CN105483223B - 一种紫花肾茶的分子鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫花肾茶的分子鉴定方法。本发明通过筛选出SRAP引物组合，增强了鉴别近似品种肾茶的能力，经过近似品种扩增比较证明引物能有效区分不同的肾茶品种，可以对肾茶品种的分子鉴定。同时，本发明通过对肾茶遗传物质的直接鉴定，大大提高了鉴定的准确性。本发明使肾茶品种的鉴定在DNA水平上进行，避免了表现鉴定等间接鉴定方法所可能带来的误差，有操作方便、重复性好的特点，具有高度的可靠性和权威性。

Description

一种紫花肾茶的分子鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种紫花肾茶的分子鉴定方法。
背景技术
肾茶(Clerodendranthus spicatus)是唇形科肾茶属多年生草本植物，由于其雄蕊细长，酷似猫的胡须，又名猫须草。肾茶是东南亚地区十分常用的草药，我国很早便有引种，目前在我国福建、香港、海南、广东、台湾、云南、广西、四川等地均有分布。
肾茶具有明显的药用保健功能，肾茶具有利尿、排石、抗菌、消炎、健肾、改善慢性肾功能衰竭和提高免疫力等医疗保健作用。市场上已经有其提取物作为治疗慢性肾炎、利尿、排毒的保健品。由于疗效明显、毒副作用低，肾茶具有潜在的开发利用价值。
肾茶根据其花色大致可以分为白花肾茶和紫花肾茶两个类型，栽培过程中发现，总体上白花肾茶的单位面积产量高于紫花肾茶，而对其化学成分的研究中发现，紫花肾茶的一些特征性化合物含量高于白花肾茶。目前作为药用的常用类型主要为白花肾茶。
肾茶主要依据其叶片形状、花色等特征分为白花肾茶和紫花肾茶两个类型。虽然依据形态特征判断具有简单、直观的特点，但是肾茶的生长发育容易受到外部环境条件变化的影响，植株整体形态特征不稳定，另外，处于苗期或非花期，也不能从花瓣颜色来进行区分。简而言之，传统的鉴定方法(性状、显微结构及化学鉴定方法)容易受到药材生长环境、生长阶段以及产地加工等诸多因素的干扰。分子鉴定是指通过直接分析遗传物质的多态性来推断物种内在的遗传变异而实现药材鉴别的方法，分子信息量大，且不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，准确性高，客观性强。
随着人们对肾茶的日益关注和对药材质量的重视，有必要进行肾茶的栽培种源的选择、优良品种的培育以后期药材的鉴别等工作。快速准确地鉴别不同类型的肾茶是必须解决的问题。
发明内容
本发明的目的是，针对目前肾茶鉴定主要依据表现型观察方法所存在的受外部环境条件变化的影响等缺陷，提供一种可靠、准确、快速的紫花肾茶的分子鉴定方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种紫花肾茶的分子鉴定方法，按以下步骤进行：
1)取样及样品处理：
采用正常生长肾茶，分别将紫花肾茶和白花肾茶的新鲜幼叶放入冰盒，置于-80℃超低温冰箱中储存24h，在低温条件下研磨成粉末状，将其充分混匀；
2)DNA提取及其纯度和浓度检测：
取0.2g幼叶干粉，采用CTAB法提取总DNA，使用1.0％质量浓度琼脂糖凝胶电泳对所得基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度；
3)引物筛选和PCR扩增：
在对紫花肾茶进行SRAP分析的PCR扩增体系优化后，选取紫花肾茶和白花肾茶进行SRAP引物筛选，筛选出引物组合CS1(正向引物序列为：TGAGTCCAAACCGGATA，反向引物序列为：GACTGCGTACGAATTTGA)和CS2(正向引物序列为：TGAGTCCAAACCGGAAT，反向引物序列为：GACTGCGTACGAATTTGC)，在PCR仪上进行DNA扩增；
4)PCR扩增产物检测：
扩增产物用测序仪进行毛细管电泳，电泳时间60min，电压为15000V，用GeneMapper 3.2软件分析获得电泳图谱文件。
5)电泳图谱比较：
将待鉴定的肾茶按照上述步骤进行分析，得到待鉴定的肾茶SRAP电泳图谱，将此SRAP图谱与标准图谱进行比较判定，判断其是否为紫花肾茶。
进一步地，所述DNA提取的方法包括：
(1)取6mL预热到65℃的2×CTAB溶液于装有叶片粉末的离心管中，65℃水浴20分钟，其间取出混合3至5次，使粉末和溶液充分混匀；
(2)取出离心管，待冷却至室温后，加入6mL氯仿-异戊醇(体积比24∶1)，置于摇床上充分混匀5分钟；
(3)室温12000rpm离心10分钟；
(4)将上清液转入新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷无水乙醇，混匀，在-20℃冰箱中静置5分钟；
(5)室温12000rpm离心10分钟；
(6)弃上清液，DNA沉淀风干后，溶解于800μL去离子水中，作为PCR的模板DNA，-20℃保存备用。
进一步地，所述的DNA浓度大于10mg/mL，OD260/280的比值在1.8-2.0之间，OD260/230的比值在2.0-2.5之间。
进一步地，对肾茶进行SRAP分析的PCR扩增体系优化主要是对DNA模板量进行优化。
进一步地，所述的DNA模板量为25ng。
进一步地，所述的PCR扩增的方法为采用20μL反应体系进行PCR扩增，反应体系总体积为20μL，含10μL Taq Plus MasterMix[天根生化科技(北京)有限公司]，5mM正向引物、5mM反向引物，25ng DNA。
