉品种。

本发明的第三个目的是提供新疆彩色棉系列1至23号品种的18对核心引物的十进制数字指纹代码，其中，

所述18对核心引物为：NAU3995-NAU934-BNL3255-BNL1317-NAU1233-DPL0296-DPL0528-BNL1421-NAU3468-NAU2437-HAU1001-TMB2295-NAU3110-GH132-CGR6410-NAU1125-CGR6932-MGHES44，

所述新疆彩色棉系列1至23号品种在所述18对核心引物下的十进制数字指纹代码分别依次为：

。

十进制数字指纹代码是根据将新疆彩色棉系列1至23号品种用相应引物扩增、电泳后，其产生的扩增条带的二进制代码转换成十进制代码得到的。

本发明的第四个目的是提供上述的微卫星标记特异性引物在鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述十进制数字指纹代码在鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种中的应用。

本发明首次筛选到7个品种特异引物、12个彩色棉品种的特征引物及用于彩色棉指纹图谱构建的18对SSR核心引物，共计筛选到30个微卫星标记引物，通过基因扩增及电泳分析，将各彩色棉的特异、特征引物及组合引物指纹图谱与数字信息相结合，提高了各品种与其他品种的鉴别能力，可有效为育种者提供品种知识产权及权益的保护。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的阐述。

图1中，1-23分别代表表1中对应的材料：箭头所指的为标记引物HAU2786在23份新彩棉中扩增出的不同等位基因位点；

图2为SSR标记引物NAU1362在23份彩色棉品种中的扩增结果，1-23分别代表表1中对应的材料，NAU1362为新彩棉7号的特异引物；

图3为SSR标记引物HAU1001在23份彩色棉品种中的扩增结果，1-23分别代表表1中对应的材料，HAU1001为新彩棉9、20号的特异引物。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法和实验试剂，如无特殊说明，均为常规方法和常规试剂。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。“%”如无特殊说明，均为质量百分含量。

本发明以我国新疆自治区截至到2012年审定的23个彩色棉新品种为材料（表1），从定位在棉花26条染色体上的5000对SSR标记引物中筛选出多态性高、稳定性好的核心引物。共计获得7个品种特异引物（表2）、12个品种的特征引物（表3）及9个品种的组合引物（表4）。并采用最少的18对核心引物将23个彩色棉新品种一一区分开，为简便、快速、准确地鉴别各品种，提高其与其他品种的区分能力，构建出了23个品种18对核心引物的十进制数字代码（表5）。

。

。。。。

下面将具体阐述应用上述特异性引物鉴别新疆彩色棉系列1-23号品种的方法。

一、棉花DNA的提取与纯化

（1）样品（棉花品种）的纯化

首先确保样品来源准确性（从育种家或原品种的选育单位获得原种级别的样品），收集获得的材料需进一步种植观察、鉴定，依据品种特征特性选择其品种的典型单株自交，取自交种保存种质。其次取自交纯化后的样品的种子在暗培养下发芽，每个品种提取单粒种子的DNA,先进行DNA纯度电泳检测，将DNA纯度较好的样品保留，再利用多态性高的标记引物对DNA样品进行PCR扩增，将扩增产物中带型不一致的DNA样品剔除，将标记引物扩增后带型一致的样品DNA进行混合，混样后的DNA样品作为各品种分子标记构建的标准样品。

（2）样品的DNA提取与纯化；

棉花总DNA提取方法

试剂配制

抽提缓冲液(pH7.5):1L：

0.35M葡萄糖69.36g

0.1MTris-HCl12.44g

0.005MNa₂EDTA1.86g

2%(W/V)PVPK-3020g

0.1%DIECA1～2g

使用前加β-巯基乙醇至2%,调pH值至7.5。

抽提裂解液(pH8.0):1L：

0.1MTris-HCl12.44g

1.4MNaCl81.82g

0.02MNa₂EDTA7.45g

2%CTAB20g

2%(W/V)PVPK-3020g

0.1%DIECA1g

加β-巯基乙醇至2%后，调pH值至8.0。

a、提取总DNA

①研磨：将0.2g左右鲜绿的幼嫩叶片（-70℃冷冻保存）置于-20℃预冷的研钵中，加入适量液氮，迅速将其磨成细粉状，并用勺子送入-20℃预冷的2.5ml离心管。

②抽提：向步骤①得到的离心管中加入100-200μl的β-巯基乙醇，加入预冷（4℃）的抽提缓冲液0.4ml（不含β-巯基乙醇），剧烈振荡均匀，4℃下3500转/分钟（BACKMAN离心机，）离心10分钟，倒去上清。

