CN101654707B

CN101654707B - 多花黄精微卫星标记

Info

Publication number: CN101654707B
Application number: CN2009101450423A
Authority: CN
Inventors: 朱国萍; 程文娟; 刘婷婷; 彭艳秋; 王晖; 王宗达; 陈露露
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2009-09-21
Filing date: 2009-09-21
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2029-09-21
Also published as: CN101654707A

Abstract

本发明公开了多花黄精微卫星标记，包括多花黄精微卫星(CT)n富集文库的构建；含微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到55个含有微卫星重复序列的克隆；筛选得到14个多态性高的微卫星分子标记Pc1、Pc2、Pc3、Pc4、Pc5、Pc6、Pc7、Pc8、Pc9、Pc10、Pc11、Pc12、Pc13、Pc14；本发明14个微卫星标记能用于研究多花黄精的遗传多样性，黄精属植物种间和居群间的变异和进化关系及多花黄精品种的鉴定，具有重复性好的特点，是一种可靠有效的分子标记。

Description

多花黄精微卫星标记

技术领域

本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种多花黄精微卫星分子遗传标记。

背景技术

微卫星DNA又称作短串连重复(Short Tandem Repeats，STRs)、简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSRs)、简单序列长度多态性(SSLP)。是指基因组中以1～6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。根据重复单元的构成，微卫星DNA序列被分为3种类型：单一型，复合型(compound)和间断型(interrupted)。例如：

单一型：ATATATATATATATATATATATAT

复合型：ATATATCACACACACACACAC

间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA

微卫星DNA作为一种分子标记具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中；核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，多态性信息容量高：呈共显性，遵循孟德尔法则遗传；选择中性等等。

基于以上特点，微卫星DNA被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定和种质保存、数量性状基因的分析、辅助育种、构建指纹图谱、遗传多样性及物种进化与亲缘关系等方面的研究。

多花黄精为百合科黄精属多年生草本植物，是我国特有植物，药用其根茎。2005年版《中国药典》中以黄精，多花黄精和滇黄精的干燥根茎作为黄精药材入药。黄精的使用历史至今己逾两千年，是著名的食疗补益中药。其肉质根状茎具有补气养阴、健脾润肺、益肾生津等功效，被视为传统的中药材，并誉有“血气双补之土”之称。另外多花黄精还具有食用和观赏价值。

近年来，人们对黄精及其黄精属植物的研究不断深入。现代药理研究证实，其化学成分主要有：黄精多糖、粘液质、淀粉、甾体皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、木脂素、维生素和多种对人体有用的氨基酸等化合物。目前有研究表明黄精多糖能增强机体的免疫、延缓衰老、抗菌、抗病毒和降脂、降糖作用。李循等研究发现黄精多糖能活化巨噬细胞、活化淋巴细胞、提高NK细胞和LAK细胞的活性、促进有丝分裂作用、增强网状内皮系统、促进细胞因子分泌、增强红细胞免疫等作用而提高宿主免疫功能。而张庭亭通过研究小鼠发现PSP可提高7月龄小鼠全血中SOD以及GSH-Px的活性，降低小鼠心、肝、脑组织中LF和MDA含量；说明黄精多糖在一定程度上有抗衰老作用的。辜红梅等通过研究发现黄精多糖能显著提高病毒感染的Vero细胞的活力，对细胞有保护作用。黄精甾体皂苷具有去痰止咳之功效，还具有抗炎、抗肿瘤、抗真菌等作用。

中药上的黄精包括黄精，多花黄精，滇黄精。黄精属植物还有其他的一些药用植物，如玉竹，长梗黄精等，但它们与黄精在药理和药效上是存在差异的，有些不能混用。如黄精和玉竹在临床上就是不能混用的，入药时需将它们区分开来。

黄精的分子标记研究起步很晚，目前报道的只是RAPD分子标记，ISSR分子标记(周晔，RAPD标记法鉴定中药黄精及长梗黄精的研究；周晔，ISSR法鉴定中药黄精和卷叶黄精)，微卫星标记尚未见报道。但RAPD分子标记稳定性，重复性差，ISSR分子标记通常为显性标记，不能区分纯和基因型和杂合基因型。