进一步地，所述的PCR扩增的反应程序为：首先94℃预变性5min；其次94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；然后94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃后延伸10min。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过筛选出SRAP引物组合，增强了鉴别近似品种肾茶的能力，经过近似品种扩增比较证明引物能有效区分不同的肾茶品种，可以对肾茶品种的分子鉴定。
(2)本发明通过对肾茶遗传物质的直接鉴定，大大提高了鉴定的准确性。本发明使肾茶品种的鉴定在DNA水平上进行，避免了表现鉴定等间接鉴定方法所可能带来的误差，有操作方便、重复性好的特点，具有高度的可靠性和权威性。
附图说明
图1为白花肾茶用CS1引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图2为白花肾茶用CS1引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图3为紫花肾茶用CS1引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图4为紫花肾茶用CS1引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图5为白花肾茶用CS2引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图6为白花肾茶用CS2引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图7为紫花肾茶用CS2引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图8为紫花肾茶用CS2引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图9为实施例中待测物用CS1引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
图10为实施例中待测物用CS2引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
1、材料
供试材料共4份，2013年分别引种于福建、广东、海南和云南。其中紫花肾茶2份，白花肾茶2份。见表1。
引物购自上海生工生物工程公司，Taq Plus MasterMix购自天根生化科技(北京)有限公司。
表1 肾茶类型及其来源
Figure GDA0000931144290000051
Figure GDA0000931144290000061
2、取样及样品处理
采用正常生长的肾茶，每个种源10株，每株5片新鲜幼叶放入冰盒，置于-80℃超低温冰箱储存。
3、DNA提取及其纯度和浓度检测
在液氮中将肾茶幼叶研磨成粉末，整个过程需保证肾茶粉末所处温度低于0℃，取0.2g，采用CTAB提取缓冲液法提取总DNA，用1.0％质量浓度琼脂糖对所获基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度。
2×CTAB的配制方法：
Figure GDA0000931144290000062
DNA提取方法：
(1)取6mL预热到65℃的2×CTAB溶液于装有叶片粉末的离心管中，65℃水浴20分钟，其间取出混合3至5次，使粉末和溶液充分混匀；
(2)取出离心管，待冷却至室温(20±5℃)后，加入6mL氯仿-异戊醇(体积比24∶1)，置于摇床上充分混匀5分钟；
(3)室温(20±5℃)12000rpm离心10分钟；
(4)将上清液转入新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷无水乙醇，混匀，在-20℃冰箱中静置5分钟；
(5)室温(20±5℃)12000rpm离心10分钟；
(6)弃上清液，DNA沉淀风干后，溶解于800μL去离子水中，作为PCR的模板DNA，-20℃保存备用。
使用1.0％质量浓度琼脂糖对所获基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度。使用Thermo公司Nanodrop2000微量分光光度计直接测得DNA浓度，OD260/280的比值在1.8-2.0之间，OD260/230的比值在2.0-2.5之间，DNA浓度大于10mg/mL。
4、引物筛选和SRAP分析
对肾茶进行SRAP分析的PCR扩增体系优化——对DNA模板量从5ng，10ng，25ng，75ng，100ng进行优化，最终选择25ng。然后，选取4个(表1)不同来源的肾茶进行SRAP引物筛选，引物信息见表2。
从得到的DNA指纹图谱中，筛选出2个扩增带清晰、多态性明显、重复性好的引物组合CS1(正向引物Me1序列为：TGAGTCCAAACCGGATA，反向引物Em4序列为：GACTGCGTACGAATTTGA)和CS2(正向引物Me3序列为：TGAGTCCAAACCGGAAT，反向引物Em2序列为：GACTGCGTACGAATTTGC)，在PCR仪上进行DNA扩增。
表2、引物编号及序列
Figure GDA0000931144290000081