③核裂解：将步骤②得到的沉淀物置于冰上，向其中加入5～10μl的β-巯基乙醇，加入1ml已预热(65℃)的抽提裂解液（不含β-巯基乙醇），搅拌均匀，65℃水浴30-60分钟。（每间隔10分钟左右轻轻摇动一次，使样品充分散开）。

④除蛋白：水浴完毕后，加入等体积的氯仿:异戊醇(v:v为24:1)，缓慢颠旋离心管至上下层混匀为一相，平衡后于3800rpm离心15分钟，吸取上清液至干净的离心管；重新加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），重复提取一次。

⑤沉淀DNA：在步骤④得到的上清液里加入2/3体积预冷(-20℃)的异丙醇，缓慢颠摇，直至絮状DNA析出，然后在-20℃冰箱内放置1个小时以上，使其充分沉淀紧缩。

⑥洗涤：用1ml枪头吸取(或挑出)DNA至干净的1ml离心管，用体积分数为75%乙醇浸泡洗涤2-3次，至DNA为白色，酒精清澈为止。

⑦溶解：倒去乙醇，使DNA贴着管壁自然风干至透明状时加入适当体积的TE(PH8.0)溶液溶解DNA。

b、总DNA的纯化

①除RNA：向TE溶解的DNA溶液中，加入浓度为10μg/μl的RNaseA液2μl，37℃水浴1-2小时。

②除蛋白：加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）缓慢颠倒摇匀，平衡后于3800rpm转速下离心15分钟，取上清液至干净的2.5ml离心管中，重复一次。

③沉淀DNA：在步骤②得到的上清液中加0.1倍体积的3mol/L的NaAc(pH5.2)和2倍体积的冰冷无水乙醇，缓慢混匀后置于-20℃冰箱内过夜。

④洗涤DNA：用枪头缓慢吸取(或勾出)DNA至干净的1ml离心管，加入75%乙醇浸泡3次。

⑤溶解及保存：小心倾尽乙醇，将DNA贴壁风干后按DNA量加入适当体积TE溶液溶解。待DNA充分溶解后置于-70℃(或-20℃)冰箱长期保存。

二、PCR扩增

（1）、使用的引物

鉴别新彩棉1号品种的微卫星标记组合引物为：BNL1317、CGR6410、DPL0296；

鉴别新彩棉2号品种的微卫星标记组合引物为：DPL0528、NAU3468；

鉴别新彩棉3号品种的微卫星标记特异性引物为：CGR6932、NAU2265；

鉴别新彩棉4号品种的微卫星标记特异性引物为：DPL0376、SHIN0376、NAU2437；

鉴别新彩棉5号品种的微卫星标记组合引物为：CGR6932、TMB2295；

鉴别新彩棉6号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU1233；

鉴别新彩棉7号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU1362、NAU3995、DPL0917；

鉴别新彩棉8号品种的微卫星标记特异性引物为：MGHES44、BNL3261、BNL3255；

鉴别新彩棉9号品种的微卫星标记特异性引物为：MGHES44、HAU1001、NAU3110、NAU1042；

鉴别新彩棉10号品种的微卫星标记特异性引物为：TMB2295；

鉴别新彩棉11号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU1125；

鉴别新彩棉12号品种的微卫星标记组合引物为：BNL1317、TMB2295、BNL1421；

鉴别新彩棉13号品种的微卫星标记组合引物为：TMB2295、NAU3995、HAU1001、CGR6932；

鉴别新彩棉14号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU3110、NAU3995；

鉴别新彩棉15号品种的微卫星标记组合引物为：TMB2295、NAU3110；

鉴别新彩棉16号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU3995、CGR6410；

鉴别新彩棉17号品种的微卫星标记组合引物为：DPL0296、BNL1317；

鉴别新彩棉18号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU3468；

鉴别新彩棉19号品种的微卫星标记特异性引物为：BNL1421；

鉴别新彩棉20号品种的微卫星标记特异性引物为：HAU1001；

鉴别新彩棉21号品种的微卫星标记组合引物为：GH132、MGHES44、TMB2295；

鉴别新彩棉22号品种的微卫星标记特异性引物为：NAU3995、BNL1317、GH132、NAU1233、HAU2022、BNL119、NAU2277、NAU874、NAU3100、DPL0296；