发明内容

本发明解决的技术问题：分离克隆多花黄精的微卫星DNA分子标记，建立多花黄精微卫星DNA技术体系并用这些分子标记研究多花黄精遗传多样性，黄精属植物种间和居群间的变异和进化关系以及进行多花黄精品种鉴定。

实现上述发明的技术方案：包括多花黄精微卫星(CT)n富集文库的构建；含微卫星序列阳性克隆的筛选及测序，得到55个含有微卫星重复序列的克隆；筛选得到14个多态性高的微卫星分子标记Pc1、Pc2、Pc3、Pc4、Pc5、Pc6、Pc7、Pc8、Pc9、Pc10、Pc11、Pc12、Pc13、Pc14；Pc1为480个核苷酸，Pc2为550个核苷酸，Pc3为310个核苷酸，Pc4为338个核苷酸，Pc5为630个核苷酸，Pc6为767个核苷酸，Pc7为435个核苷酸，Pc8为584个核苷酸，Pc9为399个核苷酸，Pc10为595个核苷酸，Pc11为677个核苷酸，Pc12为512个核苷酸，Pc13为488个核苷酸，Pc14为473个核苷酸。

附图说明

图1：Pc1位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图2：Pc2位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图3：Pc3位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图4：Pc4位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图5：Pc5位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图6：Pc6位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图7：Pc7位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图8：Pc8位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图9：Pc9位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图10：Pc10位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图11：Pc11位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图12：Pc12位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图13：Pc13位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

图14：Pc14位点的特异性引物扩增23个多花黄精的DNA的银染PAGE图。

具体实施方式

实施例1：

1、多花黄精微卫星DNA富集文库的构建

1.1基因组的提取与酶切：

用Doyle J介绍的CTAB法(Doyle J.DNA protocols for plants-CTAB totalDNA isolation[A].In Hewitt GM，Johnston A(eds.)，Molecular Techniquesin Taxonomy[M].Berlin：Springer，1991，283-293)提取基因组，用限制性内切酶Sau3AI(购自TaKaRa公司)酶切基因组，酶切产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下300-900bp大小的DNA片段并用胶回收试剂盒(购自上海生工)纯化回收的酶切产物。

1.2加接头：

将纯化回收的酶切产物的两端加入接头：

LA(5’-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3’)

LB(5’-PO₄-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3’)，

在T4连接酶(购自Promega公司)作用下16℃水浴连接过夜。

1.3PCR检测接头连接：

以LA为引物，以1.2工序制的连接产物为模板进行PCR，(50μl反应体系如下：25μl TaqGreen(购自Promega公司)，5μl引物LA，5μl连接产物，加水H₂O补至50μl。PCR反应程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，56℃退火一分钟，72℃延伸2分钟，变性至退火三个步骤重复25次，72℃充分延伸10分钟。PCR产物用纯化试剂盒(购于Axygen公司)进行纯化。

1.4磁珠富集：

将1.3所制的纯化产物与杂交探针(CT)₁₅在70℃下杂交一个半小时。将杂交液加入已平衡好的磁珠，室温放置30分钟。将离心管依次用6×SSC，2×SSC，1×SSC于60℃洗两次，最后用0.1×SSC室温洗一次。加入TE缓冲液，在PCR机上95℃变性15分钟，收集上清。

1.5PCR富集：

以磁珠富集产物为模板，LA为引物进行PCR扩增，25μl反应体系如下：

TaqGreen 12.5μl，LA 1.5μl，富集后的DNA2.5μl，加水补至25μl。PCR反应程序如下：94℃预变性3分钟，94℃变性35秒，60℃退火35秒，72℃延伸1分钟，变性至退火三个步骤重复25次，72℃充分延伸12分钟。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。