4个不同来源肾茶采用CS1和CS2引物组合，在Biometra Tprofessional standardPCR仪上进行DNA扩增。采用20μL反应体系进行PCR扩增，反应体系总体积为20μL，含10μLTaq Plus MasterMix[天根生化科技(北京)有限公司]，5mM正向引物、5mM反向引物，25ngDNA。
PCR反应程序为：
首先94℃预变性5min；其次94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；然后94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃后延伸10min。
扩增产物用ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳，电泳时间60min，电压为15000V，用GeneMapper 3.2软件分析获得图谱文件。
结果与鉴定
1、不同来源的SRAP指纹图谱
每组引物扩增产生了一种特有SRAP指纹图谱，如图1、图2、图3、图4、图9和图5、图6、图7、图8、图10分别是用CS1和CS2引物组合扩增的SRAP指纹图谱。
由4个来源肾茶的SRAP标准图谱，可以看到CS1和CS2引物组合分别扩增出的特有DNA指纹，4个来源肾茶扩增图谱可以分为两个类型，与其花色类型的划分相吻合。
2、将待鉴别的肾茶按照上述步骤进行操作，得到所需要鉴定肾茶的SRAP图谱，如图1和图2为CS1引物组合以白花肾茶为样本的扩增图谱，图3和图4为CS1引物组合以紫花肾茶为样本的扩增图谱；图5和图6为CS2引物组合以白花肾茶为样本的扩增图谱，图7和图8为CS2引物组合以紫花肾茶为样本的扩增图谱。将待鉴定的肾茶SRAP图谱与标准图谱比较判定，可以判断是否为紫色肾茶品种。
实施例：待鉴定肾茶样本采自云南省元江县，用CS1和CS2引物组合对样本DNA进行PCR扩增，得到的SRAP指纹图谱(具体步骤同前面所述)如图9和图10。经过SRAP指纹图谱鉴定比较，判断待鉴别肾茶的CS1(图9)和CS2(图10)图谱分别与白花肾茶的DNA图谱中图1和图2，图5和图6基本一致，确定该待鉴别肾茶为白花肾茶。

Claims (4)

1.一种紫花肾茶的分子鉴定方法，其特征在于按以下步骤进行：
1)取样及样品处理：采用正常生长肾茶，分别将紫花肾茶和白花肾茶的新鲜幼叶放入冰盒，置于-80℃超低温冰箱中储存24h，在低温条件下研磨成粉末状；
2)DNA提取及其纯度和浓度检测：取0.2g幼叶干粉，采用CTAB法提取总DNA，使用1.0％质量浓度琼脂糖凝胶电泳对所得基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度；
3)引物筛选和PCR扩增：在对紫花肾茶进行SRAP分析的PCR扩增体系优化后，选取紫花肾茶和白花肾茶进行SRAP引物筛选，筛选出引物组合CS1和CS2，在PCR仪上进行DNA扩增，所述CS1引物为：正向引物序列为：TGAGTCCAAACCGGATA，如SEQ ID NO.1所示；反向引物序列为：GACTGCGTACGAATTTGA，如SEQ ID NO.2所示；所述CS2引物为：正向引物序列：TGAGTCCAAACCGGAAT，如SEQ ID NO.3所示；反向引物序列：GACTGCGTACGAATTTGC，如SEQ IDNO.4所示；
4)PCR扩增产物检测：扩增产物用测序仪进行毛细管电泳，电泳时间60min，电压为15000V，用GeneMapper 3.2软件分析获得电泳图谱文件；
5)电泳图谱比较：将待鉴定的肾茶按照步骤1)-4)的操作顺序及方法进行分析，得到待鉴定的肾茶SRAP电泳图谱，将此SRAP图谱与步骤4)获得的电泳图谱文件进行比较判定，判断其是否为紫花肾茶。
2.根据权利要求1所述的一种紫花肾茶的分子鉴定方法，其特征在于：采用CTAB法提取总DNA的具体过程包括：
(1)取6mL预热到65℃的2×CTAB溶液于装有叶片粉末的离心管中，65℃水浴20分钟，期间取出混合3至5次，使粉末和溶液充分混匀；
(2)取出离心管，待冷却至室温后，加入6mL氯仿-异戊醇，且氯仿与异戊醇的体积比为24：1，置于摇床上充分混匀5分钟；
(3)室温12000rpm离心10分钟；
(4)将上清液转入新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷无水乙醇，混匀，在-20℃冰箱中静置5分钟；
(5)室温12000rpm离心10分钟；
(6)弃上清液，DNA沉淀风干后，溶解于800μL去离子水中，作为PCR的模板DNA，-20℃保存备用。
3.根据权利要求1或2所述的一种紫花肾茶的分子鉴定方法，其特征在于：所述的DNA浓度大于10mg/mL，OD260/280的比值在1.8-2.0之间，OD260/230的比值在2.0-2.5之间。
4.根据权利要求1所述的一种紫花肾茶的分子鉴定方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应程序为：首先94℃预变性5min；其次94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；然后94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃后延伸10min。
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