鉴别新彩棉23号品种的微卫星标记组合引物为：NAU934、NAU2437。

上述30对引物的基因序列见表6。

。

上述30对引物PCR反应时退火温度的计算方法如下：

20bp及以下的引物，Tm=4℃(G+C)+2℃(A+T)

20bp以上的引物，Tm=0.41(%ofGC)+81.5-675/Size（Size=引物长度）。

做PCR反应时设退火温度比Tm值低5℃。

因提供的引物序列都在20bp以上，所以采用20bp以上的引物PCR反应时退火温度的计算方法，Tm=0.41(%ofGC)+81.5-675/Size（Size=引物长度）计算。做PCR反应时设退火温度比Tm值低5℃。

以NAU3100引物为例计算退火温度：GCAATCAGCTCATCTTGCTT，TGACGAAAATTTGTTGGATG共40bp,其中GC共16个bp占总引物长度40bp的40%（16/40），带入20bp以上的引物退火计算公式为：Tm=0.41*40%+81.5-675/40=64.789。因此做PCR时设定的退火温度应为64.789-5=59.789℃，因PCR温度的设定精度为1℃，最终设定温度为60℃。

应用上述30对引物对新疆彩色棉系列1至23号品种进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：

DNA模板（10ng/μl）2.50μl

正向引物(25μM)0.16μl

反向引物(25μM)0.16μl

dNTP(10mM)0.25μl

Taqbuffer(10×)1.00μl

MgCl₂0.80μl

Taq酶(5U/μl)0.16μl

ddH₂O4.97μl

总体积10μl

扩增程序：

94℃3min；

94℃50sec,

（53～63）℃45sec,（依据不同引物的退火温度而定）

72℃1min,35个循环；

72℃10min；

4℃10min。

应用组合引物与特异性引物、特征性引物鉴别新疆彩色棉系列品种的方法不同：应用组合引物鉴别，需要按照文中所述的组合引物的顺序先后进行PCR扩增、电泳，分析电泳结果，不断鉴别，最终才能得到鉴别出的新疆新彩棉品种；而应用特异性引物鉴别，只需单独对新彩棉1-23号品种进行PCR扩增、电泳，分析结果，就可以鉴别出相应的新疆新彩棉品种。

三、聚丙烯凝胶电泳

（1）、相关储备液：

6%PAGE胶母液：

丙烯酰胺：57g；

N,N,-甲叉双丙烯酰胺：3g；

尿素：420g；

10×TBE：100ml。

加dH₂O水充分溶解后，定容至1L后过滤。4℃保存数周。

10%的过硫酸胺(AP)：

1g过硫酸胺溶于10ml双蒸水中。4℃保存。

反硅化液稀释液：

含有以下体积百分数的各物质：95%无水乙醇；0.5%冰醋酸；4.5%ddH₂O。4℃保存。

PAGE胶凝固剂：

每70ml6%PAGE胶母液中加入380μl浓度为10%的过硫酸胺和38μlTEMED。

上样缓冲液：

含有体积百分数为90%的去离子甲酰胺；体积百分数为10%的TBE；质量百分数为0.25%的溴酚蓝；质量百分数为0.25%的二甲苯菁。4℃保存。

5×TBE

Tris-Base：54g；

硼酸：27.5g；

EDTA：3.72g

加dH₂O水溶解定容至1000ml。

（2）、变性PAGE凝胶的制备

①用洗涤剂将两块玻璃彻底清洗干净，晾干。以面巾纸用无水酒精将玻璃板清洗一遍。

②粘胶玻璃板的处理：用面巾纸均匀的将1ml的反硅化液(每1ml反硅化液含2μl反硅化剂，即将2μl反硅化剂加入反硅化液稀释至1ml)均匀的涂抹在粘胶玻璃板上，放置3min后用无水乙醇轻轻擦洗以除去多余的反硅化液。

③不粘胶玻璃板的处理：均匀滴3～5滴硅化液于玻璃板上，迅速用面巾纸涂抹均匀。放置3min后，用无水乙醇轻轻擦洗以除去多余的硅化液。

④用酒精将边条擦拭一下后，把边条放置在小玻璃板的两边并对齐，小心的将大玻璃板扣在小玻璃板上，两边用夹子在边条上夹紧，并以15-20度的倾斜角放置。

⑤按60ml的6%丙烯酰胺凝胶母液+390μlAP+39μlTEMED的比例配制凝胶液混匀，沿玻璃棒将溶液注入两块玻璃板空隙中，直至灌满到玻璃板模具的顶部。将鲨鱼齿梳子的边缘用酒精擦净后小心的插入。