1.6感受态细胞的制备：

将1mL过夜培养的E.coli DH5α培养液接于50mL液体LB培养基中，37℃振荡培养2小时至对数生长期(OD₆₀₀≈0.3-0.6)时取出。将菌液于4℃离心10分钟。弃上清，加入1mL 0.1mol/L预冷的Cacl₂重新悬浮细胞，用枪头轻轻打匀。4℃离心10分钟。弃上清，加入预冷的甘油/CaCl₂混合物重新悬浮菌体，用枪头打匀，-80℃保存。

1.7倒平板：

将LB固体培养基完全融化，冷却至50℃左右，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培养基(比例为：LB固体培养基100mL；Amp青霉素100μl；20％异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)7μl；2％5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)40μl)，混合均匀后倒入一只培养皿里，待培养基凝固后放入37℃烘箱，晾干水蒸气。

1.8连接转化：

取1.5工序所制的PCR富集后的纯化产物加入pMD19-T载体(购自TaKaRa公司)于16℃水浴连接2小时，制成连接产物。

取出感受态细胞，冰上复苏至液态，加入上述连接产物，混匀。冰浴30分钟后放入42℃水浴锅，热激90秒，立即放入冰中冰浴2分钟，加入新鲜的LB培养基，37℃振荡培养1-1.5小时。取70μl培养液涂布于LB/Amp/X-gal/IPTG培养基上，37℃倒置培养过夜。

2.阳性克隆的筛选：

将平板上的白色单菌落分别放入事先装有LB/Amp培养基的EP管中。37℃振荡培养至菌液浑浊。15μl PCR反应体系包括：Taq酶0.075U(购自TaKaRa公司)，10×Buffer1.5μl，dNTP0.2μM，mg²⁺1.5μM，引物0.4μM(LA，primer-c(CT₁₅))，水。反应程序：94℃预变性3分钟，94℃变性50秒，56℃退火35秒，72℃延伸1分钟，变性至延伸三个步骤重复30次。最后72℃充分延伸12分钟，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

3.阳性克隆测序及引物设计：阳性克隆送生物公司测序，共得到84条含有微卫星DNA的序列。根据微卫星DNA两侧的序列，利用软件primerprimer5设计引物，如表1所示。

实施例2：

2.1筛选有多态性的引物：

用1.1的CTAB法提取长梗黄精基因组。用设计的引物(表1)扩增基因组。反应程序：94℃预变性4分钟，94℃变性45秒，退火30秒(退火温度见表1)，72℃延伸35秒，变性至退火三个步骤重复35次。最后72℃充分延伸8分钟。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用PAGE电泳进行检测，共得到14个有多态性的微卫星标记；Pc1为480个核苷酸，Pc2为550个核苷酸，Pc3为310个核苷酸，Pc4为338个核苷酸，Pc5为630个核苷酸，Pc6为767个核苷酸，Pc7为435个核苷酸，Pc8为584个核苷酸，Pc9为399个核苷酸，Pc10为595个核苷酸，Pc11为677个核苷酸，Pc12为512个核苷酸，Pc13为488个核苷酸，Pc14为473个核苷酸。

2.2结果分析：

使用Cervus3.0软件计算期望杂合度和观察杂合度。使用Genepop3.4软件计算哈代-温伯格以及连锁不平衡的值，以此来描述14个多花黄精微卫星DNA多态位点的特征。

由附图1-14可看出，本发明的14个微卫星序列的长度在供试的23个多花黄精中都出现的多样性，由此可见，本发明的这14个微卫星标记能用于研究多花黄精的遗传多样性，黄精属植物种间和居群间的变异和进化关系及多花黄精品种的鉴定，具有重复性好的特点，是一种可靠有效的分子标记。

表1中F表示5’端引物，R表示.3’端引物。

序列表

<110>安微师范大学

<120>多花黄精微卫星标记

<130>1

<160>14

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>480

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>1

gatcgggcct cccttttctc cacgaacaag aaagagaaaa agagggaggt aaagaaaaat 60

aaaggagaag gagagaagac aagtctgacc ccttctcaag ttgataaaga aagggggaga 120

gaagagagaa ttagagagga gagtagacaa gctacctgat cctctcggcg gagatcaaga 180

aggaaagaag gaaatgagag aaatggagag gagataaccc tctcctatcg gcagcaacta 240

agaacagaga aggagaaaga gagagaaagt ggggggggga gagagagaga gagagagaga 300

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gaaatgaatc atctctccct 360

ctcggctggg gatcaaaaga gagggaatga ttgaggggga gaaagaaaat tctccccccc 420

cctcactcaa caattaatgc ggcaaggaca tgcatggtgt aaggatggag gaagtgaaga 480

<210>2

<211>550

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>2

gaccgccctt gataagaaaa tcgtatagcg ataagaagta ctcgcttcct tcttgagggt 60

gttgatgata aaggcccaaa gccaatatct ttcaaaaaag cccaagctca agtcttcatt 120

ttttgctcct tggcttgtga ggatgaaagc ctaaggcttt ggaatgagct cttgctctac 180

ctccttgctt cttctctttt cttcttgttg ctcttgcttg caaatgagag agagagagag 240

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 300

agagagagag agagagagag agggagatgg ggtttggtga catgtgaggt aaggttaagt 360

agagggaaag gtgtgactga tgccatgtgg caatgattga atccataagg attatgatga 420

agctaaatgg ctaaagaaga tggttttaag gagatgatgc caagtgacct tgaatgtgta 480

gagattgagg ggatgttgcc atgtgttgga tgatggctaa atgatatgga atatctcatc 540

caacggttga 550

<210>3

<211>310

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>3

gatcacccct tgaatcactc tctactcact ccaatcaaaa ccctctcatc catttgtctc 60

actctcattt ttcctcttcc attctcaaga gagctagcat gacctaagca agagagagag 120

agagagagag atagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 180

agagagagag agagagagag agagagagag aggagcaaga acaagagagt gaaggagcaa 240

gagaaggaga attatgcctt gaacatttaa agcctttggc tttggaaagc ttcatcaaca 300

ccctcaagaa 310

<210>4

<211>338

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>4

gatctgcaaa agctctaggg agctgaactc aagcttgaag cttagagagg aggaaatgga 60

gatgagtgat gcaaggtagg agaggagctc tgccttctct tcttgctggt tcaagagaga 120

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagggaga gagagagaga gagagagaga 180

gagagagaga gagagagaga tgtggtgttg ggctcaataa atgaaggggg aaggctcatt 240

aaatgcaagg gggctgacaa gacataaagt tggctcaatg ccatgtctca tttataagaa 300

atgagacaag caccagatga atcaacagat tcaaggga 338

<210>5

<211>630

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>5

gatcagaaga agaatttcaa gaagattgtt tgtttgcaat taagcttaaa tttcctacaa 60

tttctccttc ttattcttct tgcttacatc ttgattggac acccgaagaa atacaagagg 120

atgtaccgat gtctccgaag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 180

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagac gttagttcta gtactaccac 240