⑥凝固聚合2h以上即可电泳。

（3）、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

预电泳：

将凝固完全的PAGE胶拔掉梳子，用自来水冲洗点样孔处多余的残胶，置于电泳仪上，加入1×TBE电泳缓冲液，75W恒功率预电泳30min，玻璃板温度在45℃～55℃之间为好。

PCR产物变性：

在PCR扩增产物中，加入5μl上样缓冲液后于沸水中变性3min，取出并立即置于冰水混合物上。

电泳：

预电泳完毕后，用注射器冲洗凝胶界面，小心插入梳子，上样5μl，然后在电压36-40v，功率75-85参数下，恒压电泳至溴酚蓝条带跑出凝胶即可。

银染

电泳结束后，用自来水稍微冲洗玻璃板，使之温度下降至室温，然后小心揭开玻璃板，进行固定。

银染方法：

试剂配方：

固定液：10%冰乙酸（体积百分数）；

银染液：1%AgNO₃（质量百分数）+2%甲醛（体积百分数）；

显色液：4%甲醛（体积百分数）+1%Na₂CO₃（质量百分数）+0.05%Na₂S₂O₃（质量百分数）；

终止显色液：10%冰乙酸（体积百分数）。

染色流程：

①固定：将胶板置固定液中，摇床上固定30min；

②漂洗：ddH₂O漂洗3次，每次2min；

③银染：将胶板转入银染液，摇床上80rpm染色30min；

④漂洗：染色后在ddH₂O中漂洗，漂洗时间不超过10sec；

⑤显色：将胶板转入显色液(已经使用冰水混合物预冷30min)，缓缓摇动，直至条带出现，以marker为对照，确定显色时间。

⑥终止显色：充分显色后，转入终止显色液，10min后可将胶板取出，ddH₂O漂洗并凉干，读带。

四、鉴别新疆新彩棉系列1-23号品种。

以标记引物HAU2786为例，按照步骤一至步骤三中的方法进行操作，得到的电泳结果见图1：箭头所指的为标记引物HAU2786在1-23号新彩棉中扩增出的不同等位基因位点；其中新彩棉1、2、3、6、8、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21、23号的指纹信息为0110；新彩棉4、9号的指纹信息为1010；新彩棉5号的指纹信息为0111；新彩棉7、16号的指纹信息为0101；新彩棉14号的指纹信息为1001；新彩棉22号的指纹信息为1110。

HAU2786标记引物可以说明它可在新彩棉1-23号中扩增出不同等位基因位点及其各新彩棉品种指纹信息的读代方法，其它引物的等位基因位点的确定及指纹信息的读代方法同标记HAU2786的方法。

鉴别新疆新彩棉系列1-23号品种的方法按引物的不同，分为应用组合引物与特异性引物进行PCR扩增、电泳进行鉴别两种。

组合引物的鉴别方法如下：

以鉴别新疆彩色棉1号品种为例。

其微卫星标记组合引物为：BNL1317、CGR6410、DPL0296。

第一步将提取的新彩棉1号至新彩棉23号的DNA样品分别加入编号为1-23的PCR扩增管，按如下PCR扩增体系进行PCR扩增。

PCR扩增体系

DNA模板（10ng/μl）2.50μl；

BNL1317正向引物(25μM)0.16μl；

BNL1317反向引物(25μM)0.16μl；

dNTP(10mM)0.25μl；

Taqbuffer(10×)1.00μl；

MgCl₂0.80μl；

Taq酶(5U/μl)0.16μl；

ddH₂O4.97μl；

总体积10μl。

扩增程序

94℃3min；

94℃50sec,

60℃45sec,

72℃1min,35个循环；

72℃10min；

4℃10min。

电泳步骤

PCR扩增结束后对扩增产物进行变性处理，将PCR变性产物采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离扩增产物，电泳后分离开的扩增产物经银染显色后读取相应引物的PCR扩增条带并记录各DNA样品在相同引物下扩增产物的条带。