aagagatagt cactttgaga ggaatccccc ggaggatgtg aaggaggcaa ttgggccaaa 300

gaaagatttg gaagttattg aagagtttgg tgccaaagaa gaagaaaaag gaaactaaga 360

ctatggccaa gcactactag aaaatctgca tataacatcg cctctaagaa atcagtttaa 420

tatgcgcctg atgtaatagg cgtacgagac attgattgtg aaaataaccg atgttatgta 480

tcatttataa catcagttgc taaattaatc gattttaaaa gtaaaattaa aaaactacgg 540

gaaccccaaa aggggaaaaa acaagaagcg ctaaaaagtt cccccctttt ttatttactt 600

agccgctcct tctcccctct cctctctcag 630

<210>6

<211>767

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>6

gagctccccc tcggctgcta atagacagag aaaaagagat agagaaaaaa atgagaaaat 60

gagagaaaga gagagataga gagagggagg acctctcggc tgccagtagc aagacaagag 120

agagagggaa tgagtgttta tgacatataa ttggaagggt ggcatgctat ctcccctcac 180

ttgcattaaa tgcagtctca tcacattaat gaggagagag agagagagag agagagagag 240

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 300

agagagagac agacagacag acagacagag acatacaaga atgagacgaa tatagaacta 360

attgagggaa aaccctaata ttagataatt tagcagaatg agggtccggc accagataat 420

caaatacaat aatataggaa taaataaaca gtacccctca tatacgtgca taaatacgta 480

taccgggaac tgaaggttac aatcctaccc aacttataaa aaacttgtcc ttaaaatttc 540

gataaagagg atagacgtaa caagaagatc aagcatgcaa gataatgcaa gaacgataac 600

tatgatggag tgaacaagcg ataaatcaaa aagaaaagaa caactaccag actacggaac 660

aaatgagggg tacttctgac ggatctgatc atctaactcc catgttgaat ctcctagtga 720

ctgcatatcc actgcaccct gaccactttt gacaatcata tccctga 767

<210>7

<211>435

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>7

aatcacaaac gtgcaaacaa ttgcacatcc cctctcttgc ccccgagaat ttgcaaaatt 60

ccatccgtat cccctctcgc cttcttcctc ccgattccgt tgcccccttt ataaatgcgc 120

cctttacttc agttgacaaa cctctccctt tcccaatccc gttccgttac gtttaaatta 180

gcggtcgctc tctccctccc tccctctctc tctctctctc tccctctctc tctctctctc 240

tctctctctc tctctctcta tatatataaa gtctctgatc gaaatctagg gtttcgattc 300

cgattgctct gggttttcgt ttttctcgtt ccggggttgg gattagggct tccaacgccg 360

gaggagttgg ggttagggtt ttgcgactac gagatgttgg ggacgagcct tcagtttggg 420

cgggggaacg gcgac 435

<210>8

<211>584

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>8

gatcttgtat tccaagctct ctcaagctga aatcatctat cagcctgtga gcatcttttg 60

taattttgtc ccagttcccg gtatacgtat ttgtgcacat atatatgggg tactgtatat 120

ttatttctgt attattgcct ttgattatct ggtatcggac cctaatttac cggaatattg 180

gggttttact tcaataattc tcatttctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 240

ctctctctct ctttctctct ctccattaat gtgatgagat tgcatttaat gcaagtaagg 300

gggagagagc atgacaccct ctaatcatat gacataaacc ctcattctct ccctctctct 360

tgtcctccct agcaaccaag agtctttttc ccactccctt tctctactat tctctcattt 420

cctctttctc tgtcactctc tccttctctt tctcattctc agagcaagca cctgaggggg 480

gtgattaatt tcttccccct cctttcattt gcatcacctt actccctaat ccatcatgag 540

ggaacttctt gagttccttc ctctttgtca agcaacttta gaag 584

<210>9

<211>399

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>9

gatcttgttt tggaccggga tagggcaata tatcgccaag tggccgatat atcactcaag 60

atatatcggt gaaaatctcg gccgatatct aatgctatca ggcttttttc ttttaatttt 120

tcaaaccagt taagtcttca gacccgtcaa cccgtacctg atacgttaat atataatgtt 180

aagagacgag ttagggttcg ctatcgagcc cctctctctc tctctctctc tctctctctc 240

tctctctctc tctctctcac ggcgatcagg ttagggttcg aaattaatga aaattcttga 300

aattgatcga caaaaagggg tcaattagac atgggttatt caattcgagg tggactttga 360

ttgaatctgg gaaaaagtta agagcttggc aaggatttg 399

<210>10

<211>595

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>10

gatctagttg ttgtctttaa taaattgaat gaactcggac attaagtcta ggtaagtgga 60

aattaatcac aacccaacaa caagctataa aagcttagaa aatgaacatg aagttcagag 120

agtcatggag agcctcagga ttgagagtcc aagagctcac tgctcaaaga gcaagaaaag 180

ggcactcgcc tgagaagtga cagcaaagct taaaagagct agaatctcaa gctttaagct 240

tagagagaga actccaatag agggagagct tcaagggaag aagaagctcc aagctttctc 300

ttgctcttgc tggtgagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 360

gagagagaga gagagagaga gaggtgagca attatgaagg ggagggggtc acattaaatg 420

aggagttgct caaggaggag agagggggat gactagataa gggcatgtct ctaataaata 480

gaaacaagac aaaaaggaaa acagatgaat catcagactc aagcaagagg aacggtaata 540

agcacagtta actccacaga gaggattaca agcagggaaa ttcaatacag aatag 595

<210>11

<211>677

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>11

gatctctagc tccaaagctt ggtccttttc ctcttcttgc tgctcttctt cttctttgct 60

tgcttgagca aaaaggagag atagaatgag atggatgaag agaatgggag agggtggaga 120

agtgttggag ttaaacatgg aagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 240