用BNL1317引物对新彩棉1号至新彩棉23号进行的扩增，其PCR产物的电泳结果依据扩增条带分子量大小的不同可将新彩棉1号至新彩棉23号分为5类，第一类包括新彩棉1号、2号和17号其扩增条带0110（0代表为相应位置未扩增出条带，1代表相应位置扩增出条带），第二类包括新彩棉3、5、8、9、14、16、18、21号其扩增条带1001，第三类包括新彩棉4、6、7、10、11、15号其扩增条带0101，第四类包括新彩棉12、13、19、20、23号其扩增条带1010，第五类只有新彩棉22号其扩增条带1111。这样就可将新彩棉1、2、17号先从23个彩色棉品种中先区分开。

第二步将提取的新彩棉1号、2号和17号的DNA样品分别加入编号为1、2、17的PCR扩增管，采用与第一步中相同的方法进行PCR扩增和电泳，只需将引物换CGR6410，扩增程序的温度调为60℃，其他方法及步骤与第一步相同。分析电泳结果：在用CGR6410引物扩增后，电泳结果可将新彩棉1号、2号和17号分为2类，第一类只有新彩棉2号其扩增条带10，新彩棉1号与17号其扩增条带01。这样就把新彩棉2号从这三个品种中区别开。

第三步将提取的新彩棉1号与17号的DNA样品分别加入编号为1、17的PCR扩增管，采用与第一步中相同的方法进行PCR扩增和电泳，只需将引物换DPL0296，扩增程序的温度调为61℃，其他方法及步骤与第一步相同。分析电泳结果：在用DPL0296引物扩增后，电泳结果可将新彩棉1号和17号区分开，新彩棉17号其扩增条带01，新彩棉1号扩增条带10。这样就可最终确定出新彩棉1号。

（1）特异引物的鉴别方法如下：

以新疆彩色棉3号品种为例，其微卫星标记特异性引物为：CGR6932，微卫星标记特征性引物为：NAU2265。

将提取的新彩棉1号至新彩棉23号的DNA样品分别加入编号为1-23的PCR扩增管，采用与步骤（1）中相同的方法进行PCR扩增和电泳，只需将引物换CGR6932，扩增程序的温度调为60℃，其他方法及步骤与步骤（1）中相同。分析电泳结果：在用CGR6932引物扩增后，电泳结果可将新彩棉1号至23号区分为4类，第一类为新彩棉3号其扩增条带100；第二类包含新彩棉4、17、21、23号扩增条带001；第三类包含新彩棉5、10号其扩增条带为011；第四类包含新彩棉1、2、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、18、19、20、22其扩增条带为010；这样就可最终确定出新彩棉3号，且在CGR6932引物扩增下只有新彩棉3号在1号位点具有特异扩增条带，其他品种无扩增条带。

新疆彩色棉3号品种的微卫星标记特征性引物为：NAU2265。

将提取的新彩棉1号至新彩棉23号的DNA样品分别加入编号为1-23的PCR扩增管，采用与步骤（1）中相同方法进行PCR扩增和电泳，只需将引物换NAU2265，扩增程序的温度调为60℃，其他方法及步骤与步骤（1）中相同。分析电泳结果：在用NAU2265引物扩增后，电泳结果可将新彩棉1号至23号区分为3类，第一类为新彩棉3号其扩增条带001；第二类包含新彩棉9、12、13、16、18、20、21、23号扩增条带011；第三类包含新彩棉1、2、4、5、6、7、8、10、11、14、15、17、19、22号其扩增条带为110；这样就可最终确定出新彩棉3号。

其他新疆新彩棉系列品种的鉴定方法同上，只需将鉴别引物及其对应的扩增温度进行调换，其他步骤及方法同上。

应用组合引物鉴别新疆新彩棉系列品种时，每一步筛选的条件具体如表7所示。请补充表7。

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最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.十进制数字指纹代码在鉴别新疆彩色棉系列1至23号品种中的应用；所述十进制数字指纹代码是根据将新疆彩色棉系列1至23号品种用18对核心引物扩增、电泳后，其产生的扩增条带的二进制代码转换成十进制代码得到的；

所述18对核心引物为：NAU3995-NAU934-BNL3255-BNL1317-NAU1233-DPL0296-DPL0528-BNL1421-NAU3468-NAU2437-HAU1001-TMB2295-NAU3110-GH132-CGR6410-NAU1125-CGR6932-MGHES44；

所述新疆彩色棉系列1至23号品种在所述18对核心引物下的十进制数字指纹代码分别依次为：

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