gatgcattaa atgcaagcat ggggatgatg gttgttttct tggaatggga gaagtgtgtt 300

gaagtgaaag tccattacat gacaaaagag atgtcatacc aaatgaatgg ttaggattaa 360

gttgttttgg atggtgagat tggtttgcaa gaataagatt caaaatggac atatgattta 420

agttgcaatg aatcagaaaa caatataata cgtgcgaagc acatattaca agatgtgggg 480

gttacatttt tcgcaaacac ttgagcgaaa agctctgtcc cgagaggact cagccttcgg 540

ccttgtggcg ggacttcgct tgtggagaaa ttacctttgt agacttctcc tctagagaag 600

ctcccttctg gcggatcttg gctctggcga gattcctttg ctgcggatct cgcctctggc 660

gggattccct cttgtgg 677

<210>12

<211>512

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>12

gatcaagaca ccaggaaatg aggtcatcag tgaaagcatc atgtagccag aagacactgt 60

ttatatcaac ttttcatttt cctctttgca taggaattat tttaattgtc ttctttaacg 120

cacgcgcacc cagaccgaga aacacaccac atacacacaa tatatacaca tgcagacata 180

ctgacgcgtg cacacacgcg cgaggagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 240

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gacctcagca caggccagga acatttttgc 300

gagagcctgt ttcgttgagc ttgagacaga ctttgtaagc ccaaagtcga gcaaaattgg 360

gcggtgtggg tgttccttgc ctacaagaaa atttcctaca tgaaagataa accgaaaatg 420

aatccccaac tcaaagttgt acgatcacta atgtgaaaat acactttagt atactctcga 480

agaacggcca aaagcaagca taccaggatg ag 512

<210>13

<211>488

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>13

gattaagggt tctctaatta gagttcccaa ggagagtttc aagcttaagg aagctgagaa 60

agaagaggca ttcgcctagg ttgatctgca aaagctctag ggagctgaac tcaagcatga 120

agcttagagt ggaagaaatg gagtagagat caaagggttg aagaagagga agttctgcct 180

tcacttcaag ctggttcaag agagagagag agagggagag agagagagag agagagagag 240

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagatga 300

ggagttgggc tcaataaatg agggggactc attaattgag agaaggggct gacaagacat 360

aaagttagcc ttaccatatc tcatttatga gaaatgagac aagcaccaga tgaatcaaca 420

gattcaaggg agatctctct atattagata caggtaaagc tacagagagg aattcaaact 480

agggttat 488

<210>14

<211>473

<212>DNA

<213>多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)

<400>14

gatctttgct ctcggcctgg tgaaggaaaa agagagagaa ttaggggaaa ggaaacatgg 60

gggatatttg gcaatgattt gaggggagag catggcatct cccctccaac attaaatgct 120

ctctatactc atttaatgaa gggggggagg gagagagaga gagagagaga gagagagaga 180

gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 240

gaaacacaat aatggaagag aattctccta ctagcagata ttaaagcaga tagtgggccc 300

aacactatat aaatacctgc aactctacag aataaacaca cagtacccca tatatacgta 360

cacaaatacg tatactggga accggaggtt acactttctt tactatgccc cgctggtatg 420

ccttttctca tgcctttaca aacatgtagg cataatttct aggatagagt gga 473

Claims

1.用于多花黄精微卫星标记的引物，其特征在于：所述的引物序列为：

R 5’-CTC TCC TAT CGG CAG CAA CT-3’

F 5’-ACT TCC TCC ATC CTT ACA CCA T-3’。